0 引言
【研究意义】随着全球气候温室效应的不断加剧及高集中化的动物生产方式,热应激对动物生产造成了严重的不利影响,其作为机体处于湿热环境下的一种非特异性反应,当气温高于32℃或温湿指数（temperature-humidity index, THI）高于72时动物就会发生热应激反应[1-2]。目前,热应激已经成为中国畜禽养殖业中重要的疾病之一。热应激不仅会导致奶牛生产性能和繁殖能力降低,还能引起一些血液激素及热休克蛋白70（HSP70）浓度的变化。【前人研究进展】宋代军等[3]通过对不同泌乳阶段奶牛生产性能、HSP70浓度的研究,发现热应激时各泌乳阶段奶牛的产奶量均显著低于非热应激期,且随着热应激时间的延长,各泌乳阶段奶牛的产奶量有逐渐降低的趋势,并且在泌乳前、中、后期奶牛血清HSP70浓度在热应激期时均明显高于非热应激期。也有研究报道,当动物机体处于热应激状态时,其下丘脑-垂体-肾上腺轴会变得异常活跃,并且使促生长激素释放激素（GHRH）、生长激素（GH）等激素的含量升高,进而促进糖原、脂肪分解和糖异生过程[4]。艾阳等[5]通过研究夏季饲养的泌乳奶牛,发现当奶牛处于南京这种高温梅雨季节状态下时,可引起泌乳奶牛发生热应激反应,表现为乳产量和乳品质下降。GH是参与反刍动物泌乳和合成代谢的重要激素,在动物体内,GH通过与其受体结合发挥作用,具有维持体内环境稳态和免疫等生理功能。研究发现,GH可以通过促进腺泡的发育,维持泌乳量[6],其还可以刺激肝脏合成分泌大量的胰岛素样生长因子（IGF-I）[7-8]。并且有研究发现血液中IGF-I含量与泌乳量呈正相关[9]。糖异生是指由非糖物质转化为葡萄糖或糖原的过程,其过程主要发生在肝细胞中,其中丙酮酸羧化酶（PC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是调控糖异生的关键酶。有****提出泌乳奶牛糖异生过程会受到GH-IGF-I的调节,当发生热应激时血液中GH、IGF-I水平升高并且会上调肝脏的糖异生途径[10]。【本研究切入点】目前,国内外对奶牛热应激机理的研究已有大量的文献报道,并且对生产性能方面也做了大量的研究,表明其会降低泌乳奶牛的乳产量及乳品质,但在糖异生调控方面的机理报道相对较少。【拟解决的关键问题】本试验以早期泌乳奶牛为研究对象,经过南京夏季6月—8月高温高湿气候条件下饲喂。比较研究不同时期泌乳奶牛乳产量、乳蛋白含量,血液中激素水平以及糖异生关键酶指标的变化,拟从GH-IGF-I轴的角度阐明泌乳奶牛发生热应激时对糖异生作用及乳品质下降的机制。为进一步揭示奶牛热应激的发生机理及控制奶牛热应激的发生提供理论依据。1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
SN-695型智能放免γ测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂）;RT-6000型酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。MIKRO-22R型高速冷冻离心机（德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG产品）;组织匀浆器（瑞士Kinematica AG）;核酸浓度测定仪（德国Eppendorf Biophotometer）,MyiQ2 Real-time PCR 仪（Bio Rad,美国）等。SYBR Green 荧光酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）;P101型RNA反转录试剂盒（诺唯赞生物科技有限公司,南京）。生长激素放射免疫分析试剂盒（北方生物技术研究所,北京）;胰岛素样生长因子-1ELISA试剂盒（中国朗顿生物科技有限公司,上海）。
1.2 试验动物与处理
分娩一周后的早期泌乳期荷斯坦奶牛6头（体重（490±7）kg）,饲养于南京农业大学江浦畜牧兽医实验站（北纬32°93′,东经119°82′）。适应期1周后,对奶牛进行试验饲料饲喂,饲喂时间从2013年6月29日至2013年8月5日南京暑热期间,试验周期为35 d（共5周）。采用Cornell-Penn-Miner System（NRC 2001）设计基础日粮,饲料配方及具体营养成分见表1。6头奶牛均饲养于开放式牛舍,期间自由饮水,每日饲喂3次的同时挤奶（时间为早4：00,中午12：00和晚18：00）,并记录每日产奶量。Table 1
表1
表1日粮营养成分
Table 1The formulation of dietary (%)
| 日粮组成 Diet composition | 营养组成 Nutrient composition | |||
|---|---|---|---|---|
| 玉米青贮 Corn silage | 30.00 | 净能量 static energy(MJ·kg-1) | 6.36 | |
