任海英^,1, 周慧敏^1,3, 戚行江¹, 郑锡良¹, 俞浙萍¹, 张淑文¹, 王震铄^,21浙江省农业科学院园艺研究所,杭州 310021
²中国农业大学植物保护学院,北京 100193
³长江大学园艺园林学院,湖北荆州 434023

Effects of Paclobutrazol on Soil and Endophytic Microbial Community Structure of Bayberry

REN HaiYing^,1, ZHOU HuiMin^1,3, QI XingJiang¹, ZHENG XiLiang¹, YU ZhePing¹, ZHANG ShuWen¹, WANG ZhenShuo^,21Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021
²College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193
³College of Horticulture and Landscape Architecture, Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei

通讯作者: 王震铄,E-mail： zhenswang@163.com

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2021-02-26接受日期:2021-05-20

基金资助:

浙江省科技厅重点研发计划(2019C02038) 浙江省重点研发计划项目(2020C02001) 浙江省重点研发计划项目(2021C02009)

Received:2021-02-26Accepted:2021-05-20
作者简介 About authors
任海英,0571-86410266, renhy@zaas.ac.cn。









摘要
【目的】多效唑常用在杨梅上用来催化花芽分化,过量施用会使树势衰弱、叶片卷曲皱缩。研究过量多效唑对杨梅根围土和根表土的土壤酶活性以及杨梅树体微生物群落结构的影响,为合理使用多效唑提供理论指导。【方法】1年生‘东魁’杨梅嫁接苗种植在经150、300和600 mg∙kg^-1多效唑处理的酸性红壤,不施用多效唑为对照。检测根围土、根表土、根、枝和叶中多效唑的积累量,测定土壤酶活性,利用Illumina MiSeq高通量测序研究多效唑对根围土、根表土、根、枝和叶中微生物群落结构的影响。【结果】杨梅叶片积累多效唑量最多,过氧化氢酶和磷酸酶活性显著降低,蔗糖酶活性显著提高。高浓度多效唑处理下,根围土的细菌多样性和丰富度明显降低,真菌多样性和丰富度明显升高,而根表土内的细菌多样性和丰富度明显升高、真菌多样性和丰富度明显降低,根内细菌、枝内真菌的多样性和丰富度均明显降低。在细菌群落结构组成分析中,施用多效唑后,明显降低杨梅根以及根围、根表土壤中酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门以及重要的生防类菌芽孢杆菌纲的相对丰度,增加根围土壤和枝条样品中伯克霍尔德菌属的相对丰度;而在真菌群落结构组成分析中,施用多效唑后,明显提高根围土壤和根表土壤的子囊菌门以及枝条叶片中外担菌纲的相对丰度,明显降低根围土壤、根表土壤和根中担子菌门、伞菌纲以及枝条和叶片中青霉属的相对丰度。【结论】土壤施用多效唑后,杨梅树体叶片残留量最多,土壤过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶活性显著变化,根围土、根表土、根、枝和叶中细菌、真菌丰富度和多样性发生显著变化。本研究结果可为合理施用多效唑和评价多效唑对果园土壤和杨梅树体生态系统的影响提供科学依据,有利于指导多效唑的科学施用。
关键词： 杨梅;多效唑;土壤酶活性;微生物群落

Abstract
【Objective】 Paclobutrazol is commonly used to catalyze flower bud differentiation in bayberry, however, excessive application will weaken the vigor of the trees with curled and shrank leaves. The study focused on the influence of paclobutrazol overuse on the enzyme activities of the bulk and root surface soil as well as plant and soil microbial community structure of bayberry, which would provide the theoretical guidance for the rational use of paclobutrazol. 【Method】 The grafted seedlings of one-year-old bayberry cv. ‘Dongkui’ were planted in the acid red soil and treated with 150, 300 and 600 mg∙kg ^-1 paclobutrazol, and the control was treated with the same volume of water. The accumulation of paclobutrazol was measured in the bulk and root surface soil, as well as roots, twigs and leaves of bayberry. The influence of paclobutrazol on bayberry associated microbe was determined by examining the soil enzyme activities and the microbial community structure of bulk and root surface soil, roots, twigs and leaves by using Illumina MiSeq high-throughput sequencing. 【Result】 The results showed that the most accumulation of paclobutrazol was in leaves, while the activities of catalase and phosphatase were significantly decreased, but the activities of invertase were significantly increased. The high concentration application of paclobutrazol significantly decreased diversity and richness of bacteria and increased the diversity and richness of fungi in bulk soil, which significantly increased the diversity and richness of bacteria and increased the diversity and richness fungi in surface root soil, while the diversity and richness of both root bacteria and branches fungi were significantly decreased. After the application of paclobutrazol, the relative abundance of Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Chloroflexi and important biocontrol bacteria Bacilli in bayberry root, root bulk and root surface soil were significantly reduced, and those of Burkholderia in root bulk soil and twigs were increased in the bacterial community composition; the relative abundance of Ascomycota in root bulk soils and root surface soils, those of Exobasidiomycetes in twigs and leaves were significantly increased, and those of Basidiomycota and Agaricomycetes in root bulk soil, root surface soil and roots, and Penicillium in twigs and leaves were significantly decreased in the analysis of fungal community composition. 【Conclusion】 The most residue was found in leaves of bayberry plant after soil application of paclobutrazol. The overuse of paclobutrazol caused a significant change in the activities of catalase, phosphatase and sucrase treated soils, as well as the richness and diversity of bacteria and fungi in the bulk and root surface soil, roots, branches and leaves of the bayberry trees. Overall, the results of this study not only gave an understanding on the influence of paclobutrazol on bayberry and orchard soil ecosystem, but also provided a theoretical basis for the rational application of paclobutrazol.
Keywords：bayberry;paclobutrazol;soil enzyme activity;microbial community


