0 引言
【研究意义】国家饲料药物基准实验室自主研发了硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）,主要应用于干乳期奶牛乳房炎的预防和治疗,并已获得国家新兽药证书（2015新兽药证字-62号）。在硫酸头孢喹肟注射液兽药质量标准基础上,建立了硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的检查方法,该方法灵敏度高,专属性强,可用于硫酸头孢喹肟乳房注入剂中有关物质的检测。【前人研究进展】 头孢喹肟（cefquinome）,是20世纪80年代由德国赫斯特公司（Hoechst AG）研发的第一个动物专用第四代头孢菌素类抗生素,商品名为克百特（Cobactan）[1],具有广谱抗菌、生物效价高、适于非肠道给药、低毒低残留、对β-内酰胺酶高度稳定等优势[2-3],目前已经被欧盟兽用药品委员会（CVMP）批准用于预防和治疗由敏感菌引起的家畜呼吸道感染、奶牛乳腺炎和子宫内膜炎[4]。头孢喹肟分子式为C23H24N6O5S2,化学名为(6R-7R)-7-[ (2-氨基-4一噻唑基)-2-（甲氧亚氨基）乙酰氨基]-3-[（5,6,7,8-四氢喹啉甲基）甲氧]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸,分子量为528.60。头孢喹肟的合成路线主要有3种[5-9],均由5,6,7,8-四氢喹啉,又名2,3-环己基吡啶（2, 3 - cyclohexyl pyridine）合成而来。5,6,7,8-四氢喹啉既是头孢喹肟的合成前体,也可以在特殊作用力下由头孢喹肟裂解而来。药物中的杂质是指存在于药物中,但化学结构与药物不一样的任何一种成分,其中与药物结构类似或具渊源的杂质又称为有关物质[10-11]。杂质的活性药物成分可能对药物产品的质量和靶动物的安全性产生较大的影响[12-13]。因此进行药物或制剂中有关物质的测定,对于提高化学的合成过程和优化药物制剂工艺,减少甚至消除此类杂质是至关重要的[14]。硫酸头孢喹肟注射液质量标准中规定,5,6,7,8-四氢喹啉为硫酸头孢喹肟的单个有关物质。四氢喹啉衍生物如1,2,3,4-四氢喹啉或者其他衍生物均匀良好的抗癌、抗抑郁活性[15-16],而单体5,6,7,8-四氢喹啉的化学性质和药理学性质却没有相关研究报道。近年来,随着色谱、光谱技术的迅速发展,越来越多的联用技术被运用于药物质量控制,通常药品中有关物质含量相对较低[17],高效液相色谱法（HPLC）具备检测限较低、灵敏度较高的优势,在有关物质结构已知的情况下被广泛用于开发高效分离,简便可靠的杂质测定方法[18]。MUSTAKHUSEN等[19]在确证U-高尿酸血症治疗药的有关物质结构时,使用了LC-MS/MS、NMR以及IR技术,推测了其有关物质的生成路径。SATYANARAYANA等[20]在鉴别度他雄胺原料中杂质的结构时,也采用了HPLC、IR、NMR、MS技术。ALIREZA 等[21]利用X-粉末衍射（PXRD）、差示扫描热法（DSC）考察了阿莫西林原料药的纯度,并使用HPLC法对原料药的有关物质进行验证。【本研究切入点】目前硫酸头孢喹肟上市的产品主要有国外的英特威国际有限公司的硫酸头孢喹肟注射液（（2011）外兽药证字20号）,国内批准产品剂型也以注射剂或粉剂为主,而且目前国内外对硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的研究尚不深入。【拟解决的关键问题】研究有关物质检查方法的专属性,即通过给予研究对象极端或剧烈的条件,观察新生成的杂质来考察其降解产物,这也是目前有关物质研究工作的重点[22-24]。本试验着重开展了硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质检查方法的专属性研究,既在一定破坏条件下,使药物主成分降解控制在10%—30%以内[10,25],同时考察有关物质的含量、分离度、杂质数量变化等重要参数。1 材料与方法
试验于2014年11月1日在中国农业科学院饲料研究所国家饲料药物基准实验室开展。1.1 仪器
高效液相色谱仪,Waters e2695 （UV2998）;分析天平,Sartorius CPA225D;离心机,Thermo Fisher;超声仪,KQ-300DE;酸度计,Sartorius PB-21。1.2 试剂
头孢喹肟标准品（中国兽医药品监察所,批号：K0312406,含量82.6%）;硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）（中国农业科学院饲料研究所,批号：20141104,20141105,20141106）;高氯酸钠、磷酸均为分析纯;乙腈为色谱纯,水为超纯水。1.3 色谱条件及样品处理方法
色谱条件参考硫酸头孢喹肟注射液质量标准[26],流动相为高氯酸钠缓冲液（精密称取3.45 g溶于 1 000 mL水中,加乙腈115 mL和磷酸12 mL,三乙胺调pH=3.6）;流速为1 mL·min-1;检测波长为270 nm;柱温为30℃;进样量为20 μL。本试验采用的色谱柱为Waters Sunfire C18 150 mm×4.6 mm 5 μm。硫酸头孢喹肟乳房注入剂处理方法：精密称取硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）适量（约相当于头孢喹肟12.5 mg）置50 mL离心管中,加流动相25 mL溶解,涡旋2 min,水浴超声20 min,4 000 r/min离心5 min,取下层溶液20 μL,过0.45 μm滤膜,注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分保留时间的2倍。
