李青^,, 鱼海鹏, 张子豪, 孙正文, 张艳, 张冬梅, 王省芬, 马峙英, 阎媛媛^,*河北农业大学农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物种质资源重点实验室,河北保定 071001

Optimization of Cotton Mesophyll Protoplast Transient Expression System

LI Qing^,, YU HaiPeng, ZHANG ZiHao, SUN ZhengWen, ZHANG Yan, ZHANG DongMei, WANG XingFen, MA ZhiYing, YAN YuanYuan^,*College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei, Baoding 071001, Hebei

通讯作者: 阎媛媛,E-mail： selina3001630016@163.com

责任编辑: 李莉
收稿日期:2021-04-25接受日期:2021-06-24

基金资助:

河北省教育厅科学技术研究重点项目(ZD2018057) 河北省自然科学基金(C2020204079) 河北农业大学引进留学博士专项(ZD201601)

Received:2021-04-25Accepted:2021-06-24
作者简介 About authors
联系方式：李青,E-mail： 1580321058@qq.com。











摘要
【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl₂会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L^-1 CaCl₂的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L^-1甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L^-1甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L^-1甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40% PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。 【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10⁶个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。
关键词： 棉花;TM-1;原生质体分离;瞬时表达

Abstract
【Objective】Cells of true leaves can well mimic the plant endogenous situation. It is an efficient way for expediting cotton functional study to establish an effective transient expression system using cotton protoplasts obtained from true leaves.【Method】The enzyme combination of cellulose and macerozyme were used to isolate protoplasts from true leaves of Gossypium hirsutum L. acc. TM-1. The effects of osmotic pressure, components of digestion buffer and digestion time on protoplast yield were studied and the validity of protoplasts were compared under different mannitol concentration and digestion time. To improve the transformation efficiency of cotton protoplast, the effects of mannitol and PEG concentration and buffers for protoplast culture were subsequently studied. In order to verify the optimized transient expression system, the vector 35S:LTP-GFP was constructed and transformed into protoplasts of Arabidopsis and cotton and tobacco epidermal cells followed by observation of fusion protein localization.【Result】High concentration of CaCl₂ in the digestion buffer significantly inhibited the isolation of protoplast from cotton true leaves, which was opposite of that using cotyledon. 10 mmol·L ^-1 CaCl₂ was employable for digestion buffer to isolate cotton protoplasts from true leaves. Mannitol concentration significantly affected protoplast yield that peaked under mannitol concentration of 0.5 mol·L^-1, and protoplast validity decreased moiety under 0.4 mol·L^-1 mannitol, suggesting that 0.5 mol·L^-1 mannitol was most suitable to maintain the osmotic pressure of cotton protoplasts. Cotton protoplasts displayed suitable size when isolated from newly flattened true leaves, while protoplast enlarged and yield decreased when produced from young leaves flattened 5 days. The protoplasts dissociate slowly until being digested 9 h when the yield reached the peak. The transformation efficiency was greatly improved under isotonic condition of 40% PEG buffer. While hypotonic condition that is commonly applied to facilitate transformation was against the entrance of exogenous DNA into cotton protoplasts. After transformation, the protoplast ruptured abundantly in WI buffer,whereas the shape maintained well in W5 buffer adding 0.5 mol·L^-1 mannitol. The transformation efficiency was improved to 90% using the optimized transient expression system. The subcellular location analysis results showed consistent GFP signal in protoplasts of cotton and Arabidopsis true leaf and epidermal cells of tobacco leaf.【Conclusion】Our study has optimized the cotton mesophyll protoplast transient expression system, which could produce 8.10×10 ⁶·mL^-1 fine protoplasts with validity above 95% and transformation efficiency reached to 90%. This system is applicable for analysis of subcellular location, protein interaction and research on metabolism and regulation network.
Keywords：cotton;TM-1;isolation of protoplasts;transient expression