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本文引用格式
任海英, 周慧敏, 戚行江, 郑锡良, 俞浙萍, 张淑文, 王震铄. 多效唑对杨梅土壤微生物及内生群落结构的影响. 中国农业科学, 2021, 54(17): 3752-3765 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.016
REN HaiYing, ZHOU HuiMin, QI XingJiang, ZHENG XiLiang, YU ZhePing, ZHANG ShuWen, WANG ZhenShuo. Effects of Paclobutrazol on Soil and Endophytic Microbial Community Structure of Bayberry. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(17): 3752-3765 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.016


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0 引言

【研究意义】杨梅（Myrica rubra Sieb Zucc.）果实甜酸适口,风味独特,营养价值高,全国栽培面积约33.4万hm², 年产量约95万t,经济效益显著^[1,2]。‘东魁’品种果个大,商品性好,栽培面积达到70%以上,但是该品种生长旺盛、花芽分化困难,常施用多效唑来控梢促花芽,产业上常常出现多效唑施用过量导致杨梅叶间缩短、叶片卷曲、树体衰弱,甚至引起树体早衰死亡^[3,4]。开发出有效恢复早衰杨梅树势的技术,成为产业的迫切需求。【前人研究进展】多效唑[Paclobutrazol, （2RS, 3RS）-1-（4-氯苯基）-4,4-二甲基-2-（1H-1,2,4-三唑-1-基）戊烷-3-醇,PP333]在农业生产中发挥着重要的作用,常用于促进开花和坐果、调节植物生长,如矮化芍药^[5]和小麦^[6],提高玉米^[7]、茶树种子和油料产量^[8],降低番茄株高、提高光合速率、缩短果实的成熟时间^[9,10],也常用于杨梅的促花^[11]。多效唑在土壤残留期较长,残留的多效唑会影响土壤生态系统的平衡^[12,13],对杨梅的根际菌根有伤害作用,同时降低菌丝的侵染能力^[14],使用过量使杨梅叶片细胞紧缩、变小,叶片皱缩,秋梢抽发减少,极易出现早衰现象^[3]。微生物是土壤的重要组分,其结构和多样性影响着土壤肥力、植物生长发育^[15,16]、有机物分解和污染物降解等^[17],重构土壤菌群结构是提高土壤肥力的重要措施^[18,19]。内生菌是广泛存在于植物各组织器官中以宿主植物代谢物为营养物质的一类微生物^[20,21],促进植物吸收养分、生长加快、增强抗性^[22,23,24],重金属污染和病原菌侵染等均可以改变内生菌群的群落结构^[25,26]。但是多效唑对杨梅树体内生菌群和土壤微生物群落结构的作用未见报道。【本研究切入点】多效唑的推荐喷施浓度为300—750 mg·L^-1,适宜喷施时期为7月上旬至9月下旬^[11],但是在产业上农民往往土壤施用,而且是多次施用,连续土壤施用300—400 mg·kg^-1的PP333会导致杨梅叶片和土壤中PP333的残留和积累,使杨梅叶片畸形、树体早衰及死亡。明确多效唑对杨梅根围和根表土壤以及根、枝和叶的微生物群落影响将有助于开发恢复杨梅树势的技术措施。【拟解决的关键问题】本研究以‘东魁’杨梅为试材,进行不同浓度多效唑处理,对多效唑在杨梅树体根、枝、叶和土壤内的残留、土壤酶活性以及施用多效唑前后杨梅土壤及树体微生物多样性和群落结构的变化情况进行研究,为开发恢复早衰杨梅树势的技术,指导多效唑科学施用提供理论指导。