1.4 检测限考察
称取一定量的硫酸头孢喹肟标准品,甲醇溶解,流动相稀释成一系列浓度的标准工作溶液,按1.3项下的色谱条件采用HPLC峰面积归一化法计算硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的检测限及其浓度,以s/n≥3的最小样品浓度为最低检测限。1.5 精密度考察
1.5.1 进样精密度 精密称取批号为20141104的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）适量,用流动相溶解成浓度为100 µg·mL-1的溶液,按1.3项下色谱条件和样品处理后重复进样5针,以头孢喹肟峰面积计算RSD。1.5.2 方法精密度 精密称取5份批号为20141104的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）适量,用流动相溶解成浓度为100 µg·mL-1的溶液,按1.3项下色谱条件和样品处理后测定,并以头孢喹肟峰面积计算RSD。
1.6 稳定性考察
精密称取批号为20141104的硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）适量,用流动相溶解成浓度为100 µg·mL-1的溶液,按1.3项下色谱条件和样品处理后分别在室温下于0、0.5、1、2、3 h时进样,测定主成分及杂质峰面积。1.7 线性考察
精密称取头孢喹肟标准品适量,流动相溶解并稀释成300、200、100、30、7.5 µg·mL-1系列浓度的溶液,取20 µL进样,测定有关物质峰及头孢喹肟峰面积,以头孢喹肟及有关物质浓度对各自峰面积分别进行线性回归分析。1.8 专属性考察
1.8.1 样品前处理 精密称取2 g样品置于50 mL离心管中,加入50 mL流动相后涡旋2 min,水浴超声20 min,4 000 r/min离心5 min。1.8.2 破坏前样品处理 精密量取下清液1 mL,加流动相1 mL,涡旋2 min后过0.2 μm滤膜,取20 µL进样,记录色谱图（图1-a）。
1.8.3 酸破坏样品处理 精密量取下清液5 mL,于10 mL离心管中,加入0.2 mol·L-1 HCl 2 mL,振荡摇匀,置50℃水浴振荡4 h后,自然冷却,加入0.2 mol·L-1 NaOH 2 mL中和,再加入1 mL流动相后涡旋1 min,过0.2 μm滤膜,取20 µL进样,记录色谱图（图1-b）。
1.8.4 碱破坏样品处理 精密量取下清液5 mL,于10 mL离心管中,加入0.2 mol·L-1 NaOH 2 mL,振荡摇匀,室温下振荡4 h后,加入0.2 mol·L-1 HCl 2 mL中和,再加入1 mL流动相后涡旋1 min,过0.2 μm滤膜,取20 µL进样,记录色谱图（图1-c）。
1.8.5 高温破坏样品处理 精密量取下清液5 mL,于10 mL离心管中,置90℃烘箱内1 h后取出,自然冷却,加入流动相5 mL后涡旋1 min,过0.2 μm滤膜,取20 µL进样,记录色谱图（图1-d）。
1.8.6 氧化破坏样品处理 精密量取下清液5 mL,于10 mL离心管中,加入10% H2O2 2 mL,振荡摇匀,置50℃水浴振荡30 min后,自然冷却,加入流动相3 mL后涡旋1 min,过0.2 μm滤膜,取20 µL进样,记录色谱图（图1-e）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1样品破坏前后色谱图
a．破坏前样品色谱图;b. 酸破坏后样品色谱图;c. 碱破坏后样品色谱图;d. 高温破坏后样品色谱图;e. 氧化破坏后样品色谱图;f. 空白溶剂色谱图
-->Fig. 1The HPLC chromatograms of samples before and after destruction
a. Before destroyed; b. Acid destroyed; c. Alkaline destroyed; d. H-temperature destroyed; e. Oxidative destroyed; f. Blank solvent
-->
2 结果
2.1 检测限确定
由数据表1可知,样品经一系列稀释后,当主成分浓度为7.5 µg·mL-1时,有关物质的信噪比为3,经过面积归一化法计算,有关物质的浓度为0.05 µg·mL-1,因此本方法中硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的检测限约为0.05 µg·mL-1,色谱图如图2。Table 1
表1
表1检测限试验
Table 1Results of LOD tests
| 样品浓度 Concentration of sample (µg·mL-1) | 头孢喹肟峰面积 Area of cefquinome | 有关物质峰面积 Area of related-substance | 有关物质浓度 Concentration of related-substance (µg·mL-1) | 有关物质信噪比 S/N of related-substance |
