基于代谢组学分析丝瓜果肉褐变过程酚酸类物质变化

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本站小编 Free考研考试/2021-12-26

王雅慧^,¹^,², 刘晓宏¹, 雍明丽¹, 熊爱生², 苏小俊^,¹

¹江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,南京 210014

²南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京 210095

Analysis of Changes in Phenolic Acids of Luffa cylindrica Pulp During Browning Based on Metabolomics

WANG YaHui^,¹^,², LIU XiaoHong¹, YONG MingLi¹, XIONG AiSheng², SU XiaoJun^,¹

¹Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

²College of Horticulture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Nanjing 210095

通讯作者: 苏小俊,E-mail： xiaojunsu@jaas.ac.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2021-01-28接受日期:2021-03-24

基金资助:

苏州市农业科技创新项目(农业关键技术应用研究)(SNG2018061)

江苏省高校优势学科(PAPD)

Received:2021-01-28Accepted:2021-03-24
作者简介 About authors
王雅慧,E-mail： 2019204036@njau.edu.cn。

摘要
【目的】褐变是影响丝瓜商品价值的主要因素,酚酸类物质代谢是导致褐变的主要原因。研究丝瓜褐变过程酚酸类物质变化有助于深入了解丝瓜褐变的生理机制,为丝瓜的贮藏和加工、品种选育和种质资源利用提供依据。【方法】以耐褐变丝瓜品种‘2D-2’和易褐变丝瓜品种‘35D-7’为试验材料,测定其鲜切后放置不同时间的褐变程度、总酚含量和多酚氧化酶活性,并借助超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用的方法对沸水浴褐变前后的丝瓜果肉样品进行代谢组学分析。【结果】鲜切褐变处理后,2个品种丝瓜果肉中的多酚含量及多酚氧化酶活性均有所增加。与‘2D-2’相比,丝瓜品种‘35D-7’的褐变程度较重,放置24 h后的总酚含量约为‘2D-2’的3倍以上;多酚氧化酶活性在放置12 h时最高,达174.23 U·g^-1·min^-1。通过代谢组学对易褐变丝瓜品种‘35D-7’酶促褐变反应底物及褐变前后的差异代谢物进行分析,经检测共获得420种代谢物,其中229种为差异代谢物。经褐变处理后,140种差异代谢物含量显著下降,89种升高。KEGG通路富集分析结果表明,苯丙素类生物合成、脯氨酸代谢和类黄酮生物合成等代谢途径中的代谢物含量发生了显著变化。代谢组定性定量分析结果发现,供试样品丝瓜果肉中鉴定出的酚酸类物质中对香豆酸含量最高,其次是松柏苷和龙胆酸。经褐变处理后,共有35种差异代谢物被鉴定为酚酸类代谢物。其中,松柏醛、3-氨基水杨酸和咖啡酸苯乙酯的含量下降最明显。相反地,紫丁香苷、2,5-二羟基苯甲酸O-己糖苷和异绿原酸A的含量显著提高,log2变化倍数达10以上。【结论】易褐变丝瓜品种‘35D-7’果肉中的主要酚类物质为对香豆酸,参与丝瓜‘35D-7’果肉褐变过程的主要酚酸类代谢物有松柏醛、紫丁香苷和异绿原酸A等。
关键词： 丝瓜;果肉;酶促褐变;代谢组;酚酸