1 材料与方法

试验于2018—2019年在浙江农业科学院进行。

1.1 试验材料

试验所用的杨梅苗于2018年4月种植在玻璃温室内。选择体积为30 cm×30 cm的无纺布袋装满黄泥土（取自仙居荒山,未种植过杨梅,未使用过任何农业投入品）,根据杨梅出现叶片卷缩、叶间缩短的树体根围土壤多效唑残留量检测^[4]以及土壤施用多效唑引起杨梅树体危害的剂量报道^[3],配置多效唑浓度为0（P0）、150（P150）、300（P300）和600（P600）mg∙kg^-1的黄泥土,选择长势一致的1年生‘东魁’杨梅嫁接苗小心种植入袋内,每个处理梯度种植15棵苗,置入玻璃温室内,平均温度25℃,以无多效唑的黄泥土种植的杨梅为对照,按常规方式管理,不施用其他肥料和农药。

1.2 取样方法

种植6个月后,最高浓度处理P600的叶片出现皱缩现象,采集距离主茎10 cm位置的土壤用于多效唑残留和土壤酶活性测定,采集根围土、根表土及叶片、枝条、树根等样品,迅速放入液氮中冷冻后置于-80℃冰箱备用。距离顶端3片嫩叶以下的成熟叶片和对应位置的枝干用来检测多效唑的积累量。每3个叶片、3根枝条或者树根为1次重复,每个处理均设6次重复。

在树冠滴水线位置0—20 cm土层内挖取直径0.5—1.0 cm的细根,用手轻轻抖动收集的样品即为根围土壤,把须根放入50 mL PBS中150 r/min摇床摇30 min,然后1 000 r/min离心5 min,收集土壤沉淀,晾干过40目筛网即为根表土^[27],每盆土算1个重复,每个处理均设6次重复。

1.3 多效唑残留量检测

对采集的杨梅枝条、叶片、根、根围土和根表土中的多效唑残留提取和检测参照赵锋等^[28]的方法。

根围和根表土壤的多效唑提取方法：准确称取10.0 g土壤样品,加入5 mL去离子水和20 mL乙腈,涡旋1 min,超声提取20 min,4 500 r/min离心3 min,将上清液转入盛有5 g NaCl的具塞量筒中,余下的土样按上述提取方法第2次提取。将2次提取液合并转入盛有5 g NaCl的具塞量筒中,涡旋2 min,静止30 min,用移液管抽取上清液20 mL转入圆底烧瓶,旋转蒸发浓缩至干,用2.5 mL正己烷定容,0.45 μm有机膜过滤于进样小瓶中保存,待测。

杨梅根、枝、叶多效唑提取方法：准确称取5.0 g已磨碎的匀质样品,加入乙腈溶液10 mL,涡旋,加入NaCl 1.5 g静置10 min,涡旋后8 000 r/min,10 min离心,取上清液备用。然后用5 mL甲醇和5 mL水预处理固相萃取柱,取上清液过柱,再用5 mL水和5 mL 5%甲醇淋洗萃取柱,弃去淋洗液,抽干小柱,5 mL甲醇洗脱小柱,收集洗脱液,过0.22 μm滤膜,待测。

多效唑含量采用气相色谱-三重四级杆串联质谱仪（GC-MS-MS）测定。标准溶液：精确称取多效唑标准品质量0.0050 g（精确至0.0001 g）,甲醇溶液溶解定容稀释至浓度分别为0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 μg∙mL^-1,过0.22 μm滤膜,待用。称取多效唑标准品,少量甲醇溶液溶解,用水分别稀释到50、100、150、200、250和300 μg∙mL^-1,每个浓度的溶液200 mL。色谱条件：流速1 mL∙min^-1;温度40℃;波长220 nm;进样量20 μL;色谱柱为XBridge C18色谱柱;流动相是乙腈﹕水=1﹕1（体积比）。

1.4 土壤酶活性检测

土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定^[29],土壤磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定^[30],土壤蔗糖酶采用铜试剂定量法^[31],纤维素酶活性测定用3,5-二硝基水杨酸比色法^[32]。每个样品技术重复6次,取平均值。

1.5 土壤基因组测序

P0和P600处理的根围土壤（分别记为BS0、BSP）、根表（分别记为SF0、SFP）和根（分别记为R0、RP）、枝（分别记为T0、TP）、叶（分别记为L0、LP）样品的基因组测序委托上海欧易生物医学科技有限公司执行。采用DNA抽提试剂盒（DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit）提取样本基因组DNA,以稀释后的基因组DNA为模板,使用Tks Gflex DNA Polymerase高保真酶（Takara,大连）进行PCR,使用带条形码（Barcode）的特异引物343F-5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和798R-5'-AGGGTATCTAATCCT-3'PCR扩增细菌多样性对应区域16SrRNA V3-V4区^[33],ITS1F-5'-CTTGG TCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2-5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3' 扩增真菌ITS多样性对应区域ITS1和ITS2^[34],使用Qubit dsDNA Assay Kit定量后,PCR产物等量混样,利用Illumina MiSeqPE300平台对PCR产物进行测序。采用Illumina Miseq对微生物多样性测序分析,使用Vsearch软件按照97%的相似度进行OTU分类,采用RDP Classifier Naive Bayesian对代表序列与数据库进行物种注释。

