0 引言
【研究意义】龙眼(Dimocarpus longan lour.)作为中国重要的药食同源食材,其果肉的养血安神、益智宁心、补益心脾等功效在《神农本草经》《本草纲目》等中国古代医药书上早有记载[1]。虽然药用历史已有上千年,但龙眼补益心智的功效缺少科学依据支撑,其活性成分仍不明确。记忆力损伤和认知障碍是阿尔茨海默病（Alzheimer Disease,AD）的主要临床表现,这种中枢神经系统退行性疾病主要发生在老年期,严重危害老年人的身心健康。长期食用龙眼有改善记忆、防治AD的功效。因此,通过动物试验探讨龙眼果肉醇提物和水提物对记忆获得性障碍小鼠学习记忆能力的影响,初步分析龙眼果肉醇提物和水提物主要活性成分及含量,对进一步明确龙眼果肉益智机制及物质基础具有重要意义。【前人研究进展】目前国内外关于天然植物改善AD已有许多研究,脑内乙酰胆碱水平下降是AD主要伴随症状之一[2],因此有效提高乙酰胆碱可以改善AD。RABIEI等[3]发现百香果醇提物可以缩短东莨菪碱诱导记忆障碍大鼠在避暗试验中的潜伏期,通过调节乙酰胆碱相关酶类改善其记忆能力。李富仁等[4]研究发现远志茯苓醇提物能够通过抑制乙酰胆碱酯酶活力改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力。YANG等[5]研究表明金针菇多糖通过调节海马和大脑皮层中乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）活性来修复东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠脑中乙酰胆碱水平,从而改善记忆能力。此外,氧化应激在AD发病机制中也起着重要的作用,是自由基氧化和抗氧化系统失衡所致[6],因此,抗氧化也是改善AD有效途径之一。FOYET等[7]发现E. coccinae（菊科）叶甲醇-水提取物可以提高东莨菪碱诱导记忆障碍大鼠空间记忆能力及脑组织内抗氧化能力。王丹等[8]的研究表明远志水提取物能通过增强小鼠自由基清除能力提高正常小鼠学习记忆能力。龙眼改善记忆的功能在古代医书上早有记载,而采用现代科学技术手段研究其作用机制从近些年才开始。PARK等[9]发现龙眼果肉水提物显著延长小鼠在避暗试验中的潜伏期,增加了海马中脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor,BDNF）表达及未成熟神经细胞的生成,对其他作用机制如胆碱能系统、抗氧化系统并未涉及。骆萍等[10]研究发现龙眼果肉水提物、醇提物均可以显著改善大鼠在Morris水迷宫中的空间记忆能力,并从抗氧化系统角度对其作用机制进行探究,发现龙眼果肉提取物可显著提高脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）酶活,减少丙二醛（MDA）生成,且有一定剂量效应关系,表明龙眼果肉提取物可通过增强机体抗氧化能力达到改善记忆功能,但其未对提取物的化学成分作进一步分析。【本研究切入点】关于龙眼果肉的生物活性的研究,目前国内外主要集中于免疫调节、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等[11-16],对其改善学习记忆功能的研究较少,其活性成分及作用机制仍不明确、不完善。【拟解决的关键问题】本研究对龙眼果肉醇提物和水提物主要化学成分进行分析,选用急性腹腔注射东莨菪碱建立记忆损伤小鼠模型,比较不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对痴呆小鼠学习记忆能力的改善作用,分析其对血清抗氧化系统及脑内胆碱能系统、抗氧化系统的影响,为揭示龙眼改善学习记忆功能及作用机制提供依据。1 材料与方法
试验于2014年3—9月在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室进行。1.1 材料与供试动物
1.1.1 材料、药品与试剂 龙眼果干（含水量为12.40%）,由广东省农业科学院果树研究所提供,品种为‘储良’;氢溴酸东莨菪碱注射液（scopolamine hydrobromide injection）购于徐州莱恩药业有限公司产品;丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）和总蛋白质（total protein,TP）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、香草酸、芦丁、鞣花酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸、香豆酸及鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖标准品均购自美国Sigma公司,甲酸、乙酸、乙腈为色谱纯试剂,购于美国Fisher公司。95%乙醇（分析纯）购于天津市大茂化学试剂厂,其余试剂均为分析纯。1.1.2 实验动物 SPF级雄性KM小鼠,体重20—25 g,由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK（粤）2011-0015。饲养环境：室温（23±2）℃,相对湿度50%—60%,12/12 h 明暗交替,自由饮食、摄水。小鼠于试验前7 d置于实验室适应环境。
