0 引言
【研究意义】番茄枯萎病是由番茄尖镰孢番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的一种维管束疾病,现已成为影响番茄生产和品质的重要土传病害。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是重要的植物根围促生细菌（PGPR）,在植物病害生物防治中起重要作用[1]。解淀粉芽孢杆菌B1619菌株是笔者实验室研发的生物杀菌剂发酵菌株之一,能有效防控设施蔬菜枯萎病的发生和危害[2]。芽孢杆菌分泌的脂肽类抗生素是其抑制病原真菌生长的主要抑菌物质之一[3-6],分离与鉴定B1619分泌的脂肽类抗生素,可为应用B1619 生物防控设施茄科蔬菜枯萎病提供依据。【前人研究进展】郝晓娟等[7]发现短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）JK-2菌株对番茄枯萎病有较好的防治效果;詹发强等[8]从大田土壤中分离出一株解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens GU323369.1）近似种,其在土壤及根中有较好的定殖效果,从而能够抑制番茄枯萎病的发生及扩散。解淀粉芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质,解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组测序揭示了其能产生多种防病促生物质[9],戴秀华等[10]发现解淀粉芽孢杆菌Lx-11可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等物质,而脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质[11-12]。脂肽类抗生素包括伊枯草素家簇iturins（iturin A、iturin C、iturin D、iturin E;bacillomycin D、bacillomycin F、bacillomycin L;mycosubtilin）、泛革素家簇fengycins和表面活性素家簇surfactins[4,13-15],但不同种类的脂肽类物质抗菌性能不同,其中iturins和fengycins具有很强的抗真菌活性,而surfactins对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性[5,16-17]。解淀粉芽孢杆菌SWB16分泌的脂肽类抑菌物质fengycins和iturins可以抑制球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的生长[18]。ARREBOLA等[19]从水果表面分离出解淀粉芽孢杆菌PPCBO04,发现其抗菌活性物质为iturinA;乔俊卿等[20]发现B1619在番茄根部定殖能力较强,其还可促进植物生长,抑制线虫[21]、治理水环境污染等。【本研究切入点】生防菌B1619能够有效地防控番茄枯萎病,防治效果达到80%左右,其主要控病作用机理是B1619在植物根部定殖,保护植物不受病菌侵染,诱导植株产生抗病性等[20],现已开发成安全、环保、高效的生物杀菌剂“1.2亿活芽孢/g 解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂”[22]。然而笔者前期发现生防菌B1619分泌的脂肽类抗生素对番茄枯萎病有直接的抑菌作用。【拟解决的关键问题】分离、鉴定B1619分泌的3种脂肽类抗生素,并研究3种脂肽类抗生素对番茄枯萎病菌生长的抑菌活性及其强弱,为推广应用生物杀菌剂B1619防控番茄枯萎病提供依据。1 材料与方法
试验于2015年在江苏省农业科学院植物保护研究所完成。1.1 供试菌种
解淀粉芽孢杆菌B1619菌株、番茄枯萎病菌均为笔者实验室保存。B1619菌株所用培养基为LB（g·L-1）：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。番茄枯萎病原真菌培养基为PDA（g·L-1）：马铃薯200、蔗糖20、pH 7.0,28℃培养。1.2 主要试剂及仪器
所用甲醇、乙腈、三氟乙酸等试剂为色谱纯,DNA Marker、Taq DNA聚合酶、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司,SupelcleanTM LC-18柱由美国色谱科公司生产,PHASE HF-NH2柱由美国安捷伦公司生产。高速冷冻离心机GL-21M购自湖南湘仪离心机仪器有限公司,Agilent 1100高效液相色谱仪和Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪购自美国安捷伦公司,MyCyclerTM梯度PCR仪购自美国BioRad公司,分光光度计购自上海第三分析仪器厂。1.3 脂肽类抗生素合成相关基因克隆