1.6 数据处理

本研究中Alpha多样性指数采用Mothur软件进行计算,包括Chao1指数和Shannon指数。Chao1指数反应群落的丰富度,而Shannon指数反应群落的多样性。Beta多样性分析利用R3.5.1语言进行,即主成分析（principal component analysis,PCA）。微生物群落结构柱形图使用QIIME软件绘制,用以呈现不同分类水平土壤微生物的群落结构组成和丰度分布^[35]。采用Excel 2010作数据初步处理,用SPSS17.0软件进行显著性检验,采用Duncan’s新复极差法（α=0.05）。

2 结果

2.1 多效唑在土壤及杨梅树体内的积累

P600处理的叶片内积累的多效唑量最大,达到7.83 mg∙kg^-1。P300处理的叶片以及P600和P300处理的枝条内含量次之,且三者没有显著性差异,含量在2.59—3.97 mg∙kg^-1,P150处理的叶片和枝条以及所有处理的根和土壤内积累量很少,与对照没有显著性差异（表1）。说明杨梅树体中叶片最容易积累多效唑,枝条次之,根最少。

Table 1
表1
表1不同多效唑用量在土壤及杨梅树体内的残留量
Table 1The residues of paclobutrazol with different dosage in soil and bayberry

样品 Sample	处理 Treatment	残留量 Residues (mg∙kg-1)	样品 Sample	处理 Treatment	残留量 Residues (mg∙kg-1)
土壤 Soil	P0	0c	枝条 Twig	P0	0c
	P150	0.39±0.11c		P150	0.01±0.00c
	P300	0.48±0.14c		P300	2.59±1.59b
	P600	0.93±0.47c		P600	3.97±0.57b
根 Root	P0	0c	叶 Leaf	P0	0c
	P150	0.17±0.07c		P150	0.39±0.33c
	P300	0.60±0.15c		P300	3.17±2.31b
	P600	0.93±0.21c		P600	7.83±2.65a

同列数据上不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同
The different lowercase letters in the same column show significant difference at the level of 0.05. The same as below

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2.2 土壤酶活性

过氧化氢酶广泛存在于土壤和生物体内,能有效防止土壤代谢过程中产生的过氧化氢对生物体造成的毒害。P150处理的土壤过氧化氢酶活性相比对照没有显著性差异,但是P300和P600的过氧化氢酶活性显著降低,分别降低8.89%和14.44%（表2）。说明高浓度多效唑处理后杨梅树体受到的过氧化氢毒害可能加重。

Table 2
表2
表2施用多效唑后杨梅土壤内活性酶的活性
Table 2The soil enzymes activity of bayberry after the application of paclobutrazol

处理 Treatment	过氧化氢酶 Catalase (mL·g-1)	磷酸酶 Phosphatase (mg·g-1·d-1)	蔗糖酶 Sucrase (mg·g-1·d-1)	纤维素酶 Cellulase (mg·g-1)
P0	0.90±0.08ab	7.53±0.19a	0.87±0.09b	0.41±0.04b
P150	1.11±0.07a	6.16±0.23a	1.57±0.09a	0.26±0.03c
P300	0.82±0.08b	1.74±0.74b	1.41±0.11a	0.52±0.02a
P600	0.77±0.05b	2.78±0.75b	1.39±0.24a	0.21±0.03c

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土壤中磷酸酶可参与土壤有机磷转化为无机磷,积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。P150处理的土壤磷酸酶活性相比对照没有显著性差异,但是P300和P600的磷酸酶活性显著降低,分别降低76.89%和63.08%（表2）。说明高浓度多效唑可能抑制杨梅对磷肥的吸收。

蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶,为土壤生物体提供充分能源,其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。P300和P600处理的土壤蔗糖酶活性相比对照显著升高,升高幅度在59.80%—80.50%。说明高浓度的多效唑增强了杨梅对有机碳的分解转化能力。

纤维素酶催化土壤中的短物残体水解成纤维二糖,纤维二糖再分解成葡萄糖,是碳循环中的一个重要酶。施用多效唑土壤的纤维素酶活性相比对照差异显著,P300处理的酶活性比对照显著升高26.80%,而P150和P600处理的土壤酶活性相比对照显著降低,分别降低了36.59%和48.78%（表2）。说明多效唑浓度对纤维素酶活性影响没有明显的规律。