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本文引用格式
李青, 鱼海鹏, 张子豪, 孙正文, 张艳, 张冬梅, 王省芬, 马峙英, 阎媛媛. 棉花真叶原生质体分离及瞬时表达体系的优化. 中国农业科学, 2021, 54(21): 4514-4524 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.003
LI Qing, YU HaiPeng, ZHANG ZiHao, SUN ZhengWen, ZHANG Yan, ZHANG DongMei, WANG XingFen, MA ZhiYing, YAN YuanYuan. Optimization of Cotton Mesophyll Protoplast Transient Expression System. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(21): 4514-4524 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.003


开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

0 引言

【研究意义】棉花是世界上最重要的经济作物之一,在国民经济中占据重要地位。随着基因组测序技术的发展,多个野生棉和栽培棉（Gossypium）基因组陆续完成测序与组装,并被升级^[1,2,3,4,5]。这些高质量的基因组序列为解析棉花许多重要的进化事件与机制提供了便利,更加快了重要农艺性状相关位点的挖掘。然而,四倍体栽培棉种基因组较大,陆地棉遗传标准系TM-1（Gossypium hirsutum L. acc. TM-1）基因组包含74 350个编码蛋白的基因^[5],大量重要基因的功能急需解析。但棉花突变体资源稀少,遗传转化周期长且转基因效率不高,制约着基因功能研究。利用基因的时空表达特征和调控网络,建立一套快速高通量验证棉花基因功能的方法,是加速棉花功能基因组学研究进程,并能快速获得目标性状的候选功能基因,从而进行基因组精准改良的基础^[6]。原生质体无细胞壁障碍,是进行基因遗传转化操作、研究基因表达调控和功能的优良材料,为进行高通量的基因功能研究提供了一种经济、有效的方法。【前人研究进展】原生质体瞬时表达体系因其快速、高效的优势,被广泛应用于亚细胞定位、分子互作及代谢调控网络等研究。目前,已在拟南芥^[7]、烟草^[8]、小麦^[9]、水稻^[10,11]等植物中建立了高效的原生质体瞬时表达体系,并广泛应用于基础研究。XIONG等^[12]利用大豆叶肉原生质体瞬时表达体系揭示了细胞质类光体结构的形成。结合叶肉原生质体瞬时转化和HPLC-MS技术,GAO等^[13]鉴定了调控和合成玉米苯丙噁嗪的相关基因,为改良玉米抗虫能力提供了理论依据。原生质体还被用于挖掘植物抗病相关基因及识别病原菌的效应子^[14,15]。棉花原生质体首先从陆地棉纤维游离出,之后从多个棉种的多种外植体分离出有活力的原生质体^[16]。孙玉强^[17]详细分析了影响棉花原生质体分离的酶液组合,从下胚轴、幼根和叶片中分离出原生质体。李妮娜等^[18]进一步分析了叶龄、甘露醇浓度和酶解时间对棉花幼嫩子叶原生质体分离效率的影响,并利用PEG介导的棉花原生质体转化技术,对棉花锌指蛋白GhZFP2进行了亚细胞定位研究。【本研究切入点】尽管已有较为高效的分离棉花子叶原生质体的方法^[18],但子叶细胞以薄壁组织为主,不同于真叶的海绵组织,真叶才是植物与环境发生互作的主要部位。因此,利用真叶原生质体进行基因的同源瞬时表达,避免了异源表达可能造成的差异结果,提高基因功能研究的准确性。但目前未见分离棉花真叶原生质体的报道,且已报道的棉花原生质体遗传转化效率较低,尚不能满足高通量研究基因功能的需要。【拟解决的关键问题】本研究运用酶解法分离与纯化棉花真叶叶肉原生质体,对比分析影响原生质体分离与目标基因瞬时转化的因素,优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系,为开展高通量基因功能研究提供可靠方法。

1 材料与方法

试验于2018—2021年在河北农业大学教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室进行。

1.1 试验材料

植物材料选取陆地棉遗传标准系（TM-1）饱满的种子播种于营养土与蛭石质量比为3:1的土壤中,置光照培养室自然生长（28℃ 12 h光/12 h暗）至第5片真叶时,选取刚展平的第5片真叶与展平后5 d的第4片真叶,对比其原生质体分离效果。