|---|---|---|---|---|
| 300 | 13744822 | 77942 | 1.70 | 131 |
| 100 | 4572971 | 26070 | 0.57 | 48 |
| 30 | 1359260 | 8288 | 0.18 | 12 |
| 7.5 | 337314 | 2017 | 0.05 | 3 |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2检测限色谱图
-->Fig. 2The HPLC chromatograms of LOD
-->
2.2 精密度试验
按1.5项下样品处理方法处理的样品按1.3项下色谱条件分析,同一样品重复进样5次,以主峰峰面积计算,RSD=0.8%;同一批样品平行处理5个样品,以主峰峰面积计算,RSD=0.6%。2.3 稳定性试验
由数据表2可知,随着放置时间的加长,杂质含量明显增加,放置2 h的样品测定其有关物质已经超过兽药质量标准规范规定的最高含量（2.0%）[26],因此样品配制后应该立即检测。2.4 线性考察
2.4.1 头孢喹肟浓度对峰面积进行线性回归分析,回归方程为y = 45852x - 11520,相关系数r=1。表明头孢喹肟在7.5—300 µg·mL-1浓度范围内,线性相关性良好（图3）。Tab 2
表2
表2稳定性试验
Tab 2Results of stability tests
| 放置时间 Placement time (h) | 喹肟含量 Concentration of cefquinome (%) | 杂质含量 Concentration of impurity (%) |
|---|---|---|
| 0 | 98.63 | 0.98 |
| 0.5 | 98.55 | 1.04 |
| 1 | 97.91 | 1.68 |
| 2 | 97.41 | 2.13 |
| 3 | 96.03 | 3.47 |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3头孢喹肟标准曲线图
-->Fig. 3The standard curve figure of Cef
-->
2.4.2 经过主成分对照计算,有关物质的浓度范围为0.05—2 µg·mL-1,在此范围内有关物质浓度对峰面积进行线性回归分析,回归方程为y = 45935x-130.03,相关系数r=1,线性相关性良好（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4有关物质标准曲线图
-->Fig. 4The standard curve figure of related-substances
-->
2.5 专属性考察结果
头孢喹肟在强酸、强碱、氧化、高温条件下均有降解,以破坏前样品主成分含量为100%,氧化破坏主成分降解达30%,高温破坏主成分降解达20%,酸、碱破坏主成分降解在10%左右,破坏前后主成分峰保留时间一致,各峰之间分离度良好。Table 3
表3
表3专属性试验
Table 3Results of specific tests
| 破坏条件 Destroy condition | 主成分峰面积 Area of cef | 主成分含量 Concention of cef (%) | 主成分保留时间 Retention of cef (min) | 主成分最小分离度 Min-resolution of cef | 有关物质含量 Concention of impurity (%) | 有关物质最小分离度 Min-resolution of impurity | 杂质个数 The number of impurities |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 未破坏 Before destroy | 42517910 | 98.17 | 10.164 | ≥23.5 | 1.5 | ≥8.5 | 2 |
| 酸破坏 Acid destroy | 37793648 | 87.46 | 10.240 | ≥8.3 | 5.93 | ≥9.3 | 4 |
| 碱破坏 Alkaline destroy | 38798264 | 90.71 | 10.291 | ≥24.0 | 5.38 | ≥9.3 | 3 |
| 高温破坏 H-temp destroy | 30743568 | 69.81 | 10.191 | ≥16.3 | 11.88 | ≥5.9 | 5 |
| 氧化破坏 Oxidative destroy | 30311582 | 79.95 | 10.189 | ≥8.4 | 3.85 | ≥7.4 | 5 |
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杂质峰与杂质峰之间分离度达到1.2即可,而被测物与相邻杂质峰的分离度必须大于1.5[27]。表3数据中显示,有关物质与其他杂质分离良好。本试验中,在一定时间内硫酸头孢喹肟乳房注入剂在各种破坏条件下样品杂质数量发生变化,有关物质含量均有增加,但有关物质相对保留时间基本不变。在破坏性试验中,有关物质含量明显增加且无其他干扰,表明拟定的色谱条件具有较强的专属性,可应用于头孢喹肟乳房注入剂有关物质检查。