1.2 主要仪器
避暗系统（上海欣软信息科技有限公司）,SB-5200TD超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）,FDU-2110真空冷冻干燥机（东京理化器械株式会社）,EYELA CA-2600旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）,UV1800 型紫外可见分光光度计（日本岛津有限公司）,多功能荧光分析仪 Fluoroskan Ascent FL（美国Thermo Fisher Scientific公司）,HZQQX 型全温振荡器（哈尔滨东联电子开发有限公司）,冷冻离心机（美国Thermo Electron公司）,DS-1 高速组织捣碎机（上海标本模型厂）、Agilent Technologies 1260 Series、6890N-5975B GC-MS （美国Agilent公司）。1.3 龙眼果肉提取物的制备
1.3.1 龙眼果肉醇提物的制备 取一定量的龙眼干果肉,按1﹕4（m/v）加入95%乙醇打浆,室温浸泡1 h,超声提取30 min,如此反复2次,离心（4 000 r/min,10 min）收集上清液,滤渣重复提取1次,合并上清液。55℃减压浓缩至无乙醇蒸出,此浓缩浸膏即为龙眼果肉醇提物（含水量为10.86%）。1.3.2 龙眼果肉水提物的制备 在1.3.1离心后的沉淀物中以1﹕20（m/v）加入蒸馏水,按1.3.1的方法提取,收集上清液。将滤渣用1﹕5的蒸馏水复提一次,合并上清液,减压浓缩后加95%乙醇沉降（终浓度为80%）,4℃冷藏过夜,离心收集沉淀物用无水乙醇洗涤3次,冷冻干燥得龙眼果肉水提物。
1.4 龙眼果肉提取物主要活性成分含量分析
分别对龙眼果肉醇提物和水提物的主要活性成分含量进行如下分析：总糖含量通过苯酚-硫酸法测定,采用葡萄糖做标准品[17]。还原糖用DNS法测定,采用葡萄糖做标准品[18]。多糖总量为总糖质量分数与还原糖质量分数的差值。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定,以牛血清蛋白作为标准品。总酚通过福林酚法测定,没食子酸作为标准品[19]。总黄酮通过三氯化铝法测定,以儿茶素为标准品[20]。总磷脂含量采用钼蓝比色法测定,以磷酸二氢钾溶液作为标准品[21]。单糖组成通过GC-MS测定[22]。酚类组成通过HPLC测定[23]。1.5 动物分组及处理
将72只小鼠随机分成6组,每组12只,分别为：空白组、模型组、龙眼果肉醇提物低剂量组（150 mg·kg-1）、龙眼果肉醇提物高剂量组（300 mg·kg-1）、龙眼果肉水提物低剂量组（150 mg·kg-1）、龙眼果肉水提物高剂量组（300 mg·kg-1）。各剂量以提取物干基计,参照龙眼干果肉每日摄取量（9—15 g）[24]基于人-动物剂量转换公式[25]得到,并参考文献[9]做一定调整。各组均按10 mL∙kg-1∙b.w.-1灌胃给药（空白组和模型组灌胃生理盐水）,每天一次,连续28 d。在最后一次给药1 h后,除空白组腹腔注射生理盐水外,其他组均腹腔注射东莨菪碱（3 mg∙kg-1∙b.w.-1）制备小鼠学习记忆障碍模型,并于注射20 min后进行避暗试验。1.6 避暗试验
方法参考DONG等[26]进行并做一些改进,该试验分为习得测试（Acquisition trial）和记忆保持测试（Retention trial）两部分。小鼠灌胃第26天起,连续2 d在同一时间将小鼠放入避暗仪中适应5 min。第28天腹腔注射东莨菪碱20 min后开始习得测试,将小鼠背对拱门放入明箱后,给暗室不锈钢栅栏通以0.3 mA电流持续5 min,由于小鼠具有趋暗的习性会由明室向暗室探索,小鼠一进入暗室即受电击,其正确反应是回到明室,记录小鼠第1次进入暗室的时间即为避暗潜伏期（step-through latency）,步入潜伏期大于5 min者弃去不用,5 min 内小鼠进入暗室的次数即为穿梭次数（shuttle number）,作为习得成绩;24 h后对小鼠进行记忆保持测试,记录小鼠5 min内的潜伏期及进入暗室的次数（即穿梭次数）,作为记忆成绩,5 min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300 s计,穿梭次数计0次。
