柴亚茹, 丁一娟, 周思钰, 杨文静, 闫宝琴, 远俊虎, 钱伟^,西南大学农学与生物科技学院,重庆 400715

Identification of the Resistance to Sclerotinia Stem Rot in HIGS-SsCCS Transgenic Arabidopsis thaliana

CHAI YaRu, DING YiJuan, ZHOU SiYu, YANG WenJing, YAN BaoQin, YUAN JunHu, QIAN Wei^,College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715

通讯作者: 钱伟,E-mail： qianwei666@hotmail.com

柴亚茹和丁一娟为同等贡献作者。
责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-08-29接受日期:2019-10-24网络出版日期:2020-02-16

基金资助:

国家自然科学基金.31801395 国家自然科学基金.31971979 中国博士后科学基金.2018M633305 重庆市基础与前沿面上项目.cstc2019jcyj-msxm2511 重庆市基础与前沿面上项目.cstc2019jcyj-zdxmX0012

Received:2019-08-29Accepted:2019-10-24Online:2020-02-16
作者简介 About authors
柴亚茹,E-mail：cyr2310326815@163.com。

丁一娟,E-mail：dding1989@163.com。








摘要
【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H₂O₂的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T₁及T₂代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T₂代中获得3个稳定表达的T₃代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H₂O₂的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。
关键词： 拟南芥;寄主诱导的基因沉默;核盘菌;SsCCS;抗病性;菌核病

Abstract
【Objective】Sclerotinia stem rot is a kind of fungal disease caused by Sclerotinia sclerotiorum. The host range of S. sclerotiorum is wide, which seriously endangers the quality of many crops. The objective of this study is to enhance the resistance to stem rot by silencing the virulence genes of S. sclerotiorum in host via the host-induced gene silencing (HIGS) technology, and to provide new ideas for breeding of sclerotinia stem rot resistance.【Method】The gene encoding a copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase of S. sclerotiorum (SsCCS) was selected as the target gene, the sequences were analyzed by bioinformatics tools, and the phylogenetic tree was constructed using MEGA6.0 software. The specific interference fragment was selected for amplification after comparing the genome of Arabidopsis thaliana and S. sclerotiorum, respectively. HIGS vector containing the RNAi structure of SsCCS was transferred into wild type A. thaliana Col-0 mediated by Agrobacterium, and the stable HIGS-CCS transgenic A. thaliana lines were screened by DNA identification and labeling. The leaves of HIGS-CCS transgenic plants grown for 4-5 weeks were selected to analyze the resistance to sclerotinia stem rot according to the lesion area at 24 h after inoculated with S. sclerotiorum. The relative expression level of SsCCS during infecting was analyzed by qRT-PCR. The accumulation of H₂O₂ during the period of interaction between transgenic plants and S. sclerotiorum was detected by DAB staining at 6, 12 and 24 hpi.【Result】Bioinformatics analysis showed that the length of genome sequence of SsCCS (SS1G_00102) is 1 010 bp, while the length of its coding sequence (CDS) is 759 bp, encoding a protein with 253 amino acids, the molecular weight is 2 7176.96 Da, the isoelectric point (PI) is 5.04. SsCCS has 87% amino acid homology to BcCCS (EDN25358) while far to AtCCS (AT1G12520.1). By aligning with the genome of S. sclerotiorum and A. thaliana, a 314 bp specific interference fragment was selected and constructed the HIGS vector successfully and transformed into A. thaliana. The lesion of T₁ and T₂ generation transgenic lines was smaller than that of wild type A. thaliana 24 h after inoculated with strain 1980. From the T₂ generation, three stably expressed T₃ generation HIGS-CCS transgenic A. thaliana lines (HIGS-CCS-5, HIGS-CCS-8, HIGS-CCS-13) were obtained. Compared with wild type A. thaliana, the lesion area on the HIGS-CCS transgenic plants was reduced by 46% to 61% 24 h after inoculated with strain 1980. The expression of SsCCS was significantly reduced by 98% in the HIGS-CCS transgenic plants compared to that in wild type A. thaliana at 6 h after inoculated with S. sclerotiorum strain 1980. Furthermore, the accumulation of H₂O₂ was decreased in transgenic plants as revealed by DAB staining, indicating the ROS production was reduced in transgenic plants.【Conclusion】The resistance to stem rot can be significantly enhanced by silencing the SsCCS of S. sclerotiorum in A. thaliana via the HIGS. This study provides a reference for the resistance improvement to sclerotinia stem rot of host crops, such as rapeseed.
Keywords：Arabidopsis thaliana;host-induced gene silencing (HIGS);Sclerotinia sclerotiorum; SsCCS;disease resistance;sclerotinia stem rot