2.3 Alpha多样性分析

丰富度指数Chao1以及群落多样性指数Shannon数值越高,表明丰富度及多样性越高。多效唑施用后,根围土和根内的细菌Chao1、Shannon指数均明显下降,但是根表土的Chao1指数、Shannon指数却明显升高。而枝条和叶片内的Chao1指数、Shannon指数均较小,且施用前后没有明显差异或者差异较小（表3）。根围土和叶片内的真菌Chao1指数以及根围土和根内的真菌Shannon指数明显升高,而根表土、根、枝的真菌Chao1指数以及根表土、枝的真菌Shannon指数明显降低（表3）。说明杨梅施用多效唑后,根围土的细菌多样性和丰富度明显降低,真菌多样性和丰富度明显升高,而根表土内的细菌多样性和丰富度明显升高、真菌多样性和丰富度明显降低,根内的细菌多样性和丰富度以及枝内的真菌多样性和丰富度均明显降低,枝条和叶片内细菌相对数量较少。

Table 3
表3
表3细菌和真菌Alpha多样性指数
Table 3Alpha diversity index of bacteria and fungi

样品 Sample	细菌Bacteria		真菌Fungi
	Chao1	Shannon	Chao1	Shannon
SF0	901.79	7.44	232.11	3.68
SFP	918.46	8.28*	99.90#	1.02#
BS0	986.33	7.86	23.10	0.21
BSP	784.70#	7.25	200.39*	3.95*
R0	904.40	5.94	80.70	2.22
RP	615.38#	3.66#	63.03#	2.62*
T0	14.40	0.50	205.29	4.00
TP	7.80#	0.68*	93.47#	1.74#
L0	5.00	0.30	151.61	3.03
LP	5.00	0.39*	179.78*	3.00

^#和*分别表示多效唑处理与对照差异显著（P<0.05）
^# and * indicate that the Chao1 and Shannon in paclobutrazol treated trees was significantly different with control trees (P<0.05), respectively

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2.4 Bata多样性分析

通过分析不同样品的OTU组成可以反映样品间的差异和距离,如样品群落结构越相似,反映在PCA图中的距离越近（图1）。由图1-A可知,多效唑处理过的根围土（BSP）、根表土（SFP）、根（RP）与对照根围土（BS0）、根表土（SF0）、根（R0）之间距离较远,而多效唑处理过的枝（TP）和叶（LP）与对照的枝（T0）叶（L0）之间距离较近,细菌提取的2个主成分的贡献率分别为34.36%、24.47%,杨梅根（R0和RP）主成分1轴的负轴、正轴均有分布,根表土（SF0和SFP）及根围土（BS0和BSP）均分布在主成分1轴的负轴。表明在施用多效唑后,根围土、根表土以及根中的细菌群落结构发生较大改变,而枝和叶中细菌群落结构相似。

图1

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图1细菌（A）及真菌（B）群落结构的PCA分析

BS：根围土壤;SF：根表土壤;R：根;T：枝条;L：叶
Fig. 1PCA analysis of bacterial (A) and fungal (B) community structure

BS: Bulk soil; SF: Root surface soil; R: Root; T: Twig; L: Leaves


由图1-B可知,多效唑处理过的根围土（BSP）、根表土（SFP）、枝（TP）与对照根围土（BS0）、根表土（SF0）、枝（T0）之间距离较远,显示明显的离分,而多效唑处理过的根（RP）和叶（LP）与对照根（R0）、叶（L0）之间距离较近;真菌提取的2个主成分的贡献率分别为25.81%、22.86%,根围土（BS0和RP）及根表土（SF0和SFP）均分布在主成分1轴的正轴,叶片（L0和LP）及枝条（T0和TP）均分布在主成分1轴的负轴。可见多效唑处理后,根围土、根表土及杨梅树体枝条的真菌群落结构发生较大改变。

2.5 细菌群落结构组成分析

2.5.1 门水平群落结构分析 细菌门分类水平群落结构组成如图2-A所示,在杨梅根以及根表、根围土壤中,优势菌门（相对丰度>2%）主要有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）。与对照相比,施用多效唑后,杨梅根以及根表、根围土壤变形菌门的相对丰度都分别提高了1.69倍、57.55%、50.16%;酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门的相对丰度都有所降低,降低了8.76%—99.32%,其中根、根表土中的厚壁菌门显著降低了99.32%、89.08%;而拟杆菌门在杨梅根中的相对丰度降低了9.54%,在根围、根表土壤中分别提高了1.45倍、3.96倍。可见施用多效唑明显提高了杨梅根以及根围、根表土壤中变形菌门的相对丰度,而酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门的相对丰度都明显降低;在根围、根表土壤中拟杆菌门的相对丰度有明显升高,而在杨梅根中与之相反。