1.7 小鼠血浆、脑组织内生化指标检测
行为学试验结束后,乙醚麻醉小鼠,摘眼球取血,全血离心后取血清;脱颈椎处死小鼠,迅速于冰上断头取脑,加9倍体积（m/V）的冰生理盐水进行匀浆,4℃离心（3 000 r/min,10 min）,取上清液,即为10%组织匀浆。分别按照试剂盒表明书测定脑组织匀浆中ChAT和AChE活力,脑组织匀浆和血清中SOD、GSH-Px活力及MDA含量,采用考马斯亮兰法测定组织蛋白含量。1.8 数据统计与分析
用SPSS19.0软件进行试验数据统计分析,组间差异比较采用单因子方差分析（one way ANOVA）,显著性用LSD法及Dunnett’s 检验（P<0.05）,所有数据采用平均数±标准差（$\overline{x}$±sd）表示。2 结果
2.1 龙眼果肉提取物主要活性成分含量分析
龙眼果肉醇提物和水提物中主要活性成分含量见表1。由表1可知,龙眼果肉水提物以多糖和蛋白为主,总比例超过干物质质量的60%,其中多糖含量达到45.46%,而醇提物则含有较高的多糖和还原糖,总占比高达68.5%,其中还原糖含量占比高达35.21%。龙眼果肉醇提物和水提物的单糖组成成分相同,主要为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,但其组成比例存在显著差异（P<0.05）。龙眼果肉醇提物单糖组成中葡萄糖含量最高,高达69.55%,水提物的单糖组成主要是阿拉伯糖和半乳糖,占比分别为43.29%、34.81%。磷脂含量方面,龙眼果肉醇提物约为水提物的4倍。与龙眼果肉水提物相比,醇提物中抗氧化物质含量更高,总酚、总黄酮含量分别约为水提物的2倍、3.6倍。其中,醇提物酚类组成丰富,含有12种酚类物质,鞣花酸含量最高;水提物酚酸组成相对简单,含有5种酚类物质,表儿茶素含量最高。Table 1
表1
表1龙眼果肉提取物中主要活性成分含量（均以干基计,$\overline{x}$±sd, n=3）
Table 1Content of the main bioactive components in the extract of longan pulp (All based on dry basis, $\overline{x}$±sd, n=3)
| 主要成分 Basis | 龙眼果肉醇提物 Ethanol extract of longan pulp | 龙眼果肉水提物 Aqueous extract of longan pulp |
|---|---|---|
| 总蛋白Total protein (%) | 1.12±0.01a | 16.56±2.03b |
| 总磷脂 Total phospholipids (mg·g-1 ) | 10.89±0.02b | 2.52±0.08a |
| 还原糖 Reducing sugars (%) | 35.21±0.04b | 3.00±0.05a |
| 多糖 Polysaccharides (%) | 33.34±0.98a | 45.46±1.06b |
| 单糖组成Monosaccharide composition (%) | ||
| 鼠李糖 Rhamnose | 1.09±0.02a | 5.22±0.02b |
| 阿拉伯糖 Arabinose | 14.15±0.01a | 43.29±0.03b |
| 木糖 Xylose | 1.47±0.02a | 3.64±0.05b |
| 甘露糖 Mannose | 3.11±0.02a | 3.49±0.08b |
| 葡萄糖 Glucose | 69.55±0.10b | 9.55±0.03a |
| 半乳糖 Galactose | 11.14±0.03a | 34.81±0.04b |
| 总黄酮 Total flavonoids (mg CE·g-1 ) | 1.53±0.02b | 0.42±0.01a |
| 总酚Total phenol (mg GAE·g-1) | 9.52±0.16b | 4.82±0.19a |
| 酚类组成Phenols composition (mg/100 g) | ||
| 没食子酸Gallic acid | 10.51±0.47b | 0.87±0.35a |
| 原儿茶酸 Protocatechuic acid | 6.27±0.73 | — |
| 绿原酸Chlorogenic acid | 2.22±0.04a | 4.77±0.08b |
| 儿茶素Catechin | 11.13±0.54b | 0.19±0.02a |
| 表儿茶素Epicatechin | 4.81±0.35a | 8.24±0.14b |