设计扩增sfp、ituA和fenB等基因的引物序列（表1）,引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。提取解淀粉芽孢杆菌B1619基因组DNA,采用PCR方法进行扩增,sfp、ituA以及fenB大小为预期产物大小,分别为 675、1 150和1 400 bp。根据所设计引物的退火温度和扩增片段大小设计PCR扩增反应程序。扩增产物经胶回收试剂盒凝胶回收后,连接至pMD18-T质粒载体,测序在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
Table 1
表1
表1脂肽类抗生素相关基因引物名称和序列
Table 1Primer names and sequences of the lipopeptide antibiotics corresponding genes
| 引物名称 Primer name | 引物长度 Size (bp) | 引物序列 Sequence (5′→3′) |
|---|---|---|
| sfpF | 20 | ATGAAGATTTACGGAATTTA |
| sfpR | 20 | TTATAAAAGCTCTTCGTACG |
| ituAF | 20 | ATGTATACCAGTCAATTCC |
| ituAR | 20 | GATCCGAAGCTGACAATAG |
| fenBF | 20 | CTATAGTTTGTTGACGGCTC |
| fenBR | 20 | CAGCACTGGTTCTTGTCGCA |
新窗口打开
1.4 脂肽类抗生素的分离和纯化
脂肽类粗提物的提取采用酸沉淀和甲醇提取的方法。B1619在LB培养基中培养72 h后离心除去菌体,上清液用浓盐酸调至pH 2.0沉淀过夜。10 000×g离心25 min得到沉淀,沉淀用甲醇抽提2次（甲醇总体积为发酵液体积的1/10）,每次抽提2 h,合并甲醇抽提物。甲醇抽提物减压浓缩后过0.22 µm滤膜,即为脂肽类化合物粗提物。脂肽类抗生素的分离方法参照LUO等[23-24]。将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液,pH调至7.0,然后上样于NH2固相萃取柱,分别用含50%甲醇水溶液,100%甲醇,含0.5%甲酸甲醇溶液,1%甲酸甲醇溶液,2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱,在1%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH调至7.0,氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30%甲醇水溶液,然后上样于C18固相萃取柱;采用3倍柱体积的50%、60%、70%、80%、90%和100%甲醇水溶液梯度洗脱。将60%、70%、80%、90%和100%甲醇水洗脱液氮气吹干浓缩,再经过真空液氮冷冻仪将不同甲醇水洗脱液干燥成粉。
1.5 基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和高效液相色谱（HPLC）检测
为了准确了解菌株产生的脂肽类抗生素种类,对其进行基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱分析。使用337 nm氮激光源解吸附和电离,采用α-氰-4-羟肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）为基质,1 μL样品与等体积的基质混匀,置于仪器离子源进行测定。质量扫描范围为1 000—2 000 Da,方法参考文献[14]。BacillomycinL、sunfactins及fengycins为笔者实验室前期自主制备[23-24],配制成1 mg·mL-1,作为标准样品。HPLC采用C18柱（微粒大小3.5 µm;柱长及柱直径25和41 mm;型号VYDAC 218 TP;VYDAC,Hesperia,CA）;流动相为水﹕乙腈﹕三氟乙酸（60﹕40﹕0.5 V/V;50﹕50﹕0.5 V/V;20﹕80﹕0.5 V/V）;流速为 0.5 mL·min-1;紫外检测波长为210 nm。1.6 脂肽类抗生素对番茄枯萎病菌的抑制作用