图2

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图2细菌门（A）纲（B）属（C）水平相对丰度分布图

Fig. 2The relative abundance distribution of bacterial at the phylum (A), class (B) and genus (C) level



叶片和枝条中由于细菌数量很少,而枝条中优势菌门（相对丰度>2%）有变形菌门、酸杆菌门、放线菌门。施用多效唑后,枝条中变形菌门相对丰度降低了77.78%,酸杆菌门未检测到,而放线菌门的相对丰度提高了1.22倍。可见多效唑处理后,枝条中变形菌门的相对丰度有明显降低,放线菌门相对丰度明显升高。

2.5.2 纲水平群落结构分析 细菌纲分类水平群落结构组成如图2-B所示,在杨梅根以及根围、根表土壤中,优势菌纲（相对丰度>2%）主要有α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteriia）、放线菌纲（Actinobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）。与对照相比,施用多效唑后,杨梅根以及根表、根围土壤中α-变形菌纲和γ-变形菌纲提高了19.25%—259.34%,其中根部γ-变形菌纲增加最多;酸杆菌纲、放线菌纲、芽孢杆菌纲、纤线杆菌纲降低了4.66%— 99.44%,其中根部芽孢杆菌纲降低最多;而拟杆菌纲在根表、根围土壤中分别增加了1.4倍和4.55倍,在根中降低了15.74%。因此,施用多效唑后明显提高了杨梅根以及根表、根围土壤中α-变形菌纲和γ-变形菌纲的相对丰度,而重要的生防类菌芽孢杆菌纲在根中显著减少。

枝条中优势菌纲（相对丰度>2%）有α-变形菌纲、γ-变形菌纲、酸杆菌纲和放线菌纲。未施用多效唑时,枝条中α-变形菌纲、酸杆菌纲的相对丰度分别为3.33%、3.33%;施用多效唑后,枝条中α-变形菌纲、酸杆菌纲均未检测到,而γ-变形菌纲的相对丰度明显降低了72.22%,放线菌纲增加了11.11%。说明施用多效唑可以明显降低枝条中α-变形菌纲、酸杆菌纲和γ-变形菌纲的相对丰度,增加了放线菌纲相对丰度。

2.5.3 属水平群落结构分析 在杨梅根中,优势菌属（相对丰度>2%）主要为乳球菌属（Lactococcus）、节杆菌属（Arthrobacter）、柄杆菌属（Caulobacter）。与对照相比,施用多效唑后,在根表土壤中优势菌属（相对丰度>2%）主要为乳球菌属、Acidibacter,与对照相比,施用多效唑后根表土壤中乳球菌属和Acidibacter属的相对丰度都分别降低了89.18%、37.71%。在根围土壤中,优势菌属（相对丰度>2%）主要为乳球菌属和伯克霍尔德菌属（Burkholderia）,与对照相比,施用多效唑处理后根围土壤中伯克霍尔德菌属的相对丰度明显增加了2.99倍,而乳球菌属降低了72.32%,其相对丰度明显降低;杨梅根中乳球菌属、节杆菌属、柄杆菌属的相对丰度分别降低了99.96%、99.97%、99.05%。枝条中优势菌属（相对丰度>2%）为伯克霍尔德菌属和诺卡氏菌属（Nocardia）,施用多效唑后,伯克霍尔德菌属的相对丰度相比对照增加了11.11%,而诺卡氏菌属未检测到（图2-C）。由此可知,施用多效唑后在根围土壤和枝条样品中可以明显增加伯克霍尔德菌属的相对丰度,乳球菌属和诺卡氏菌的相对丰度分别在根围土壤和枝条样品中明显降低。

2.6 真菌群落结构组成分析

2.6.1 门水平群落结构分析 在真菌门分类水平中（图3-A）,优势菌门（相对丰度>2%）仅有子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）。与对照相比,施用多效唑处理后,根表、根围土壤中子囊菌门的相对丰度分别提高了26.74%、6.64倍,可见根围土壤中子囊菌门的相对丰度有明显的提高;而根表、根围土壤中的担子菌门分别降低了83.55%、63.73%,根中子囊菌门、担子菌门的相对丰度分别降低了8.09%、97.78%。叶片和枝条中子囊菌门的相对丰度分别降低了7.74%、63.74%,担子菌门分别提高了9.67%和16倍。说明施用多效唑后,根围土壤和根表土壤的子囊菌门相对含量升高,但是根、枝和叶相对含量降低;根围土壤、根表土壤和根内担子菌门的相对含量显著降低,而枝和叶的担子菌门相对含量显著升高。

图3

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图3真菌门（A）纲（B）属（C）水平相对丰度分布图

Fig. 3The relative abundance distribution of fungal at the phylum (A), class (B) and genus (C) level