PDF (1537KB)元数据多维度评价相关文章导出EndNote|Ris|Bibtex收藏本文
本文引用格式
柴亚茹, 丁一娟, 周思钰, 杨文静, 闫宝琴, 远俊虎, 钱伟. HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定[J]. 中国农业科学, 2020, 53(4): 761-770 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.04.008
CHAI YaRu, DING YiJuan, ZHOU SiYu, YANG WenJing, YAN BaoQin, YUAN JunHu, QIAN Wei. Identification of the Resistance to Sclerotinia Stem Rot in HIGS-SsCCS Transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(4): 761-770 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.04.008

0 引言

【研究意义】核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为隶属于子囊菌门、核盘菌属的一种植物病原真菌,其寄主广泛,可以侵染包括油菜、马铃薯、棉花、番茄、大豆等多种重要的农作物在内的400多种植物^[1,2,3],造成巨大的作物产量损失。目前对菌核病的防治主要依靠化学杀菌剂,但该方法成本高、影响环境,且易产生耐药菌株导致防治效果不理想,因此创建高抗材料是菌核病防治的关键。近年来,寄主诱导的基因沉默技术（host-induced gene silencing,HIGS）在研究病原菌基因功能及增强寄主抗病性中起着越来越重要的作用^[4]。因此,利用HIGS技术在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中沉默核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）,获得抗性稳定持久的材料,可为油菜等作物的抗菌核病育种提供新方法,并为安全防控菌核病提供重要靶标基因。【前人研究进展】目前创制菌核病抗病材料的方法主要包括以下几种：一种方法是通过杂交、回交等传统选育方式培育抗病品种,另一种方法是通过在植物体内过表达抗病相关基因,从而增强植株的抗病性,以及通过细胞工程及诱变育种的方式进行抗病品种的培育^[5]。但抗病遗传资源缺乏,以及核盘菌致病机理复杂,相关的抗病位点开发以及抗病分子机制的研究受到限制,导致菌核病抗病育种进程缓慢。近年来在真菌、细菌、病毒、植物、线虫、人中都发现基因沉默（RNAi）现象^[6,7,8],RNAi是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。前人研究发现利用携带特定基因片段的不同病毒载体侵染本氏烟,可以导致特定靶基因的沉默,进而发展了病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术^[4]。寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术是VIGS的进一步发展^[9],HIGS通常以病原菌生长发育、致病过程中的关键基因作为靶标基因,通过将靶标基因的反义发夹结构或RNAi结构转染到寄主植物,产生靶标基因的dsRNA,并经植物细胞本身的Dicer核酸酶加工形成19—25 nt的siRNA。在病原菌侵染植物时,siRNA通过囊泡从植物体运输到病原菌,干扰病原菌靶基因的表达,从而减弱其致病能力,间接增强寄主植物的抗病性^[10]。NOWARA等^[11]发现在大麦中表达大麦白粉病菌（Blumeria graminis）葡聚糖转移酶效应子的RNA干扰分子会提高其抗性水平,据此首次提出了HIGS的概念。此后,该技术被广泛应用在各种作物与多种真菌互作研究中,如小麦叶锈病菌（Puccinia triticina）^[12]、禾谷镰孢（Fusarium graminearum）^[13]以及黄萎病菌^[14]。最近,有研究人员利用HIGS技术在烟草中表达核盘菌Sschs的RNAi结构,发现转基因T₁代烟草的菌核病抗性显著增强^[15]。但是利用HIGS技术是否能获得稳定持久可遗传的菌核病抗性还有待研究,且该技术在十字花科植物抗菌核病的研究还未见报道。研究表明,当病原菌入侵宿主时,寄主植物最早启动的免疫防御依赖于活性氧（ROS）迸发^[16]。过量的ROS不仅会对植物细胞,也会对病原菌造成细胞膜DNA及蛋白质等的损害^[17,18]。超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧爆发的第一步,将_{$O^{\bar{·}}_{2}$}歧化为H₂O₂和氧气,进而生物体将H₂O₂分解为无毒的水^[19]。SOD按其结合的金属离子,可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD以及Ni-SOD 4种^[20,21],其中CuZn-SOD主要存在于细胞质以及线粒体内外膜之间作为氧化物清除剂^[22]。相关研究表明,核盘菌中编码CuZn-SOD的基因突变后,核盘菌抗氧化能力减弱,致病力显著下降^[19,23]。铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣是目前鉴定的分子量最大的一类铜伴侣蛋白质,可通过N端结构域传递铜离子至CuZn-SOD的铜离子结合位点,从而激活CuZn-SOD的酶活性^[24,25]。LI等^[26]研究发现在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染条件下,水稻铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣CCSD缺失突变体导致CuZn-SOD酶活性显著降低,水稻抗病性减弱。因此,铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因对于生物体CuZn-SOD的酶活性激活及ROS的清除能力至关重要。【本研究切入点】尽管现有菌核病抗病育种取得了一定进展,但严重依赖抗病材料及抗病基因的挖掘,进展缓慢,因而亟需发展新的抗病育种技术。本研究选择核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因SsCCS作为靶基因,构建该基因的HIGS载体并转化拟南芥,通过菌核病抗性鉴定,验证HIGS技术应用于寄主菌核病抗性改良的可能性。【拟解决的关键问题】利用HIGS技术在拟南芥中表达特异靶向核盘菌SsCCS的dsRNA,创建持久高抗菌核病的转基因株系,为今后将HIGS技术应用到油菜等十字花科植物的菌核病抗性育种中打下基础,并为安全防治菌核病提供靶基因。