Abstract

【Objective】Browning is the main element affecting the commercial value of Luffa cylindrica. The principal consideration of browning is linked to the metabolism of phenolic acids. Studying the changes of phenolic acid during the browning process of Luffa is helpful to understand the physiological mechanism of browning, so as to provide the basis for the storage and processing, breed selection and utilization of germplasm resources of Luffa. 【Method】Browning-resistant Luffa cultivar 2D-2 and browning-prone cultivar 35D-7 were used as experiment materials. Their browning degree, total phenol content and polyphenol oxidase activity after fresh cutting for different time were measured. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) was utilized to analyze the metabolomic of Luffa pulp before and after browning in boiling water bath. 【Result】 After fresh-cut browning treatment, the content of polyphenols and the polyphenol oxidase activity in the flesh of both two Luffa cultivars were increased. Luffa 35D-7 had severer browning degree. The total phenol content after 24 h storage was much more than 3 times of that of 2D-2, and the polyphenol oxidase activity achieved the top at 12 h, reaching 174.23 U·g^-1·min^-1. Based on metabolomics, the substrate of enzymatic browning reaction and the difference of metabolites in browning-prone Luffa 35D-7 before and after browning were analyzed. A total of 420 metabolites were detected, 229 of which were differential metabolites. After browning, the contents of 140 kinds of differential metabolites were substantially decreased, while 89 kinds were increased. KEGG pathway enrichment analysis demonstrated that metabolites related to phenylpropanoid biosynthesis, proline metabolism and flavonoid biosynthesis displayed significant changes. The results of qualitative and quantitative analysis of metabolomics suggested the content of p-coumaric acid was the highest in the phenolic acids identified in the flesh of the tested Luffa, followed by coniferin and gentisic acid. After browning treatment, 35 different metabolites were classified as phenolic acid metabolites. Among them, the content of coniferaldehyde, 3-aminosalicylic acid and phenethyl caffeate decreased most obviously, while the content of syringin, 2,5-dihydroxy benzoic acid O-hexside and isochlorogenic acid A increased significantly, and the log2 fold change was more than 10. 【Conclusion】The main phenolic substances in the flesh of 35D-7 were p-coumaric, and the main phenolic acid metabolites involved in the browning process of 35D-7 were coniferaldehyde, syringin and isochlorogenic acid A etc. The results could help further reveal the physiological mechanism of Luffa browning and provide basis for the improvement of Luffa variety.

Keywords：Luffa;pulp;enzymatic browning;metabolomics;phenolic acids

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王雅慧, 刘晓宏, 雍明丽, 熊爱生, 苏小俊. 基于代谢组学分析丝瓜果肉褐变过程酚酸类物质变化. 中国农业科学, 2021, 54(22): 4869-4879 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.013
WANG YaHui, LIU XiaoHong, YONG MingLi, XIONG AiSheng, SU XiaoJun. Analysis of Changes in Phenolic Acids of Luffa cylindrica Pulp During Browning Based on Metabolomics. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(22): 4869-4879 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.013

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0 引言

【研究意义】丝瓜（Luffa cylindrica）是葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（Luffa Mill.）一年生瓜类蔬菜作物。褐变是贮藏、加工和运输过程中影响丝瓜商品价值的一大障碍,探究丝瓜褐变生理及分子机制是开展丝瓜育种的重要研究方向^[1]。开展丝瓜褐变过程代谢物变化研究,有助于深入了解丝瓜褐变过程的生理机制,进一步为丝瓜的品种改良提供依据。【前人研究进展】按照机理的差异,褐变可以分为两类：由氧化酶催化酚类物质形成醌类化合物引起的酶促褐变和无氧化酶参与的非酶促褐变^[2]。丝瓜的褐变主要由酶促褐变造成,当丝瓜的细胞结构被破坏,细胞内的酚类物质、氧化酶及氧气3个条件同时存在,便会发生酶促褐变反应^[3]。目前我国****已经对耐褐变丝瓜种质进行了筛选,并在丝瓜褐变的生理机制方面进行了初步的探究^[4,5,6]。研究证明,丝瓜果实的多酚氧化酶活性、总酚类化合物含量与丝瓜褐化速率具有直接关系^[7]。随着组学的发展,****们开始从分子生物学层面上探究丝瓜褐变的机理^[8,9]。借助转录组学分析,PPO、PAL、POD等氧化酶基因对丝瓜褐变的调控作用逐步被鉴定^[10,11]。利用代谢组学方法,LEE等^[12]发现‘Braeburn’苹果果实内部褐变与乙醛、乙醇和乙酯的增加有关。研究人员还基于代谢组分析发现了马铃薯中的内源型抗褐变化合物,证实了黄嘌呤对褐变的抑制作用^[13]。【本研究切入点】不同植物中酚类物质的组成和含量存在一定差异,作为酶促褐变的底物,酚类物质的特性对褐变具有重要影响。温文旭等^[14]利用超高效液相色谱法基于14种酚类化合物标准品对丝瓜酚类物质进行了鉴定,发现龙胆酸是丝瓜中的主要酚类物质,但受标准品的限制,所检测到的酚类物质种类有限。广泛靶向代谢组具有高通量、超灵敏、广覆盖的特点,可以一次性定性定量检测大量代谢物,目前已被广泛应用于代谢通路分析。借助代谢组学方法,有助于更好地分析丝瓜褐变过程的代谢物变化,探寻丝瓜褐变的发生机制。【拟解决的关键问题】本研究选用两个具有不同抗褐变能力的丝瓜品种,对其褐变水平进行测定,并采用超高效液相色谱质谱联用的方法对易褐变丝瓜品种褐变处理前后果肉中的代谢组学进行分析,旨在鉴定丝瓜褐变过程中差异代谢物及相关代谢通路,为进一步揭示丝瓜褐变的生理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