| 香草酸Vanillic acid | 0.65±0.03 | — |
| 芦丁Rutin | 4.81±0.35 | — |
| 鞣花酸Gallogen | 135.51±14.02b | 5.8±0.43a |
| 阿魏酸Ferulaic acid | 0.59±0.07 | — |
| 异阿魏酸Isoferulic acid | 0.26±0.02 | — |
| 水杨酸Salicylic acid | 4.49±0.12 | — |
| 香豆酸Coumaric acid | 1.16±0.04 | — |
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2.2 小鼠避暗试验行为表现
不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对东莨菪碱致衰小鼠在避暗试验中学习记忆能力的影响见图1。在习得测试时,各组间潜伏期与穿梭次数均无显著性差异（P>0.05）。在记忆保持测试时,与空白组相比,模型组潜伏期由300 s缩短至130.83 s,穿梭次数显著增加至2.44次（P<0.05）,表明腹腔注射东莨菪碱使小鼠产生学习记忆障碍。与模型组相比,龙眼果肉各剂量醇提物和水提物组潜伏期均显著延长（P<0.05）,穿梭次数减少（P<0.05）,且同一提取物的高剂量组比低剂量组效果显著,醇提物和水提物高剂量组的潜伏期分别为289.18 s、290.80 s,穿梭次数分别为0.75、0.65,与空白组相比均无显著差异（P>0.05）,表明龙眼果肉醇提物与水提物均有改善痴呆小鼠学习记忆的能力,高剂量组处理小鼠的记忆能力已基本恢复到正常小鼠水平。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1龙眼果肉提取物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠避暗实验行为表现的影响（$\overline{x}$±sd,n=12）A：潜伏期 Step-through latency;B：穿梭次数 Shuttle number。图中同组测试中不同小写英文字母代表差异显著,即P<0.05。下同
-->Fig. 1Effect of the dementia mice on memory performances using the passive avoidance task by treatment of extract of longan pulp ($\overline{x}$±sd, n=12)Values different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below
-->
2.3 小鼠脑组织中ChAT和AChE活性
不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠脑组织中ChAT和AChE活性的影响,见图2。模型组ChAT活性显著降低（P<0.05）,AChE活性增高（P<0.05）,表明东莨菪碱损伤小鼠胆碱能系统。与模型组相比,龙眼果肉水提物和醇提物各组ChAT活性显著增高（P<0.05）,且相同剂量下,水提物组ChAT活性（低剂量组：106.34 U·g-1 OWW;高剂量组133.61 U·g-1 OWW）显著高于醇提物组（低剂量组：79.40 U·g-1 OWW;高剂量组99.53 U·g-1 OWW）（P<0.05）,其中水提物高剂量组ChAT活性显著高于空白组（98.70 U·g-1 OWW）（P<0.05）,表明龙眼果肉醇提物与水提物均可提高致衰小鼠的ChAT活性,且高剂量水提物效果更好。龙眼果肉醇提物和水提物低、高剂量组AChE活性分别为0.30、0.29、0.27、0.26 U·mg-1 prot,与模型组相比均有不同程度降低且存在统计学差异（P<0.05）,但与空白组相比,仍未恢复正常水平（P>0.05）。这提示龙眼果肉改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用机制可能是通过提高中枢神经ChAT活性,降低AChE活性,从而提高Ach的浓度实现的。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2龙眼果肉提取物东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠脑组织ChAT和AChE活性的影响（$\overline{x}$±sd, n=12）
-->Fig.2Effect of extract of longan pulp on ChAT and AChE activities in the dementia mice brain ($\overline{x}$±sd, n=12)