1 材料与方法

试验于2017年10月至2019年3月在西南大学农学与生物科技学院完成。

1.1 供试材料

本试验所用拟南芥哥伦比亚生态野生型Col-0,核盘菌菌株1980均由重庆市油菜工程技术研究中心提供。基因沉默表达载体pCIT由西南大学植物保护学院余洋老师惠赠,拟南芥红光表达载体pBin35SRed3由华中农业大学张椿雨教授惠赠^[27],用于基因克隆的T载体p GEM®-T Easy Vector购于Promega公司（美国）。大肠杆菌菌株DH5α,农杆菌菌株GV3101购于北京全式金生物技术有限公司（TransGen Biotech）。

核盘菌菌株1980保存于马铃薯培养基（PDA）中。

1.2 生物信息学分析

从核盘菌基因组数据库（http://www.broadinstitute org/ annotation/genome/Scleraotinia sclerotiorum/Uenomeslndex html）提取SsCCS的编码序列及氨基酸序列,通过ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）预测SsCCS蛋白的分子量及等电点（PI）,将其氨基酸序列在NCBI上进行同源比对（Blast）,利用 MEGA6.0构建SsCCS的系统发育树。

1.3 HIGS沉默表达载体的构建

利用BioEdit软件将SsCCS与核盘菌以及拟南芥基因组序列进行比对,选择SsCCS的特异片段作为RNA干扰片段,利用Primer Premier 5设计特异引物,并引入相应的酶切位点（表1）。以核盘菌野生菌株1980的cDNA为模板,以SsCCS-SF/SsCCS-SR及SsCCS-AF/SsCCS-AR分别进行扩增,并将胶回收的目的片段连接到pGEMT-Easy载体,转化至大肠杆菌DH5α,挑选阳性单克隆送Invitrogen公司测序。提取测序正确T克隆质粒T-SsCCS-S及T-SsCCS-A,首先采用限制性内切酶EcoRI/EcoRV双酶切T-SsCCS-S,将该正向片段连入pCIT,获得中间载体p-ccs-1。随后采用PstI/BamHI双酶切T-SsCCS-A,将该片段反向连入p-ccs-1,获得SsCCS的干扰载体p-ccs。随后,用EcoRI和XhoI分别双酶切p-ccs及植物转化载体pBin35SRed3的质粒,将p-ccs载体中的主体结构“正向序列-内含子-反向序列”连接到pBin35SRed3的CaMV35S启动子与Nos终止子之间,获得沉默SsCCS的HIGS载体R-ccs。将重组质粒R-ccs转化至农杆菌GV3101,挑选阳性单克隆的菌液加入50%的甘油1﹕1等体积混合于2 mL离心管中,保存于-80℃。