将分离的bacillomycin L、sunfactins及fengycins分别配制成浓度为1 mg·L-1的甲醇溶液,与B1619脂肽类抗生素粗提物对比进行抑菌试验;将浓度为1、3和6 mg·L-1的surfactins对番茄枯萎病菌进行抑菌活性试验,观察其对番茄枯萎病菌的抑菌活性。将植物病原真菌点接在PDA平板中央,待菌落生长至直径约2 cm后在菌落的四周分别等距离点接脂肽类物质粗提物与3种抗生素分离物。脂肽类物质加100 μL,用甲醇做对照并设置空白对照,每个处理3个重复。逐日观察并记录。
1.7 统计方法
采用DPS统计软件进行数据统计与分析。2 结果
2.1 B1619菌株脂肽类抗生素合成基因PCR检测
对解淀粉芽孢杆菌B1619 sfp、ituA以及fenB合成基因PCR扩增检测结果见图1,解淀粉芽孢杆菌B1619分别在675、1 150和 1 400 bp左右处出现条带,即能扩增出sfp、ituA以及fenB合成基因。根据分析结果推测解淀粉芽孢杆菌B1619基因组中可能存在surfactins、bacillomycin L、fengycins代谢合成操纵子序列,该菌株可能代谢产生3类脂肽类抗生素。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1PCR扩增脂肽类抗生素相关基因
-->Fig. 1PCR detection of lipopeptiedes related genes
M: DNA marker; 1, 2: sfp; 3, 4: ituA; 5, 6: fenB
-->
2.2 B1619菌株脂肽类抗生素的HPLC检测
将解淀粉芽孢杆菌B1619分泌的脂肽类物质的分离物分别进行HPLC检测,结果表明（参考LUO等[23-24]）,60%甲醇水洗脱分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,与bacillomycin L标准品一致,由此可以进一步确定60%甲醇洗脱分离物是bacillomycin L,其分泌量为18.5 mg·L-1（图2-A）;70%甲醇洗脱分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,与fengycins标准品一致,由此可以进一步确定分离物fengycins,其分泌量为5.1 mg·L-1（图2-B）;100%甲醇洗脱分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,与surfactins标准品一致,由此可以进一步确定100%甲醇洗脱分离物质surfactins,其分泌量为74.3 mg·L-1（图2-C）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2B1619菌株3种脂肽类物质的HPLC图
-->Fig. 2HPLC for the lipopeptide antibiotics isolated from B1619
-->
2.3 脂肽类抗生素的质谱检测
将解淀粉芽孢杆菌B1619分泌的3种脂肽类抗生素的分离物进行基质辅助解离质谱法测定,B1619产生的3种抗生素对应的特征峰如表2所示。解淀粉芽孢杆菌B1619的60%甲醇水洗脱液分离物经检测,发现其峰值m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,相差14 Da,它们为脂肪酸链相差1个亚甲基（-CH2-）的同系物,属于C13—C15的bacillomycin L钠离子加合峰;70%甲醇水洗脱液分离物信号谱带在m/z=1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9 Da,对应C16和C17的fengycins,不同的是肽环上6位氨基酸不同,分别为Ala和Val;100%甲醇水洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,它们属于C13—C15的surfactins的质子加合峰（图3）。脂肽类物质质谱峰的分析参考VATER等[25-26]。
Table 2
表2
表2B1619菌株粗提液中脂肽类抗生素surfactins、iturins以及fengycins分子质量测定
Table 2Calculated mass values of bacillomycins, fengycins and surfactins in culture lipopeptides extracts from B1619
| 脂肽类抗生素 Lipopeptides | 分子量 Mass value | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| M | M+H+ | M+Na+ | |||