-->
2.4 小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量
通过测定小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性及MDA含量,考察不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠抗氧化水平的影响,如表2所示。与空白组相比,模型组小鼠脑组织SOD和GSH-Px活力显著降低,MDA含量增加（P<0.05）,表明东莨菪碱损伤小鼠清除自由基能力;与模型组相比,龙眼果肉醇提物和水提物各剂量组脑组织SOD和GSH-Px活力均增高,MDA含量均降低（P <0.05）,表明龙眼果肉醇提物和水提物均能不同程度地提高机体清除自由基能力;另外,与空白组相比,除水提物组的GSH-Px活力外,其余龙眼果肉醇提物和水提物组在MDA、SOD及GSH-Px均恢复正常水平（P>0.05）。相同剂量时,与龙眼果肉水提物比,醇提物组的MDA含量显著降低,SOD、GSH-Px活性显著升高,尤其是GSH-Px活性,低剂量和高剂量组分别升高了35.40%和21.50%（P<0.05）,表明龙眼果肉醇提物能够更好地增强东莨菪碱致衰小鼠脑组织中抗氧化酶活力,减少氧化产物含量,从而减轻组织过氧化损伤。Table 2
表2
表2龙眼果肉提取物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠脑组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响
Table 2Effects of extract of longan pulp on MDA , SOD and GSH-Px in the dementia mice brain ($\overline{x}$±sd, n=12)
| 组别 Groups | 空白对照组 Control | 模型组 Model | 龙眼果肉醇提物组 Ethanol extract of longan pulp | 龙眼果肉水提物组 Aqueous extract of longan pulp | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 剂量 Dosage (mg·kg-1∙b.w.-1) | — | — | 150 | 300 | 150 | 300 |
| 丙二醛 MDA (nmol·mg-1 prot) | 12.63±0.84b | 15.38±1.08a | 11.80±0.89bc | 11.27±1.02c | 12.74±0.78b | 12.60±0.90b |
| 超氧化物歧化酶 SOD (U·mg-1 prot) | 67.77±1.34c | 59.20±3.53d | 89.72±4.60a | 92.53±2.08a | 82.51±5.29b | 94.28±2.52a |
| 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px (U·mg-1 prot) | 63.77±3.32a | 29.50±2.74c | 63.41±1.77a | 61.94±4.05a | 46.83±4.33b | 50.98±2.77b |
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2.5 小鼠血清 SOD、GSH-Px活性及MDA含量
通过测定小鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量,考察不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠抗氧化水平的影响,如表3所示。与空白组相比,模型组血清SOD和GSH-Px活力显著降低,MDA含量显著增加（P<0.05）,表明东莨菪碱可以降低小鼠血液中的抗自由基能力;与模型组相比,龙眼果肉水提物和醇提物各剂量组血清SOD和GSH-Px活力均增高,MDA含量均降低（P<0.05）,龙眼果肉醇提物组效果更优,表明龙眼果肉醇提物和水提物均可增强东莨菪碱致痴呆小鼠血液的自由基清除能力,从而对修复神经损伤有一定作用。Table 3
表3
表3龙眼果肉提取物对东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响
Table 3Effects of extract of longan pulp on MDA, SOD and GSH-Px in the dementia mice serum ($\overline{x}$±sd, n=12)