2.6.2 纲水平群落结构分析 在真菌纲分类水平中（图3-B）,根围土中优势菌纲（相对丰度>2%）仅有伞菌纲（Agaricomycetes）,与对照相比,多效唑处理后其相对丰度明显降低了68.17%。在根表土中优势菌纲（相对丰度>2%）有粪壳菌纲（Sordariomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）,多效唑处理后,粪壳菌纲的相对丰度相比对照提高了96.28%,而伞菌纲、散囊菌纲、锤舌菌纲的相对丰度分别降低了81.56%、97.93%、96.19%。在杨梅根中,优势菌纲（相对丰度>2%）有粪壳菌纲、伞菌纲,与对照相比,多效唑处理后杨梅根中粪壳菌纲、伞菌纲的相对丰度分别降低了16.49%、98.74%。在枝条中,优势菌纲（相对丰度>2%）有粪壳菌纲、座囊菌纲（Dothideomycetes）、外担菌纲（Exobasidiomycetes）、散囊菌纲,与对照相比,多效唑处理后粪壳菌纲、座囊菌纲、散囊菌纲的相对丰度都分别降低了99.60%、8.37%、99.54%,外担菌纲的相对丰度提高了24.33倍。在叶片中,优势菌纲（相对丰度>2%）有座囊菌纲、外担菌纲,多效唑处理后,座囊菌纲的相对丰度相比对照降低了0.98%,而外担菌纲的相对丰度提高了10.08%。总体来说,施用多效唑后,根围土、根表土和根中的伞菌纲相对含量均明显降低,而枝和叶中座囊菌纲相对含量显著降低,外担菌纲显著升高。

2.6.3 属水平群落结构分析 在真菌属分类水平中（图3-C）,在根围土中优势菌属（相对丰度>2%）有蛙粪霉属（Basidiobolus）、裸脚伞属（Gymnopus）,与对照相比,多效唑处理后蛙粪霉属、裸脚伞属的相对丰度提高了36.49倍、29.62倍。在根表土中,优势菌属（相对丰度>2%）有Thozetella,多效唑处理后,Thozetella属的相对丰度相比对照提高了176.85倍。杨梅根中优势菌属（相对丰度>2%）有Thozetella,多效唑处理后,Thozetella属的相对丰度相比对照降低了63.57%。在枝条中,优势菌属（相对丰度>2%）有Acaromyces、平脐疣孢属（Zasmidium）、青霉属（Penicillium）、球腔菌属（Mycosphaerella）、枝孢属（Cladosporium）,与对照相比,多效唑处理后的Acaromyces、平脐疣孢属相对丰度分别提高了24.46倍、51.11%,青霉属、球腔菌属、枝孢属分别降低了99.53%、78.22%、99.30%,其相对丰度都有明显的降低。叶片中的优势菌属（相对丰度>2%）有Acaromyces、平脐疣孢属、青霉属、球腔菌属、铁艾酵母属（Tilletiopsis）,多效唑处理后,Acaromyces、球腔菌属的相对丰度相比对照分别提高了20.04%、13.46%,平脐疣孢属、青霉属、铁艾酵母属的相对丰度都分别降低了17.05%、90.19%、42.07%。由此可知,多效唑的施用使根围土、根表土和根内的属变化趋势不一致,而枝和叶片条Acaromyces的相对含量显著升高,青霉属的相对含量显著降低。

3 讨论

多效唑抑制杨梅的营养生长,这与抑制马铃薯的生长^[36]相一致。本研究结果显示多效唑在杨梅根围土、根表土以及根、枝、叶内均有残留,叶片内残留量最大,枝条次之,根内积累量较少,与土壤内的残留量相当,叶片内高残留量可能是引起叶片皱缩的主要原因。

土壤酶活性可以反映土壤质量和养分状况^[37]。前人研究发现施用生物型肥料、微生物菌剂可显著提高土壤中脲酶、蔗糖酶和磷酸酶的酶活性^[38,39]。本研究发现高浓度多效唑处理的土壤磷酸酶活性相比对照显著降低,这可能是因为多效唑对磷酸酶相关合成菌株具有抑制作用,说明多效唑可能抑制杨梅对磷肥的吸收,这与施用生物型肥料、微生物菌剂可显著提高土壤中磷酸酶的酶活性结果相反^[38,39],施用生物型肥料和微生物菌剂可以改良多效唑施用过多的土壤。多效唑处理后的土壤蔗糖酶活性相比对照显著升高,说明多效唑浓度大时增强了杨梅对有机碳的分解转化能力,这与施用生物型肥料、微生物菌剂可显著提高土壤中蔗糖酶活性相一致^[38,39]。