含有绿色荧光蛋白基因的植物表达载体pGreen0229-GFP用于原生质体瞬时转化,该载体包含花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV）35S启动子、绿色荧光蛋白（GFP）基因等元件。在大肠杆菌DH5α菌株中扩增质粒,大量提取纯化制备质粒DNA,以电泳鉴定。测定质粒DNA的纯度和浓度,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.6—1.8,浓度为1 µg·µL^-1,-20℃保存备用。

试验试剂：纤维素酶Cellulase Onzuka R10、离析酶Macerozyme R10、PEG4000等主要国产生化试剂均购于北京兰博利德商贸有限公司,甘露醇、MES均购于Sigma公司。

1.2 棉花原生质体的分离与纯化

酶的种类是酶解法分离植物细胞原生质体的关键,通常纤维素酶+离析酶组合能获得理想的原生质体分离效果^[19],因此,采用纤维素酶和离析酶分离原生质体。配制含有1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol·L^-1甘露醇、20 mmol·L^-1 KCl、20 mmol·L^-1 MES、10 mmol·L^-1 CaCl₂、1.0 g·L^-1 BSA的混合酶液10 mL,经0.45 μm纤维素微孔滤膜过滤待用。选取生长健壮的棉花真叶,去掉叶片主叶脉后,平展于培养皿上,将其切为宽度为0.5—1.0 mm的均匀细丝。取1.0 g叶片细丝与酶液充分混合,28℃避光,50 r/min轻摇7—12 h,使叶肉基本完全酶解,至酶解混合液呈现绿色或黄绿色为止。

酶解终止后,用枪头吸取酶解混合液至孔径为30 μm的尼龙网过滤至50 mL离心管中,加入等体积的W5溶液（4 mmol·L^-1 MES、154 mmol·L^-1 NaCl、125 mmol·L^-1 CaCl₂、5 mmol·L^-1 KCl,pH6.0）轻柔冲洗滤渣,1 000 r/min离心2 min。轻轻弃上清,加入2 mL W5重悬,1 000 r/min离心1 min,清洗,加入2 mL W5溶液轻轻悬浮,冰上放置30 min,沉淀原生质体备用。

1.3 叶肉原生质体的产量与活力检测

用0.1 mm血球计数板统计棉花原生质体数目,用0.02%荧光素双醋酸（Fluorescein Diacetate,FDA）测定原生质体活力。吸取100 μL分离纯化后的原生质体悬浮液,加入浓度0.02% FDA溶液（FDA母液：5 mg·L^-1 FDA丙酮）,取10 μL混合液滴在16×25的血球计数板上,加盖18 mm×18 mm的盖玻片,在荧光显微镜（MODEL BX51TF）40倍物镜下镜检,如果原生质体浓度过高,需稀释到合适的浓度后再镜检。原生质体数（个/mL）=（80小格内细胞个数/80）×400×10⁴×稀释倍数。统计视野中每一中格总原生质体数,共统计5个中格里原生质体数,重复3次。立刻调荧光显微镜,荧光激发光波长为450—490 nm,发射波长250 nm。此时,活力高的原生质体具有黄绿色荧光。统计视野中每一中格中总原生质体数及具有活力的原生质体数,计算原生质体活力（%）=发黄绿色荧光的原生质体数/观察的原生质体总数×100%。每个试验设置3个重复,分别统计原生质体的数量与活力。图片由MODEL U-LH100HG采集。