| 组别 Groups | 空白对照组 Control | 模型组 Model | 龙眼果肉醇提物组 Ethanol extract of longan pulp | 龙眼果肉水提物组 Aqueous extract of longan pulp | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 剂量 Dosage (mg·kg-1∙b.w.-1) | — | — | 150 | 300 | 150 | 300 |
| 丙二醛 MDA (nmol·mg-1 prot) | 3.15±0.47b | 5.31±0.67a | 3.21±0.21b | 3.02±0.53b | 3.64±0.38b | 3.62±0.25b |
| 超氧化物歧化酶 SOD (U·mg-1 prot) | 98.42±5.46c | 81.59±0.75d | 132.70±2.89a | 123.94±1.83b | 94.75±4.98c | 128.11±4.54b |
| 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px (U·mg-1 prot) | 1046.86±77.34a | 604.49±32.54d | 1100.00±67.92a | 817.31±18.80c | 976.73±84.56ab | 900.71±31.56b |
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3 讨论
避暗试验是检测记忆能力改善效果最常用的方法之一。PARK等[9]研究发现,在避暗试验中不同剂量龙眼果肉水提物可以延长小鼠记忆测试的潜伏期,200 mg·kg-1灌胃组效果最佳,与阳性对照比拉西坦组无显著差异（P>0.05）,但习得测试时各组的潜伏期无显著差异。本研究发现,腹腔注射东莨菪碱显著降低小鼠在避暗试验中记忆测试潜伏期,而给予龙眼果肉醇提物和水提物有明显的改善作用,其中300 mg·kg-1水提物组效果最为显著,与上述研究现象一致。马宇昕等[27]用石菖蒲不同提取部位对β淀粉样蛋白致学习记忆障碍模型小鼠进行水迷宫测试,结果表明石菖蒲挥发油、水提液和去油水煎液都具有改善记忆障碍模型小鼠学习记忆的能力,以挥发油灌胃组逃避潜伏期最短,但与其他两组无显著差异。对于人参的研究也呈现出相似的结果,JIN等[28]发现原人参二醇/原人参三醇比例为1.24时可以显著改善东莨菪碱诱导获得性障碍小鼠在避暗试验和水迷宫中的空间记忆能力,但对正常小鼠并无记忆提高效果,LYUBIMOV等[29]发现人参多糖也有改善大鼠学习记忆的功效。这表明同一天然产物中可能存在多种具有改善学习记忆功能的物质。骆萍[10]用Morris水迷宫试验研究了龙眼果肉提取物对东莨菪碱处理大鼠空间学习记忆能力的改善作用,发现龙眼果肉醇提物和水提物均可显著减少痴呆大鼠在Morris水迷宫中首次穿台时间,增加穿台次数。本研究结果表明,龙眼果肉醇提物和龙眼果肉水提物均能显著延长东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠在避暗试验中的潜伏期、减少穿梭次数,改善小鼠记忆能力,且存在一定的剂量效应关系,从急性应激角度阐述了龙眼果肉提取物对记忆的改善作用,与上述研究结果一致。大脑记忆功能衰退会伴随着乙酰胆碱水平下降,神经元损伤,增加炎症和氧化应激[6]。其中,乙酰胆碱（ACh）水平下降是AD患者主要伴随症状之一[2]。ACh由胆碱在ChAT的催化下合成,AChE可以水解ACh为胆碱和醋酸,一定程度上,ChAT活性可以反应ACh的含量。东莨菪碱是一种毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂,可对大脑皮层和海马胆碱能系统突触上面的ACh受体进行阻断,降低大脑皮层和海马中ACh含量,作用于记忆的获得环节,引起模型短时程记忆损害[30]。AChE抑制剂是目前应用最广泛的治疗AD药物。其中天然产物中香豆素类、黄酮类、芪类、生物碱类[2,31-32]等AChE抑制剂已作为一类AD治疗药物资源的代表。本研究中,龙眼果肉醇提物与水提物可以降低AChE活力,提高ChAT活力,可以推测其主要通过有效调节乙酰胆碱水平达到改善学习记忆的作用,表明龙眼果肉可以作为治疗AD药物潜在资源之一。研究发现,金针菇多糖可以上调结合素36和p-CaMK II的表达,调节海马和大脑皮层中ChAT和AChE酶活修复东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠乙酰胆碱水平,从而改善记忆能力[5]。周苗苗等[33]发现鱿鱼卵磷脂可以通过影响中枢胆碱能神经系统,改善东莨菪碱所致痴呆小鼠学习记忆能力,大豆磷脂也表现出类似效果[34]。远志茯苓醇提物可以显著抑制东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶活性高达57.66%,从而发挥改善学习记忆作用[4]。本试验分析龙眼果肉醇提物和水提物的主要活性物质组成发现,龙眼果肉水提物中主要为多糖和蛋白质,含有少量多酚和黄酮,与前人研究结果相似[13],推测其调节胆碱功能的物质基础为多糖或多糖-蛋白复合物;龙眼果肉醇提物除含有较高水平糖类外,黄酮、磷脂类物质含量比水提物高,推测其通过多糖黄酮、磷脂等共作用来调节胆碱功能,确切的物质基础需要进一步研究。