多效唑使用浓度的不同会影响土壤菌群结构的α多样性指数^[40]。本研究结果表明,施用多效唑后杨梅根围土的细菌多样性和丰富度明显降低,真菌多样性和丰富度明显升高;而根表土内的细菌多样性和丰富度明显升高,真菌多样性和丰富度明显降低,这可能是多效唑的施用影响了土壤中的菌群结构,与前人研究结果相似。

植物的生长环境和细菌群落结构相互影响,生物有机肥料施用后细菌群落结构的优势菌群大多都为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门等^[18,41-42]。在细菌群落结构组成分析中发现,优势菌门有变形菌门、酸杆菌门、放线菌门等,这与前人研究结果一致。杨梅根围、根表土壤和根中的变形菌门相对丰度最高,且都在施用多效唑处理后有不同程度的增加。变形菌大多为革兰氏阴性菌,其中许多细菌负责固氮,可增加土壤中的氮素营养,所以变形菌的增加可能促进植物生长^[43]。而在杨梅叶片和枝条中,放线菌门的相对丰度明显降低。放线菌可以抑制植物病害的发生,放线菌含量的降低可能会使病原菌更容易侵染植物^[12],这可能是杨梅施用多效唑后抗病性降低的原因之一。杨梅根以及根表、根围土壤中的优势菌纲主要有α-变形菌纲、γ-变形菌纲、酸杆菌纲,这与朱英波等^[44]研究黑龙江大豆田土壤细菌中的优势类群有α-变形菌纲、γ-变形菌纲及酸杆菌群等结果相一致。α-变形菌纲属于变形菌门的一个纲,是陆地土壤中的优势菌群^[45],γ-变形菌包括很多动植物病原菌,同时也存在很多抑制植物致病菌的有益菌^[44]。本研究中施用多效唑后明显提高了杨梅根中γ-变形菌纲的相对丰度,杨梅根中的γ-变形菌纲很可能是有害菌,需要进一步研究其生物学功能。很多芽孢杆菌属、假单胞菌属能抑制土传病害,促进植物生长,施用多效唑导致根围、根表土的芽孢杆菌属、假单胞菌属等种类显著减少,这可能造成土壤中有害菌大量繁殖,对杨梅的生长不利,使树体抗病性降低,与前人研究结果一致^[46]。

植物生长环境和真菌群落结构相互影响,子囊菌和担子菌是土壤中重要的分解者,子囊菌门真菌大多数为腐生菌,多进行腐生或寄生,也包括多种病原菌和有害菌属^[47,48]。本研究中,多效唑处理明显提高了根围和根表土壤中子囊菌门的相对丰度,可能会引起杨梅病害的发生。优势菌纲主要有粪壳菌纲、伞菌纲、散囊菌纲、座囊菌纲等,这与木瓜、马蔺、葡萄、大豆、玉米^[49]和黄土高原不同种植类型梯田之间^[50]土壤真菌纲相似。多效唑的施用使根围和根表土壤及杨梅根、枝、叶的真菌菌群结构和数量发生了明显的变化,明显降低了叶片及枝条中青霉属的相对丰度,有研究表明,青霉菌包含的菌株多数为致病菌^[51],所以多效唑的施用可能会减少由青霉菌引起的杨梅病害。多效唑的施用改变了杨梅根围、根表土壤及树体的核心菌群,其对杨梅的生长以及抗病功能的影响需要进一步深入研究。

4 结论

施用多效唑后,梅叶片中积累多效唑含量最大,显著降低了土壤中过氧化氢酶、磷酸酶活性,提高了蔗糖酶活性;提高了根表土的细菌多样性,降低了根围土和根的细菌多样性,而根围土真菌多样性和丰富度明显升高,根表土内真菌多样性和丰富度明显降低,根内生细菌多样性、丰富度和枝内生真菌多样性及丰富度均明显降低。在细菌群落结构中,施用多效唑后,提高了杨梅根以及根围、根表土壤中变形菌门的相对丰度,而放线菌门、厚壁菌门都明显降低,枝条、叶片与之相反;明显提高了杨梅根内生γ-变形菌纲的相对丰度以及根围土壤中伯克霍尔德菌属的相对丰度。在真菌群落结构中,施用多效唑后,根围土中子囊菌门、枝条中担子菌门、根表土中粪壳菌纲、枝条中外担菌纲,根表土中Thozetella的相对丰度均明显提高,而根中的粪壳菌纲,根围土中的伞菌纲,枝条中青霉属以及Cladosporium都出现明显降低。研究结果对评价多效唑对土壤及杨梅树体微生物生态系统的影响有重要的指导意义,有利于指导科学施用多效唑,为开发有效恢复多效唑过量施用引起的杨梅树势早衰技术提供了菌株和理论基础。

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