1.4 原生质体的瞬时转化

将沉淀后的原生质体重悬浮于MMg溶液（4 mmol·L^-1 MES、0.5 mol·L^-1甘露醇和10 mmol·L^-1 MgCl₂）中,浓度稀释至1.0×10⁶个/mL。将浓度为1 μg·μL^-1质粒DNA 15 μL加入2 mL离心管,与200 μL原生质体-MMg悬混液混合,轻弹管底混匀,室温放置5—10 min。加入215 μL 40% PEG4000（40% PEG4000、0.5 mol·L^-1甘露醇、100 mmol·L^-1 CaCl₂,pH8.0）,轻弹管底混匀,室温放置15 min。用W5溶液430 μL重新悬浮,轻弹管底混匀,终止转化。1 000 r/min心2 min,弃上清。加入WI溶液（4 mmol·L^-1 MES、0.5 mol·L^-1甘露醇、20 mmol·L^-1 KCl）1 mL重悬浮,并转移至经5% BSA预冲洗过的六孔板中,24℃培养12—16 h。用激光共聚焦显微镜（MODEL FV10C-PSU）观察鉴定。荧光下转化成功的原生质体显绿色荧光,分别统计荧光下和白光下视野中原生质体数,统计方法同1.3,计算原生质体转化效率（%）=发绿色荧光的原生质体数/总原生质体数×100%。

1.5 融合蛋白表达载体构建

根据已克隆的棉花LTP基因（Gh_D12G2180.1,其ORF长度为324 bp）序列,设计两端带有HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点的引物（F：5′- TTggatccATGGCTTTCAAGGTTTCAGCAATCC-3′;R：5′-TCaagcttTTAGCAGTAGTAGGTTCTGGT TGGC-3′）,特异性扩增LTP基因序列,酶切后与pGreen0229-GFP载体连接,构建融合蛋白表达载体35S:LTP-GFP。

2 结果

2.1 棉花真叶原生质体制备体系的优化

参照棉花子叶原生质体分离体系^[18]进行预试验,但无法获得有活力的真叶原生质体,因此对棉花子叶原生质体分离方法进行了优化,以获得高活力真叶原生质体。

2.1.1 不同浓度氯化钙对棉花原生质体分离的影响 首先对比拟南芥^[20]和棉花原生质体^[18]酶解体系,发现CaCl₂浓度相差10倍,而其他组分差异不大。因此,在酶解液其他组分不变的情况下,首先对比100 mmol·L^-1和10 mmol·L^-1 CaCl₂浓度酶解液酶解效果。发现酶解液含100 mmol·L^-1 CaCl₂时,叶片酶解效果差,大量完整的叶片细丝无法被分解（图1-A）;而CaCl₂浓度为10 mmol·L^-1酶解液能充分降解细胞壁,酶解混合液颜色明显变绿（图1-A）,原生质体浓度高达7.6×10⁶个/mL。因此,选用10 mmol·L^-1 CaCl₂为最佳酶解液成分,能获得较理想的酶解效果。

图1

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图1不同浓度CaCl₂和甘露醇对原生质体分离的影响

A：不同浓度CaCl₂酶解液酶解效果;B：甘露醇对原生质体得率的影响（不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。下同）;C：甘露醇对原生质体活力的影响
Fig. 1Effect of CaCl₂ and mannitol concentration on protoplast isolation

A: Digestion effect of enzyme buffer with different CaCl₂ concentration; B: Effect of mannitol concentration on protoplast yield (different letters show significant difference at P<0.05. The same as below); C: Effect of mannitol on protoplast viability


2.1.2 渗透压对棉花原生质体分离的影响 渗透压是原生质体提取的关键影响因素,不同物种和组织部位所需渗透压均不同^[19]。结合前人报道,本研究对比了不同浓度甘露醇提取幼嫩真叶原生质体效果。甘露醇为0.5 mol·L^-1时原生质体产量最高（图1-B）,而高浓度的甘露醇条件下无法获得理想数量的原生质体。因此,进一步对比了0.4和0.5 mol·L^-1甘露醇浓度下获得的原生质体的活力,发现原生质体在0.5 mol·L^-1的甘露醇溶液中活力达到90%,较0.4 mol·L^-1甘露醇浓度下原生质体活力（58%）提高近一倍（图1-C）。所以0.5 mol·L^-1甘露醇能较好地维持棉花真叶原生质体渗透压。