| 苜蓿 Alfalfa | 30.00 | 脂肪 Ether extract | 3.21 | |
| 玉米 Corn | 24.30 | 粗蛋白 Crude protein | 16.99 | |
| 豆粕 Soybean meal | 13.50 | 粗脂肪 Crude fat | 3.93 | |
| 磷酸氢钙 CaCO3 | 0.85 | 中性洗涤纤维 Neutral detergent fibre | 36.54 | |
| 石粉 Limestone | 0 | 酸性洗涤纤维 Acid detergent fibre | 22.51 | |
| 食盐 NaCl | 0.35 | 非纤维性碳水化合物 Non-fibre carbohydrates | 33.76 | |
| 预混料 Premix* | 1.00 | 钙 Calcium | 0.88 | |
| 合计 Total | 100 | 磷 Phosphorus | 0.43 | |
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1.3 气温测定
试验期间每日气温纪录采用室温检测仪,于上午10：00和下午6：00 进行2次测定,2次气温平均值记为每天日间气温,试验期间日间气温介于26—38℃之间。1.4 产奶量和乳成分测定
试验期间每天在奶牛进食后采用自动挤奶机进行挤奶,早、中、晚共3次并分别称重,总和即为每日产奶量。期间每周五采集全天乳样,按体积4﹕3﹕3将早、中、晚奶样混合加入200 μL饱和重铬酸钾作为全天乳样,送至南京卫岗乳业检测中心进行乳成分检测。1.5 血液样品的采集及葡萄糖含量检测
分别于第1天和第35天对泌乳奶牛进行颈静脉采血。采用真空抗凝管于奶牛进食2 h后收集其颈静脉血液,以3 000 r/min离心15 min,取上清。并将收集的颈静脉血浆样品送至南京军区总医院血液科检测葡萄糖的含量。1.6 血液中GH、IGF-I含量的测定
1.6.1 血液中GH含量测定 通过125I-GH放射免疫分析药盒测定泌乳奶牛血液中GH的含量（测定范围1—50 ng·mL-1;灵敏度≤0.5 ng·mL-1,精密度:批内变异系数<10%,批间变异系数<15%,一抗为兔抗）,测定方法严格按照试剂盒说明书进行。SN-695型智能放免γ-测量仪检测计算出血液中GH的含量。1.6.2 血液中IGF-I含量测定 采用ELISA法检测,按试剂盒说明书进行操作（精密度：批内变异系数<9%,批间变异系数<11%）。以空白孔调零,450 nm波长处依次测定各孔的吸光度值（OD值）,并计算出血液中IGF-I的含量。
1.7 肝脏组织样品的采集
在采集血液样品时对奶牛肝脏进行活体穿刺采样。两次采集的肝脏组织样品均先用预冷的生理盐水清洗3次,然后迅速置于液氮中冻存,最后转到-80℃保存待测。1.8 肝脏中相关蛋白基因mRNA表达检测
1.8.1 总RNA的提取及反转录 取80 mg左右的肝脏组织样本,匀浆机彻底匀浆后采用Trizol抽提法提取总RNA。紫外比色法测定所提取RNA的浓度及纯度。选取A260/A280在1.8—2.0之间的总RNA,两步法进行反转录,得到cDNA。1.8.2 引物设计及合成 根据GenBank上牛的HSP70、GHR、IGFR、PC、PEPCK及GADPH的基因序列由Primer Premier 5软件自行设计（序列见表2）,由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
Table 2
表2
表2Real-time PCR所用引物序列及参数
Table 2The primers sequence and parameters for real-time PCR
| 引物 Primers | 基因序列号 Genbank accession number | 引物序列 Primers sequence (5′→3′) | 产物大小 Product length (bp) |
|---|---|---|---|
| GAPDH | NM_001034034.2 | ATCAAGTGGGGTGATGCTGG | 607 |
| TGAAGTCGCAGGAGACAACC | |||
| HSP70 | NM_174550.1 | GCAGTCGGACATGAAGGAGT | 459 |
| CTGTTGTCGAAGTCCTCCCC | |||
| GHR | NM_176608.1 | TGCTCAGCCACAAAGGTTA | 365 |
| CGTTTCCACGATGAAGTTA | |||
| IGFR | NM_001244612.1 | GTCTTCACCACTCACTCTG | 297 |
| CTTGTTCTCCTCGCTGTAG | |||
| PC | NM_177946.4 | TCGCACCATGTATGTCATCCC | 343 |
| AGGCTTTTTTAAAGGCAGAGGG | |||