氧化应激是记忆损伤早期发生的病变,是AD另一症状[35]。当脑组织中枢胆碱能神经退化时,会引起机体抗氧化酶活性不断下降,进而引发体内自由基异常堆积,造成氧化应激[36]。脂质丰富的大脑易受到线粒体产生的ROS攻击[37],氧化应激与线粒体功能失调有密切联系,线粒体功能失调会增加脑内淀粉样蛋白水平,进而形成AD[38]。东莨菪碱通过干扰乙酰胆碱水平在脑内引起氧化应激,导致认知障碍[39]。已有研究表明,记忆损伤与脑内脂质堆积增加,MDA含量增加,SOD、GSH-Px活力降低密切相关[40-42]。本研究发现,不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物均可不同程度提高脑及血清中SOD、GSH-Px酶活,降低MDA含量,其中300 mg·kg-1龙眼醇提物效果最好,因此,可以推测龙眼果肉醇提物和水提物可以通过改善体内的氧化应激状态来提高机体学习记忆能力。逯爱梅等[43]研究发现香菇多糖可以显著增强东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠脑中的SOD和GSH-Px活力,降低MDA含量,从而改善小鼠学习记忆能力。XIAO等[44]发现共饲小鼠莲房原花青素与乳酸菌,可提高东莨菪碱致衰小鼠脑中的SOD、GSH-Px、T-AOC等抗氧化酶活减轻脑组织氧化损伤,改善小鼠学习记忆能力。E. coccinae（菊科）叶甲醇-水提取物各剂量组均能提高东莨菪碱诱导记忆障碍大鼠提高脑内总抗氧化能力,增强SOD、GSH-Px酶活,降低血清中NO含量[6],改善其记忆能力。JYOTI等[45]研究表明印度天胡荽甲醇提取物可以提高大鼠海马区神经抗氧化能力,修复神经元损伤,进一步对其活性物质的组成进行研究,发现该提取物含有丰富单宁和总酚,呈现出良好的抗氧化能力[46]。由以上可见,天然产物水提物与醇提物都可能通过良好的抗氧化效果保护脑组织氧化应激损伤进而改善其学习记忆能力,其主要活性物质基础为多糖、原花青素、多酚等。KUNWORARATH[47]等研究结果表明龙眼果肉水提物有良好的体内抗氧化效果。骆萍[10]研究发现,分别用乙醇、水提取得到的龙眼果肉醇提物和水提物均可提高痴呆大鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活,减少MDA生成,且低剂量（6 g·kg-1）效果更优,但其主要作用物质并不清楚。本试验所采用的样品为依次经过乙醇、水提取得到的醇提物和水提物,相对成分更纯,试验剂量（150 mg·kg-1、300 mg·kg-1）参照龙眼干果肉每日摄取量（9—15 g）并基于人-动物剂量转换公式得到,且表现出较好效果,故本研究的数据更适合用于指导龙眼的日常生活消费。所以,龙眼果肉醇提物效果更好,可能是因为其总酚、总黄酮含量较水提物高,这些物质有更好的抗氧化、抗炎作用[48]。而且,与水提物相比,醇提物酚类组成更为丰富,含有12种酚类物质,其含量也相对更高,其中鞣花酸含量最高,高达135.51 mg·100g-1 DW。以上结果表明,龙眼果肉醇提物和水提物通过提高机体清除自由基的能力,降低脂质过氧化损伤程度,减轻自由基对脑组织的损害,保护脑组织,从而发挥抗衰老的作用,预防和改善学习记忆障碍。
4 结论
龙眼果肉醇提物与水提物均能显著改善东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠的学习记忆能力,二者的作用机制不尽相同。前者改善学习记忆机制主要通过提高机体清除自由基的能力,降低脂质过氧化损伤程度,减轻自由基对脑组织的氧化损伤;后者则主要通过增强脑组织乙酰胆碱转移酶（ChAT）活力,降低乙酰胆碱酯酶（AChE）活力,从而增加神经递质乙酰胆碱的释放,加快神经信号的传导。究其原因,可能与二者中活性物质的种类和含量差异有关,龙眼果肉醇提物主要作用物质可能为酚类、黄酮、磷脂等,而水提物则可能为多糖或糖蛋白,龙眼果肉改善学习记忆功能可能与二者的共同作用有关。本研究结果为揭示龙眼果肉的记忆功能提供了重要信息。The authors have declared that no competing interests exist.