2.1.3 叶龄对原生质体分离的影响 一般嫩叶是分离原生质体较为理想的材料,因此在棉苗第5片真叶刚展平时,同时对比第5片真叶和第4片真叶产生原生质体的得率,2片叶的叶龄相差5 d（图2-A）。利用含10 mmol·L^-1 CaCl₂和0.5 mol·L^-1甘露醇的酶解液充分酶解后,发现以第5片真叶为材料产生的原生质体浓度是以第4片真叶为材料时的2倍以上（图2-B）,且幼嫩叶片获得的原生质体较老叶大小合适、细胞碎片少（图2-C—图2-D）。因此,刚展平的真叶为最佳外植体材料,能获得高质量原生质体浓度6.0×10⁶个/mL以上。

图2

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图2叶龄对原生质体分离的影响

A：取样真叶;B：不同叶龄原生质体产量;C：老叶原生质体;D：幼叶原生质体
Fig. 2Effect of leave developmental stage on protoplast isolation

A: True leaves for protoplast isolation; B: Protoplast yields using the true leaves at different developmental stages; C: Protoplasts produced from elder leaves; D: Protoplasts produced from newly flattened young leaves


2.1.4 酶解时间对棉花原生质体分离的影响 为探究合适的酶解时间,在上述条件下,分别酶解5、7、9、10和12 h后检测原生质体的产量及活力。结果表明,酶解7 h内原生质体缓慢从叶肉组织分离,产量变化不大（图3-A和图3-B）,酶解9 h时原生质体的产量达到最高,为7.60×10⁶个/mL,且细胞形态良好,极少有破碎细胞（图3-A和图3-C）,酶解时间继续延长,前期酶解的原生质体开始破碎（图3-D和图3-E）,原生质体产量显著下降（图3-A）。因此,选择9 h作为适合的酶解时间。

图3

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图3酶解时间对原生质体分离的影响

A：不同酶解时间下原生质体产量;B—E：酶解7—12 h得到的原生质体;F—G：原生质体活力检测
Fig. 3Effect of digestion time on protoplast isolation

A: Protoplast yield after different digestion time; B-E: Isolated protoplasts after 7-12 h digestion; F-G: Detection of protoplast viability


2.1.5 原生质体分离及活力检测结果 根据以上试验结果,棉花真叶原生质体分离的最优体系为：刚展平的真叶,含有1.5%纤维素酶、0.4%离析酶的W5溶液（0.5 mol·L^-1甘露醇、20 mmol·L^-1 KCl、20 mmol·L^-1 MES、10 mmol·L^-1 CaCl₂和1.0 g·L^-1 BSA）,28℃避光,50 r/min轻摇9 h。利用离心法将原生质体收集后加W5溶液重悬得到浓度为（8.10±1.30）×10⁶个/mL的棉花原生质体。分离后的原生质体采用FDA法检测原生质体的活力,在倒置显微镜下观察,对原生质体总数和发荧光的原生质体数分别计数,计算出原生质体的活力高达95%（图3-F和图3-G）。

2.2 棉花原生质体的瞬时转化

以优化的棉花真叶原生质体分离体系为基础,参照棉花子叶原生质体转化体系^[18],利用PEG介导法将35S:GFP质粒转化到棉花原生质体,其转化率低于60%,大量细胞死亡和破碎,为进一步提高转化效率,分别探究了原生质体培养液、渗透压和PEG4000浓度对转化效率的影响。

2.2.1 生质体转化体系的优化 因转化后大量原生质体破碎,首先分析用40% PEG4000、0.4 mol·L^-1甘露醇转化原生质体后,用WI溶液和添加0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液培养的效果。结果表明,用W5培养转化后的原生质体尽管细胞碎片减少,但不能显著提高转化效率（图4-A和图4-B）。因此,转化后用W5溶液继续培养原生质体有利于维持细胞活力。

图4

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图4转化条件的优化

A、C、D：培养液类型、甘露醇和PEG浓度对转化效率的影响;B：荧光显微镜下的转化结果
Fig. 4Optimization of transformation conditions