| PEPCK | XM_004010899.1 | GCGTTCAACGTCCGATTTCC | 140 |
| CATGCTGAACGGGATGACATAC |
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1.8.3 肝脏中相关蛋白Real-time PCR检测 对上述cDNA进一步采用Real-time PCR Sybr Green染料法对相关蛋白基因进行相对定量分析。反应在MyiQ2 Real-time PCR仪上进行,20 μL定量反应体系中包括,荧光酶SYBR-Green 10 μL,10 pmol·μL-1基因引物2 μL,cDNA 模板2 μL,灭菌水6 μL。以最小的Ct值和最高的荧光值及溶解曲线不出现非特异性峰为标准,分别优化退火温度、引物浓度。主反应条件为：95℃变性10 min;95℃变性15 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40个循环。每个样品至少做3个重复,GADPH作为内参基因。
1.9 数据统计及分析
采用SPSS16.0软件进行独立样本t检验。结果以平均数±标准误表示,组间差异用t检验,判断有无显著性差异。2 结果
2.1 试验期间气温变化
由图1可知,经过前期的适应期后,从第1天开始,日间平均气温剧烈上升,总体保持在32℃以上,在35 d（共5周）的试验期中,日间平均气温32℃以上持续时间达25 d,占试验总天数的68.5%。整个试验期间最高温度为38℃,共计2 d。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1试验期间每日平均气温
-->Fig. 1Average daily temperature during the experiment
-->
2.2 热应激对肝脏中HSP70 基因表达的影响
通过检测第1周和第5周泌乳奶牛肝脏中HSP70基因的表达,结果如图2。由图2可知在第5周的时候奶牛肝脏内HSP70 基因表达量显著高于第1周。2.3 热应激对泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量的影响
由图3可知,从第1周开始,日平均产奶量呈现出一个下降趋势,到第4周的时候日平均产奶量达到最低,第5周的时候有所上升,但乳产量随着试验期间温度的升高总体呈下降趋势。日间乳蛋白平均含量在1—5周内随着温度的升高也呈现出总体的下降趋势。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2肝脏中HSP70 mRNA的表达变化
*表示差异极显著（P<0.01）
-->Fig. 2Changes of HSP70 mRNA expression in liver (n=6)
* means markedly significant (P<0.01)
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量
-->Fig. 3Lactation cows milk yield and milk protein content (n=6)
-->
2.4 热应激对血液中葡萄糖及相关激素的影响
通过检测泌乳奶牛血液中葡萄糖、GH、IGF-I激素的含量,结果见表3。由表3可知第5周时奶牛由于发生热应激作用血液中葡萄糖、GH和IGF-I含量均高于第1周,且差异显著。Table 3
表3
表3血液中相关生化指标
Table 3Blood biochemical indices (n=6)
| 第1周 The first week | 第5周 The fifth week | P值 P value | |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖 Glucose (mmol·L-1) | 2.88±0.04 | 3.54±0.11 | 0.030* |
| 生长激素 GH (ng·mL-1) | 1.19±0.03 | 1.54±0.06 | 0.037* |
| 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 (ng·mL-1) | 80.05±10.62 | 100.72±21.78 | 0.048* |
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2.5 热应激对糖异生关键酶基因表达的影响
通过检测第1周和第5周泌乳奶牛肝脏糖异生关键酶基因的表达含量（图4）。由图4可知第5周时奶牛肝脏组织中PC和PEPCK 的mRNA表达均高于第1周,且差异显著。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4肝脏中PC和PEPCK mRNA的表达变化
*表示差异显著（P<0.05）