以易褐变的短棒肉丝瓜‘35D-7’及耐褐变的早熟丝瓜品种‘2D-2’为试验材料,2020年2月21日于20℃温水中浸种8 h后,次日于电热温床穴盘中育苗。2020年3月20日,将幼苗定植于江苏省农业科学院六合科研基地（江苏省南京市六合区竹镇镇金磁社区）6 m塑料大棚内,大棚按2.5 m宽分成东西两畦,定植前3 d提前铺地膜。丝瓜采用吊蔓栽培,2020年5月20日进行授粉,授粉后10 d的丝瓜果实用于后续试验。选取生长状态一致的丝瓜果实,鲜切褐变处理试验将果实清洗后切割为厚0.5 cm左右的薄片,静置于室温（25±2℃）条件下,分别于处理后0、12和24 h对丝瓜果肉进行取样,取样后立即进行生理指标的测定。代谢组测定选用易褐变丝瓜品种‘35D-7’完成,以处理前丝瓜样品为对照组,经沸水浴5 min后的样品为褐变处理组,样品经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中备用。试验材料的处理共设置3次生物学重复。

1.2 生理指标测定

1.2.1 总酚含量的测定丝瓜果实中的总酚含量按照福林酚（Folin-Ciocalteu）法进行测定^[15],称取1 g丝瓜果肉,加入2 mL 80%的乙醇提取剂,在冰浴条件下研磨至匀浆,经常温离心后,上清液即为丝瓜多酚物质粗提液。吸取1 mL粗提液,加入0.5 mol·L^-1福林酚溶液1.5 mL,混匀后静置5 min,再加入0.5 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液3 mL,加超纯水定容至10 mL,在黑暗条件下反应1 h后于750 nm下测定吸光值。利用没食子酸标准品制备标准曲线,根据标准曲线计算总酚含量。

1.2.2 多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶活性的测定借助多酚氧化酶测试盒（南京建成生物工程研究所,A136-1-1）完成,反应按照试剂盒说明书进行（http://www.njjcbio.com/products.asp?id=2617）,以每分钟每g组织在每mL反应体系中,使420 nm处吸光度值变化0.01为一个酶活力单位计算多酚氧化酶活性。

1.3 代谢组测定与分析

1.3.1 代谢产物的提取将丝瓜果实样品置于冻干机Scientz-100F中进行真空冷冻干燥,并借助研磨仪（MM400,Retsch）研磨至粉末状,研磨条件为30 Hz、1.5 min。称取100 mg粉末,溶解于600 µL 70%甲醇提取液中,于4℃冰箱保存过夜,其间进行间断涡旋,以提高提取效率。经10 000×g离心10 min后,吸取上清液,于0.22 µm的微孔滤膜过滤后保存于进样瓶中,用于UPLC-MS分析。

1.3.2 色谱及质谱采集条件超高效液相色谱UPLC于Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A完成,色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C₁₈柱（2.1 mm×100 mm）,流动相为A相（超纯水）,B相（乙腈）,A相和B相中均加入0.04%的乙酸。初始B相比例为5%,10 min内B相比例线性增加到95%,并维持1 min,11—11.1 min时B相比例降为5%并平衡至14 min。流速为0.35 mL·min^-1,柱温40℃,进样体积为4 µL。