A, C and D: Effect of protoplast culture solution, mannitol concentration and PEG concentration on transformation efficiency; B: Protoplasts after transformation under fluorescence microscope


为选择转化时合适的渗透压,设置0.4 mol·L^-1甘露醇低渗透压和0.5 mol·L^-1甘露醇等渗透压条件下进行原生质体转化,转化效率分别为（63.72±1.42）%和（90.16±3.70）%（图4-C）,等渗条件能显著促进棉花原生质体的转化效率。

为确定合适的PEG4000浓度,对比了等渗条件下,30%、40%和50%的PEG4000对原生质体转化效率的影响,发现30%和50%较40% PEG4000显著降低了遗传转化效率（图4-D）,PEG4000浓度为40%是转化的最佳选择。

根据结果,用40% PEG4000在等渗（0.5 mol·L^-1甘露醇）条件下进行原生质体转化后,用添加0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液继续培养12—16 h,能获得转化效率高达90%的棉花原生质体。

2.2.2 棉花原生质体转化体系验证 为了验证上述棉花真叶原生质体瞬时转化体系,本研究对比了一个棉花基因在拟南芥和棉花原生质体及烟草表皮细胞内的表达情况。河北省种质资源重点实验室棉花遗传育种组前期克隆了一个编码棉花脂转运蛋白的基因LTP（Gh_D12G2180.1）,预测该蛋白表达部位为细胞质和细胞膜。构建35S:LTP-GFP融合蛋白表达载体后,分别在棉花原生质体（图5-A）、拟南芥原生质体（图5-B）和烟草表皮细胞（图5-C）中瞬时表达,荧光显微镜下GFP信号均定位在细胞质和细胞膜,且细胞膜上GFP信号略强,说明建立的棉花真叶原生质体分离和转化体系可模拟棉花蛋白的体内表达情况,可应用于棉花功能基因组学研究。

图5

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图5棉花LTP-GFP瞬时转化结果

A：棉花真叶原生质体;B：拟南芥叶片原生质体;C：烟草表皮细胞
Fig. 5Transient expression of cotton LTP-GFP

A: Cotton mesophyll protoplast; B: Arabidopsis mesophyll protoplast; C: Tobacco epidermal cells

3 讨论

突变体库、转基因植物、转录组和基因组序列的综合利用使研究者能够在细胞和分子水平认识植物生命活动过程。近年来,棉花基因组学迅猛发展,多个高质量棉花参考基因组序列相继公布,推动棉花基础研究进入了以基因功能研究为标志的后基因组阶段,大量基因的功能有待挖掘,基因调控网络有待深入解析。受限于遗传转化率低和突变体库的匮乏,棉花功能基因组研究进展缓慢,亟待一种高通量快速研究基因功能的方法。植物原生质体被广泛用于体细胞杂交^[21,22,23]、植物细胞生理研究和基因功能分析^[24]等。随着基因编辑技术的发展,原生质体的优势更加突出^[25,26,27]。此外,JIN等^[28]利用叶片原生质体建立了快速筛选γ射线诱导突变体的方法,并培育了耐盐烟草突变株。原生质体还被用于探究玉米代谢产物合成及调控网络^[13],以及大豆转录因子全基因组调控位点的筛选^[29]。但目前缺少棉花真叶原生质体高效瞬时转化的方法,限制了棉花原生质体在功能基因组学研究中的应用。本研究在李妮娜等^[18]棉花子叶原生质体分离和瞬时转化体系基础上,通过优化CaCl₂浓度、叶龄、渗透压、酶解时间和PEG4000浓度,建立了高效分离棉花真叶原生质体和瞬时转化的方法,原生质体得率提高近10倍,活力高达95%,转化效率显著提高到90%。