2.6 制剂中有关物质测定
按1.3项下的色谱条件及样品处理后,对硫酸头孢喹肟乳房注入剂（干乳期）3批制剂中的有关物质进行测定,结果如下（表4）。由表4可知,按面积归一法计算,3批制剂中有关物质均未超过主峰面积的2.0%,符合兽药质量标准的规定。笔者使用了3根不同品牌的C18色谱柱,均按上述色谱条件进行硫酸头孢喹肟乳房注入剂中有关物质含量的考察。结果发现除头孢喹肟及有关物质保留时间有一定差异外,杂质个数及含量均无变化。经过调整柱温或者适当调整流动相比例以后,保留时间有所变化,但均未影响含量大小,说明本方法耐用性较好。
Table 4
表4
表4有关物质测定结果
Table 4Results of the determination of the related substances
| 批号 Batch no. | 喹肟峰面积 Area of cef | 有关物质峰面积 Area of related-substance | 有关物质含量 Concentration of related-substance (%) |
|---|---|---|---|
| 20141104 | 2636775 | 24966 | 0.93 |
| 20141105 | 2617459 | 25186 | 0.95 |
| 20141106 | 2655172 | 26144 | 0.97 |
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3 讨论
本试验针对硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的方法研究,主要参考了邓晶晶[28]及樊后民等[29]使用高效液相色谱法分别测定头孢美唑钠及头孢噻吩钠中的有关物质。邓晶晶除了考察头孢美唑钠的检测限、精密度、线性相关性等之外,同时进行了酸、碱、氧化、高温以及高湿条件下的破坏,发现该药耐酸,在其他条件下破坏主成分后,产生唯一的一种有关物质,即TMT（1-甲基-1H-四唑-5-硫醇）。在各种破坏条件下,TMT保留时间不变,含量均发生了变化。樊后民同样对头孢噻吩钠进行了酸、碱、氧化、高温4种条件的破坏,破坏后发现该药在各种破坏条件下主成分均有降解,且各种破坏条件下杂质数量发生明显变化,有关物质含量明显增加。这两种方法均有较强的专属性,破坏条件简单快速,但均未明确表述在一定时间内主成分峰及有关物质峰含量的具体变化,而本文所选择的破坏条件及破坏时间,必须保证药物主成分峰降解量控制在10%—30%,在此基础上研究有关物质及其他杂质的数量及含量变化等重要参数。在硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质专属性试验的研究过程,笔者对不同破坏条件进行了摸索,对不同浓度的酸、碱、过氧化物溶液以及不同温度下制剂的破坏情况进行了研究,如制剂在2、1、0.8和0.2 mol·L-1 盐酸及氢氧化钠的浓度进行10 min、20 min、30 min、1 h、2 h的破坏,在30%、20%、10%、5% H2O2溶液进行10、20、30 min的破坏,在80、90、100、110℃温度下进行30 min、1 h、2 h、3 h的破坏等。研究结果显示,硫酸头孢喹肟乳房注入剂经过30 min 10% H2O2溶液破坏后,主成分降解率为30%;经过4 h 0.2 mol·L-1的酸、碱溶液破坏后,主成分降解率为10%左右;经过90℃高温破坏1 h后,主成分的降解率为20%左右,满足《兽用化学药物杂质研究技术指导原则》的要求。由试验结果可发现硫酸头孢喹肟乳房注入剂对氧化物敏感,而较耐酸碱。破坏后杂质数量及含量均有增加,说明该检查方法具有较强的专属性。
根据质量标准规定,本产品水分含量不得超过0.2%。在实际检测过程中发现,密封性较差的样品可能由于受潮而存在有关物质含量较高的情况。而试验结果发现样品溶液放置超过2 h后,有关物质含量也有上升趋势,因此笔者考虑可能由于制剂水分的原因会直接引起有关物质含量的增加,期望更深入的试验探究水分对有关物质含量的影响。
本试验建立了HPLC法测定硫酸头孢喹肟乳房注入剂的有关物质,该方法快捷,在已知结构的反相色谱有关物质检测中,HPCL法是经济适用、高效分离、准确定量的研究方法。而TLC（薄层分析法）多适用于正相色谱有关物质的分析,GC（气相色谱法）多用来分析可气化且具备热稳定性的药物分析,CE（毛细管电泳法）主要用来分析离子化药物且具有分离程度高,简单高效等优势,但其自身稳定性较差。综上分析,在硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质分析初期,笔者首选HPLC法对其进行研究分析。
4 结论
本试验参考硫酸头孢喹肟注射液兽药质量标准以及文献中针对有关物质的检测方法,建立了硫酸头孢喹肟乳房注入剂中有关物质的检测方法。试验结果证明本方法灵敏度高,简单高效,专属性强,可用于硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质考察。The authors have declared that no competing interests exist.