| 表面活性素 Surfactins | Surfactin A (C13) | 1007.6 | 1008.6* | 1030.6* | |
| Surfactin B (C14) | 1021.7 | 1022.6* | 1044.7* | ||
| Surfactin C (C15) | 1035.7 | 1036.7* | 1058.6* | ||
| 伊枯草素 Iturins | Bacillomycin L (C13) | 1020.5 | 1021.5 | 1043.4* | |
| Bacillomycin L (C14) | 1034.5 | 1035.5* | 1057.6* | ||
| Bacillomycin L (C15) | 1048.5 | 1049.5* | 1071.4* | ||
| 泛革素 Fengycins | Fengycin A (C15/Ala-6) | 1448.8 | 1449.8* | 1471.8 | |
| Fengycin B (C16/Ala-6) | 1462.8 | 1463.8* | 1485.7* | ||
| Fengycin C (C17/Ala-6) | 1476.8 | 1477.7* | 1499.8 | ||
| Fengycin D (C16/Val-6) | 1490.9 | 1491.8* | 1513.9 | ||
| Fengycin E (C17/Val-6) | 1504.9 | 1505.9* | 1527.8* | ||
新窗口打开
2.4 对番茄枯萎病菌的抑菌活性
1 mg·mL-1的脂肽类抗生素粗提物以及3种脂肽类抗生素的分离物对番茄枯萎病菌的抑菌活性见图4,结果表明,3种脂肽类抗生素的分离物中fengycins对番茄枯萎病菌的抑制效果较好图（4-A-2）,bacillomycin L活性次之（图4-A-1）,而surfactins（图4-A-3）对番茄枯萎病菌没有明显的抑制作用,脂肽类抗生素总粗提物对番茄枯萎病菌的抑制效果较以上三者更为明显（图4-A-4）。浓度为1、3和6 mg·mL-1的surfactins对番茄枯萎病菌活性试验表明,在低浓度1 mg·mL-1（图4-B-1）和3 mg·mL-1（图4-B-2）条件下对番茄枯萎病菌的抑制作用没有明显变化,在高浓度6 mg·mL-1条件下对番茄枯萎病菌有较弱的抑制作用（图4-B-3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3B1619菌株3种脂肽类物质MALDI-TOF-MS检测图
A：Bacillomycin L质谱图Spectra of bacillomycin L;B、C：Surfactins 质谱图Spectra of surfactins;D—F：Fengycins质谱图Spectra of fengycins;G：B1619全扫描质谱图 Full scan mass spectra of B1619
-->Fig. 3MALDI-TOF-MS for the lipopeptide antibiotics isolated from B1619
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4B1619菌株3种脂肽类物质对番茄枯萎病菌的抑菌效果
A：1、2、3、4分别代
-->Fig. 4The inhibition effect of the three lipopeptides antibiotics on F. oxysporum
-->
3 讨论
解淀粉芽孢杆菌可以产生种类繁多的次级代谢产物,主要在非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）的组织下合成,这些产物可以抑制植物根际中的有害细菌和真菌[27]。本研究发现在解淀粉芽孢杆菌生防菌株B1619的NRPS途径中至少产生3种具有抑制番茄枯萎病菌生长的物质,bacillomycin L、fengycins和surfactins。目前国内外对芽孢杆菌脂肽类物质的研究越来越广泛,多数研究者认为iturins和fengycins具有很强的抗真菌活性,而surfactins对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性。ROMERO等[4]从枯草芽孢杆菌（B. subtilis）UMAF6614发酵液中提取到iturins、surfactins、fengycins 3类脂肽类抗生素,其中iturins和fengycins对植物病原真菌Podosphaera fusca起主要抑制作用。对桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）抑菌试验的研究中发现,在解淀粉芽胞杆菌C06菌株同时产生的脂肽类抗生素bacillomycin D和fengycins中[28],以及在枯草芽孢杆菌CPA-8菌株产生fengycins、iturin A和surfactins[29]等多种脂肽类抗生素中,fengycins均发挥主要的作用。在本研究中分离到fengycins,当其浓度为1 mg·mL-1时,对番茄枯萎病菌就有非常明显的抑制作用,其抑菌作用仅次于脂肽类抗生素粗提物。