质谱条件为：电喷雾离子源温度为550℃,质谱电压为5 500 V,帘气30 psi,碰撞诱导电离参数设置为高。对每个离子对的扫描检测在三重四级杆中根据优化的去簇电压和碰撞能完成。

代谢组的测定由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成,基于迈维代谢自建数据库MWDB根据二级谱信息对物质进行定性分析。

2 结果

2.1 鲜切后不同时间丝瓜果肉褐变程度比较

对鲜切后室温放置的不同品种丝瓜果实进行比较可见,处理前两个丝瓜品种‘2D-2’和‘35D-7’果肉均呈乳白色;室温放置12 h后,两个品种的丝瓜果肉均开始略微发黄,‘35D-7’的果肉上呈现出少量褐色斑点;鲜切放置24 h后,‘2D-2’丝瓜果肉与12 h相比无明显变化,丝瓜‘35D-7’果肉的褐化面积增加（图1）。

图1

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图1鲜切后不同放置时间丝瓜果肉褐变情况

标尺为2 cm
Fig. 1Browning of the Luffa pulp at different placement time after fresh cutting

The white lines in the lower right corner represent 2 cm

2.2 鲜切后不同时间丝瓜果肉总酚含量

对鲜切后放置不同时间的两个丝瓜品种果肉总酚含量进行测定,结果表明（图2）：鲜切放置初始时,两个丝瓜品种的总酚含量均约为0.01 mg·g^-1 FW,‘35D-7’较低;室温条件下放置12 h后,二者总酚含量均显著上升,‘35D-7’果肉中的总酚含量相对较高,约为‘2D-2’的1.42倍;丝瓜‘35D-7’果肉中的总酚含量放置24 h时继续升高,达0.0421 mg·g^-1FW;相反地,‘2D-2’果肉中的总酚含量略微下降至初始水平。

图2

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图2鲜切后不同放置时间丝瓜果肉总酚含量

不同小写字母表示在P<0.05水平上的显著性差异。下同
Fig. 2Phenols content in Luffa pulp at different placement time after fresh cutting

Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level. The same as below

2.3 鲜切后不同时间丝瓜果肉多酚氧化酶活性

在鲜切后放置不同时间条件下,丝瓜‘35D-7’果肉中的多酚氧化酶活性均显著高于‘2D-2’,分别为‘2D-2’中多酚氧化酶活性的4.94、6.38和3.95倍。随着放置时间的增加,丝瓜‘35D-7’果肉中多酚氧化酶的活性呈先升高后降低的趋势,放置12 h时活性最高,达174.23 U·g^-1·min^-1;丝瓜‘2D-2’果肉中的多酚氧化酶活性逐渐上升,但变化幅度相对较小（图3）。

图3

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图3鲜切后不同放置时间丝瓜果肉多酚氧化酶活性

Fig. 3PPO enzyme activity in Luffa pulp at different placement time after fresh cutting

2.4 丝瓜果肉褐变处理代谢组数据质量评估

为进一步确定丝瓜褐变过程的代谢物变化,选取褐变程度较为明显的易褐变品种‘35D-7’进行代谢组学分析。由不同样本提取物混合制备成质控样本,用于分析样本在相同处理方法下的重复性,对不同质控样本质谱检测分析的重叠展示总离子流图如图4所示,可见代谢物检测的总离子流曲线重叠性较高,保留时间和峰强度均一致,表明质谱对样品的分析信号稳定性较好,可以保证数据的重复性和可靠性。

图4

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图4样本总离子流重叠展示图

Fig. 4Overlap total ion chromatogram of all samples

2.5 代谢物鉴定及聚类分析、差异代谢物的筛选

基于本地代谢组数据库,从对照（CK）及褐变处理（BR）样品中共鉴定获得420种代谢物,主要注释为脂质、类黄酮、酚酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有机酸、生物碱、萜类、木脂素和香豆素类、单宁等10类物质（图5）。从整体上看,经褐变处理后,丝瓜果肉中的代谢物含量主要以降低趋势为主。