酶解法是常用分离植物原生质体的方法,尽管酶种类是分离原生质体的关键,但普遍采用纤维素酶+离析酶的组合^[19]。本研究采用纤维素酶和离析酶组合的酶解液,获得了理想的棉花真叶原生质体分离效果。研究者们普遍认为分离高质量原生质体的关键是对渗透压、酶解时间、叶龄的把控^[30,31,32],却忽视了CaCl₂对原生质体的影响。CaCl₂有稳定质膜的作用,赵严伟^[33]分析发现CaCl₂处理洗液对原生质体活力无显著影响,CaCl₂对原生质体数量的影响取决于洗液种类和浓度。而朱俊等^[34]发现低浓度和高浓度CaCl₂均会抑制烟草原生质体产量和活力,而其浓度对原生质体活力的影响更显著。本研究对比了含100和10 mmol·L^-1 CaCl₂的酶解液酶解效果（图1-A）,发现高浓度CaCl₂显著抑制了酶解,且细胞破碎较多,含10 mmol·L^-1 CaCl₂的酶解液能有效地促进原生质体的分离,细胞形态良好,这一规律与前人的研究结果一致^[33,34]。此外叶龄在原生质体的获取中也至关重要,一般认为幼嫩组织是分离原生质体的理想材料,前人已从棉花愈伤组织^[35]、悬浮细胞^[36]和子叶中分离了原生质体^[18,37]。但这些组织都是特殊时期或状态下的细胞,不能代表植株自然生长状态下基因和蛋白的时空表达特征。本研究以正常生长的真叶作为制备原生质体的材料,结果表明,刚展平的嫩叶能获得大量高活力的优质原生质体。所得原生质体可以模拟棉花细胞的基因和蛋白水平,利用特定时期或处理下叶片获得的原生质体进行基因功能及调控网络的研究,能够极大地缩短研究时间和提高研究的准确性。

PEG介导的原生质体转化具有经济便捷的优点,被广泛应用于多种植物。高分子量的PEG溶液对原生质体有毒害作用,而低浓度的PEG会降低转化效率。对于大多数植物的原生质体,分子量4 kD的PEG在20%—40%的浓度下就能打开细胞膜上足够数量的通道,使外源遗传物质进入细胞内,而不同植物的原生质体细胞膜对PEG的耐受性差异不大^[38]。本研究选择分子量适中的PEG4000进行转化,结果表明,40%的PEG4000转化效果最佳（图4-D）。低渗条件下细胞处于吸水状态,此时外源物质更易进入细胞内,因此,很多植物的原生质体转化时都使用了低渗溶液,如拟南芥^[39]、水稻^[40]、玉米^[13]、杨树^[41]等,李妮娜等^[18]在转化子叶原生质体时也采用了0.4 mol·L^-1甘露醇的低渗溶液。但本研究对比了等渗和低渗条件下转化效率的差别,发现等渗条件更适合棉花真叶原生质体的转化,提高了原生质体的存活率,能获得更好的转化效果。此外,转化后原生质体的培养大多采用WI溶液,本研究用WI溶液培养转化后的原生质体,发现细胞破碎,活力下降。前人对比发现W5溶液维持细胞活性最优^[31],本体系改用含0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液培养后,原生质体活力及细胞形态维持良好。对比两种溶液,W5溶液含Ca²⁺,能更好地维持原生质体质膜的稳定性。本研究在最优组合条件下,原生质体转化效率达到90%,同拟南芥90%的转化率一致^[38],获得的转基因原生质体是进行棉花功能基因组学研究的良好材料。

4 结论

建立了棉花真叶原生质体的分离与瞬时表达体系。选取刚展平的棉花真叶为外植体材料,在1.5%纤维素酶和0.4%离析酶液组合,0.5 mol·L^-1甘露醇渗透压下、10 mmol·L^-1 CaCl₂、1 g·L^-1小牛血清蛋白,28℃黑暗振荡酶解9 h,获得大小均匀、产量达8.10×10⁶个/mL、活力达95%以上的棉花叶肉原生质体。通过40% PEG4000介导15 µg目的质粒DNA等渗条件下转化上述原生质体,24℃ W5溶液（添加0.5 mol·L^-1甘露醇）培养过夜,可得到高转化率的原生质体。

（责任编辑 李莉）

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