-->Fig. 4Changes of PC and PEPCK mRNA expressionin liver (n=6)
Means significant (P<0.05)
-->
2.6 热应激对肝脏中GHR和IGFR 基因表达的影响
通过检测第1周和第5周泌乳奶牛肝脏中GHR、IGFR 基因的表（图5）。图5可知,随着奶牛热应激的发生,在第5周的时候肝脏内GHR 、IGFR表达均高于第1周,且IGFR显著高于第1周。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5肝脏中GHR和IGFR mRNA的表达变化
*表示差异显著（P<0.05）
-->Fig. 5Change of GHR and IGFR mRNA expression in liver (n=6)
Means significant (P<0.05)
-->
3 讨论
通常当温度超过耐热温度时奶牛就会发生热应激现象,并且随着温度的升高奶牛也越易发生热应激[11]。但也有研究发现,奶牛的热应激一般除了环境因素外,还会受到其他因素的影响,包括其自身的泌乳状态[12]、管理方式[13]、饲养条件[14]等。目前,按照THI的计算公式：THI=0.81Td+(0.99Td-14.3)RH+ 46.3,若以湿度为0作前提,当温度达到32℃时,THI最低值为72;这一数值即为奶牛发生热应激的最低THI。本试验通过对南京地区夏季6月至8月气温条件进行了监测,得出整个试验期间牛舍的温度数据,结果发现,在35 d的试验期中,日间平均气温在32℃以上的持续时间达25 d,且最高温度为38℃。高温持续时间远远超过72 h,即此气候条件下奶牛处于一个热应激状态。在热应激条件下,机体内分泌机能紊 乱,直接影响奶牛的泌乳性能导致产奶量下降。李建国[15]研究发现,当发生热应激时,泌乳前、中、后期奶牛的产奶量分别降低了19.3%、15.88%、13.83%。RAVAGNOLO等[16]报道,当THI>72时,THI每升高 1个单位,奶牛的产奶量降低0.2 kg。本试验中,通过统计5周的产奶量,发现随着热应激时间的延长,其产奶量及乳蛋白含量都有不同程度的下降,与前人的研究一致。HSP70是一种重要的分子伴侣,ALDERMAN等[17]报道,HSP70与环境温湿变化密切相关,在生物热耐受中起着主要作用。当环境变化产生应激时,产生的HSP70可以增强细胞对下一次有害损伤的耐受程度,维持细胞的正常生理功能代谢,提高细胞生存率[18-19]。陈强[20]等报道,热应激状态时,奶牛体内HSP70基因的表达量会增加。本试验中,HSP70基因表达量在第5周时极显著高于第1周。结果提示,随着奶牛热应激时间的增长,泌乳奶牛对热应激过程抵抗损失的能力也更强。
有研究认为,血液中的代谢产物对机体生理状况变化十分敏感,可以反映动物机体的代谢变化和组织的生理功能[21]。奶牛作为一种反刍动物,其血液中葡萄糖无法由食物获取,主要来源于肝脏内的糖异生活动。SCHARF[22]等报道急性热应激可以影响奶牛糖代谢并升高血液中葡萄糖含量,弥补热应激时的能量不足。同样也有研究发现当热应激发生时,泌乳奶牛很难从食物中获得足够的能量,必须通过糖异生作用生成葡萄糖,并且这些由多糖直接分解产生的葡萄糖会直接用于泌乳[23-24]。本试验中,随着热应激时间的延长,第5周奶牛血液中葡萄糖浓度显著高于第1周,并且在第5周时奶牛肝脏组织中糖异生关键酶PC和PEPCK与第1周相比表达均显著上调,提示热应激通过上调糖异生作用增加了血液中葡萄糖的含量。
1993年BAUMAN等[25]发现,当给泌乳奶牛注射GH时,肝脏糖异生作用明显增强,并且血液中葡萄糖浓度也相应上升,推测糖异生的关键酶可能会受到GH的影响。吴文旋等[26]研究发现,当动物受到外源GH刺激时,肝细胞IGF-I的合成增加,使外周循环血液中IGF-I的含量也显著增加,提示GH在肝细胞的作用与IGF-I密切相关。RHOADS等[27]提出,热应激发生时GH会作用于肝细胞产生IGF-I,后者能够促进PC和PEPCK的表达,进而激活糖异生途径。本试验发现,第5周与第1周相比奶牛血液中GH、IGF-I以及葡萄糖水平显著升高,并且结合上述研究中肝脏糖异生关键酶表达量的显著上调。说明随着热应激程度的加深,可能是通过GHIGF-I轴,激活了肝脏的糖异生途径,增加了血液中葡萄糖的含量。
4 结论
在给泌乳奶牛制造热应激模型的状态下,会造成乳产量下降,而血液中葡萄糖含量显著上调,激素GH、IGF-I含量也显著上升,肝脏糖异生作用也明显升高,提示血液中葡萄糖含量的升高可能是通过GHIGF-I轴,进而激活肝脏的糖异生作用来发挥效应的。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前体物被过多的用来进行糖异生的转化,进而合成的葡萄糖为机体正常供能所致,但其机制有待进一步研究。The authors have declared that no competing interests exist.