图5

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图5丝瓜褐变处理代谢物含量变化聚类热图

Fig. 5Cluster heatmap of metabolite content changes during Luffa browning treatment

对各代谢物进行定量分析,共有229种物质被鉴定为差异代谢物,其中140种代谢物含量在褐变处理后显著下降,89种升高。对所鉴定到的差异代谢产物进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）代谢通路富集分析,结果如图6所示。共88种差异代谢物被注释到42个代谢通路上（图6-A）,其中代谢途径、次生代谢产物的合成和脯氨酸代谢包含最多的差异代谢物,分别占注释的差异代谢物数目的51.14%、22.73%和10.23%;其次是苯丙素类生物合成、嘧啶代谢、类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇的生物合成。由图6-B可得出丝瓜果肉褐变过程中关键代谢通路的变化程度。富集较为显著的通路包括脯氨酸代谢、玉米素生物合成、苯丙素类生物合成、类黄酮生物合成以及不饱和脂肪酸合成。

图6

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图6丝瓜褐变处理差异代谢物通路富集2.6 丝瓜果肉褐变过程差异代谢物分析

Fig. 6Enrichment of differential metabolite pathway during Luffa browning treatment

表1显示了丝瓜果肉褐变过程部分差异代谢产物信息。在注释为参与苯丙素生物合成途径的代谢物中,大多数差异代谢物含量在褐变处理后显著下降,松柏醛的倍数变化较为明显,Log2变化倍数达-14.82。紫丁香苷的含量呈现了相反的趋势,Log2变化倍数为17.56。沸水浴褐变还引起了大量脯氨酸代谢通路化合物含量的升高,包括腺苷-3′, 5′-环单磷酸水合物、2′-脱氧腺苷、腺苷等。类黄酮生物合成相关的芹菜素、木犀草素、短叶松素等化合物的含量也均呈现出下降的趋势。

Table 1
表1
表1丝瓜褐变处理部分差异代谢产物
Table 1Partial differential metabolites during Luffa browning treatment

KEGG通路 KEGG pathway	代谢物 Metabolite	结构式 Formula	变化倍数（褐变处理/对照） Fold change (BR/CK)	Log2变化倍数 Log2 Fold change	变化趋势 Change trends
苯丙素的生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis	松柏醇 Coniferyl alcohol	C₁₀H₁₂O₃	2.06E-01	-2.28	下降 Down
	咖啡酸 Caffeic acid	C₉H₈O₄	7.17E-02	-3.80	下降 Down
	对香豆酸 p-coumaric acid	C₉H₈O₃	1.40E-01	-2.84	下降 Down
	紫丁香苷 Syringin	C₁₇H₂₄O₉	1.93E+05	17.56	升高 Up
	松柏醛 Coniferaldehyde	C₁₀H₁₀O₃	3.46E-05	-14.82	下降 Down
	芥子酸 Sinapic acid	C₁₁H₁₂O₅	1.49E-01	-2.75	下降 Down
	阿魏酸 Ferulic acid	C₁₀H₁₀O₄	9.54E-02	-3.39	下降 Down
脯氨酸代谢 Purine metabolism	腺苷-3′,5′-环单磷酸水合物 Cyclic AMP	C₁₀H₁₂N₅O₆P	4.00E+02	8.65	升高 Up
	腺苷-3′-磷酸 3′-Aenylic acid	C₁₀H₁₄N₅O₇P	8.32E+00	3.06	升高 Up
	鸟苷3′,5′-环单磷酸 Guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate	C₁₀H₁₂N₅O₇P	4.95E+00	2.31	升高 Up
	2′-脱氧鸟苷 Deoxyguanosine	C₁₀H₁₃N₅O₄	5.65E+00	2.50	升高 Up
	2′-脱氧腺苷 Deoxyadenosine	C₁₀H₁₃N₅O₃	2.01E+02	7.65	升高 Up
	鸟嘌呤 Guanine	C₅H₅N₅O	3.35E-01	-1.58	下降 Down
	2′-脱氧腺苷-5′-单磷酸 2′-Deoxyadenosine-5′-monophosphate	C₁₀H₁₄N₅O₆P	5.65E+00	2.50	升高 Up
	腺苷 Adenosine	C₁₀H₁₃N₅O₄	2.15E+02	7.75	升高 Up
	黄嘌呤 Xanthine	C₅H₄N₄O₂	2.93E-01	-1.77	下降 down
类黄酮生物合成 Flavonoid biosynthesis	木犀草素 Luteolin	C₁₅H₁₀O₆	4.84E-05	-14.34	下降 Down
	表儿茶素 L-epicatechin	C₁₅H₁₄O₆	4.68E-01	-1.10	下降 Down
	短叶松素 Pinobanksin	C₁₅H₁₂O₅	1.16E-02	-6.42	下降 Down
	柚皮素查尔酮 Naringenin chalcone	C₁₅H₁₂O₅	2.80E-02	-5.16	下降 Down
	芹菜素 Apigenin	C₁₅H₁₀O₅	1.12E-05	-16.45	下降 Down