王雅等[30]在枯草芽孢杆菌Bv10胞外抗菌物质中纯化到iturin A2和iturin A4,两者对芝麻白绢病菌（Sclerotium rolfsii）的抑菌中浓度EC50分别为36.79和43.03 mg·L-1。从枯草芽孢杆菌M51中分离到脂肽类抗生素iturin A2,当其使用浓度为100 µg·g-1土时就能完全抑制番茄枯萎病菌对番茄的侵染[31]。罗楚平等[3]发现枯草芽孢杆菌Bs916分泌的bacillomycin L能使病原真菌菌丝致畸和抑制孢子萌发,当浓度为500 µg·mL-1时,其对水稻纹枯病和苗瘟的防治效果分别为71%和56%。在本研究中分离到bacillomycin L,当bacillomycin L浓度为1 mg·mL-1时,对番茄枯萎病菌也有明显的抑制作用。从平板抑菌试验结果发现,fengycins的抑菌活性强于bacillomycin L,但是从HPLC及MALDI-TOF-MS结果分析发现,bacillomycinL的分泌量为fengycins的3.6倍,因此,bacillomycin L和fengycins在B1619抑制番茄枯萎病菌中都起相当重要的作用。
本研究发现surfactins在解淀粉芽孢杆菌B1619中的分泌量较高,但其对番茄枯萎病菌生长的抑制菌活性较弱,这与其他研究结果类似,但其在生防中的其他重要作用不可小觑,是解淀粉芽孢杆菌发挥生防作用的重要基础物质。Surfactins具有较强的表面活性并与细菌生物膜的形成有关,它的表面活性作用可以促进生防菌株在植株上的定殖及扩展[23-24]。BAIS等[32]报道的枯草芽孢杆菌6051分泌的surfactins能使该菌株更好地定殖在拟南芥根部,抵抗丁香假单胞菌的入侵。ONGENA等[33-34]发现,surfactins可以诱导大豆和番茄产生抗病性。任鹏举等[35]也发现芽孢杆菌分泌surfactins对烟草花叶病毒的防治效果显著,且能诱导烟草产生诱导系统抗性。张荣胜等[36]发现解淀粉芽孢杆菌Lx-11粗提物中含有surfactins、bacillomycin D和fengycins等3种脂肽类抗生素,surfactins对水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）具有较强的抑制作用,是抑制条斑病菌主要物质之一。
在脂肽类抗生素的制备分离中,较常用的为色谱法。别小妹等[37]利用RP-C18柱进行HPLC 分离纯化,并采用硅胶板进行TLC分析,对枯草芽孢杆菌fmbR抗菌物质进行了有效的分离纯化。但此法常用于高纯度脂肽抗生素的分析和制备,但规模小、成本高。本研究利用SupelcleanTM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱,以甲醇为洗脱液对脂肽类抗生素粗提物进行分离,用此方法分离的脂肽类抗生素的产量较高,而且吸附柱可以通过再生得到重复利用,从而有效降低生产成本。SUN等[38]利用Sephadex LH-20柱,对解淀粉芽孢杆菌ES-2产生的surfactins和fengycins进行提纯;另外,MUKHERJEE等[39]利用Sephadex G-50将脂肽类抗生素与杂质分离;用XAD-2作吸附色谱柱,也可以从发酵上清液中分离出surfactin类似物的粗产物[40]。
国内外对芽孢杆菌脂肽类化合物的研究已从纯化、特性和鉴定深入到遗传、代谢和机理改造等方面。如通过将脂肽类化合物内源启动子更换为强启动子,构建工程菌株,iturin A表达量提高了3倍,mycosubtilin表达量提高了15倍[3,41]。本研究分析了B1619分泌的脂肽类化合物的种类及抑菌作用,为其今后的开发和应用推广提供理论依据,并为进一步采用基因工程的手段改良生防芽孢杆菌菌株,大幅度提高脂肽类化合物分泌量,特别是脂肽类化合物调控机制的研究打下了基础。
4 结论
通过甲醇梯度洗脱的方法对解淀粉芽孢杆菌B1619菌株分泌的3类主要脂肽类抗生素进行了有效的分离,通过HPLC和 MALDI-TOF-MS分析验证了 B1619产生的3种脂肽类物质,其中在对番茄枯萎病菌的抑制作用中起重要作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。The authors have declared that no competing interests exist.