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2.7 丝瓜果肉褐变过程酚酸类代谢物分析

基于对丝瓜果肉代谢物的质谱定性定量分析,共有59代谢物被鉴定为酚酸类物质。根据对照丝瓜样品中的代谢物含量,鉴定获得了丝瓜果肉中的主要酚酸类化合物,含量排名前10位的酚酸类物质及其相对含量如图7所示。样品丝瓜果肉中含量最高的酚酸类物质为对香豆酸,其次是松柏苷、龙胆酸、咖啡酸以及阿魏酸,含量分别为对香豆酸含量的0.50、0.37、0.30和0.30倍。

图7

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图7丝瓜果肉酚酸类代谢物相对含量（前10位）

Fig. 7Relative content of phenolic acid metabolites in Luffa pulp (Top 10)

在筛选获得的差异代谢物中,共有35种代谢物被鉴定为酚酸类代谢物,为了进一步鉴定不同种类酚类物质在丝瓜果肉褐变过程中含量的变化规律,筛选了变化倍数差异最大的10种酚酸类差异代谢物,结果如图8所示。含量下降最为明显的酚酸类化合物分别为松柏醛、3-氨基水杨酸、咖啡酸苯乙酯、1-（4-甲氧苯基）-1-丙醇和3, 4-二甲氧基肉桂酸。相反地,经沸水浴褐变处理后,丝瓜果肉中的紫丁香苷、2, 5-二羟基苯甲酸O-己糖苷、异绿原酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯和4-咖啡酰奎宁酸均有大量积累,前4种物质的Log2变化倍数均达到了10以上。

图8

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图8丝瓜褐变处理差异倍数前10的酚酸类差异代谢物

Fig. 8Top 10 fold change differential metabolites of phenolic acids during Luffa browning treatment

3 讨论

酶促褐变是影响果实风味、降低其营养价值的重要破坏性反应之一,通常认为是造成蔬菜质量损失的第二大原因^[16]。代谢组学将液相色谱与质谱联用,可以精准地对复杂的混合物进行分离、定性和定量分析,获得生物体内代谢产物的动态变化^[17]。在丝瓜运输和加工过程中,果实的褐变严重影响其经济价值。

前人研究表明,丝瓜的褐变主要与总酚类化合物、多酚氧化酶活性有关^[18]。在本研究中,随着褐变过程的发生,两个品种丝瓜果肉中的总酚含量和多酚氧化酶活性均呈现升高的趋势。在酶促反应中,醌类物质作为反应底物可以在多酚氧化酶的作用下转化为醌类。在此之后,醌类会与一些具有还原能力的酚类或非酚类物质发生耦合氧化反应,酚类物质进一步反应成聚合物,发生累积并继续参加酶促反应^[19]。放置12 h后,丝瓜果肉中多酚氧化酶活性上升,这可能与酚类化合物浓度的提高有关。随着底物酚类物质浓度的升高,酶活性也相应提升。放置24 h后,耐褐变丝瓜品种‘2D-2’中的总酚含量略有下降。类似地,丝瓜‘35D-7’果肉的多酚氧化酶含量也在放置24 h时有所降低,这一现象可能是由于多酚的代谢达到峰值后启动了反馈抑制机制,酶促反应的底物被不断消耗,逐步造成酶促反应效率下降,其他在丝瓜类似的研究中也有此现象发生^[20]。与耐褐变品种相比,丝瓜‘35D-7’的多酚氧化酶活性在放置不同时间均较高,这与笔者之前对多酚氧化酶相关基因的表达分析结果一致,转录组分析及荧光定量结果均表明易褐变丝瓜品种的多酚氧化酶活性较高,导致了丝瓜褐化速率的提高^[9]。

酚类物质是酶促褐变的底物,但不同物种褐变的主要酚类物质的组成和含量不同。本研究中,共有59种代谢物被鉴定为酚酸类物质,其中对香豆酸、松柏苷和龙胆酸的含量相对较高。不同品种丝瓜中酚类物质的种类和含量存在一定差异,推测这几种酚类物质在丝瓜‘35D-7’果肉褐变过程中可能起主要作用。进一步发现,经沸水浴褐变后,含量下降倍数最明显的酚酸类代谢物为松柏醛、3-氨基水杨酸和咖啡酸苯乙酯,表明这几种代谢物可能在酶促褐变反应中被消耗。松柏醛是木质素合成的前体,是过氧化物酶（peroxidase,POD）的重要底物。在豆薯中的研究表明,豆薯切片的褐变与木质化过程有关^[21]。在植物体内存在H₂O₂时,POD也可以催化酚类物质氧化导致褐变^[22]。褐变后丝瓜果肉中含量上升倍数最高的酚酸类代谢物为紫丁香苷、2, 5-二羟基苯甲酸O-己糖苷和异绿原酸A。紫丁香苷通常存在于被子植物的形成层组织中,被认为是木质素合成的前体^[23]。FRANZISKA等^[24]结合核磁共振、色谱、质谱等技术首次从莴苣中鉴定到紫丁香苷的存在,并探究了其与褐变过程的关系。2, 5-二羟基苯甲酸O-己糖苷是龙胆酸的衍生物,龙胆酸是丝瓜中主要的酚酸物质^[14]。异绿原酸A是一种绿原酸的异构体。在芋艿、马铃薯、梨等植物中的研究均表明,多酚氧化酶对绿原酸的亲和力较强,在褐变过程中绿原酸含量显著上升^[25,26,27]。本研究结果表明丝瓜果肉褐变后总酚类物质含量的提高可能主要与这些物质的含量变化有关。

在所鉴定到的差异代谢物中,除了参与苯丙素代谢途径的酚酸类物质外,脯氨酸代谢及类黄酮生物合成途径的多种代谢物含量也表现出了明显的差异。脯氨酸是植物遭受胁迫时调节渗透平衡,维持蛋白质结构稳定,清除活性氧的重要有机分子^[28,29]。本研究采用沸水浴对丝瓜果肉进行褐变处理,对丝瓜造成了高温胁迫,因此导致了大量脯氨酸代谢途径中化合物含量的增加。类黄酮也是一类与果实褐变相关的酚类物质^[30],与李（Prunus domestica）、大蕉（Musa paradisica）等植物褐变相关的表儿茶素、没食子酸等均属于黄酮类代谢物^[31,32]。本研究中,褐变处理后的芹菜素、木犀草素等类黄酮代谢物含量显著下降,表明类黄酮类物质也作为底物参与了丝瓜果肉的酶促褐变反应。

4 结论

丝瓜中含有对香豆酸、松柏苷、龙胆酸等酚酸类物质,这些酚酸类物质含量的变化与丝瓜的褐变相关。本研究鉴定获得丝瓜果肉中的主要酚类物质种类及其褐变前后的含量变化,发现松柏醛、紫丁香苷等代谢物可能为导致丝瓜褐变的主要酚酸类代谢物。研究结果为揭示丝瓜褐变生理机制及培育优良抗褐变丝瓜品种的选育提供了理论依据。

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被引期刊影响因子

[1]

朱海生, 康娟, 刘建汀, 陈敏氡, 李永平, 王彬, 林碧英, 温庆放. 丝瓜多酚氧化酶PPO基因家族的克隆与表达分析
核农学报, 2018(8): 1502-1512.