Table 1
表1
表1SsCCS载体构建所用引物序列
Table 1Sequence information of primers used for vector construction of SsCCS

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence
SsCCS-SF	CCC AAGCTT GAATTC TATCTACGGCTGGTTTATGG
SsCCS-SR	TAA GATATC GCATACCTTTGCTAATCTCATCC
SsCCS-AF	CGC GGATCC CTCGAG TATCTACGGCTGGTTTATGG
SsCCS-AR	TAA CTGCAG GCATACCTTTGCTAATCTCATCC
SsTubF	GTGAGGCTGAGGGCTGTGA
SsTubR	CCTTTGGCGATGGGACG
RT-SsCCSF	TCCGTGTTCCCCTTTATCCT
RT-SsCCSR	CCTCAATCGCCCTTACAATCT
PIF	GCCCTTCCTCCCTTTATTTC
PIR	GAGCTGACATCGACACCAAC
M13F	TTGTAAAACGACGGCCAG
M13R	ACACAGGAAACAGCTATGAC
RVF	CGCACAATCCCACTATCCTT
RVR	AAAAGACAAAAGTGGGGTAG

新窗口打开|下载CSV

1.4 拟南芥的遗传转化及鉴定

将拟南芥哥伦比亚生态型（Col-0）直播于营养土中,在22℃,16 h光照、22℃,8 h黑暗培养箱中生长40 d左右,去掉已经结荚的和开放的花朵后,采用农杆菌介导的浸花序法^[28]将重组质粒转化拟南芥。收获侵染后的T₀代拟南芥种子,选择发红色荧光种子进行播种,获得T₁代转基因拟南芥。选取转基因拟南芥幼叶于研钵中,用液氮进行研磨,用CTAB法提取DNA,利用引物RVF/RVR（表1）对T₁代转基因株系进行PCR鉴定,筛选阳性植株。

1.5 菌核病抗性鉴定

在PDA平板上活化核盘菌野生型菌株1980,用直径2 mm的打孔器取生长2 d的边缘菌丝用于接种。将2 mm的菌丝块接种于拟南芥叶片上,带菌面紧贴叶片。接种后,将接种叶片置于可控温控湿环境内,温度设置为22℃,相对湿度保持在85%左右。接种24 h后统计病斑的长径和短径,利用公式S=π×a×b/4计算病斑面积（其中a代表病斑长轴长度,b代表病斑短轴长度）^[29],并利用SAS软件进行统计学分析。试验重复3次,每次3—5片叶片。

1.6 H₂O₂检测

联苯胺（3,3'-diaminobenz-idine-HCl,DAB）染色检测法参照GUAN等的方法^[30]。将接种6、12、24 h后的拟南芥叶片立即置于1 mg·mL^-1的DAB溶液（pH 3.8）中,染色6 h后于沸腾的95%乙醇中脱色10 min,冷却后,于无水乙醇中室温保存并拍照。

1.7 qRT-PCR

取T₃代纯合转基因拟南芥接种核盘菌后6 h的叶片及病斑组织,采用TRIzol^®法提取总RNA,采用Bio RAD的i Script^TM cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA样品反转录成cDNA。采用Bio RAD的 i Taq^TM Universal SYBR^® Green Supermix试剂盒,利用引物RT-SsccsF/RT-SsccsR（表1）,在CFX96^TM Real-Time PCR仪上进行荧光定量扩增,检测SsCCS的表达情况。反应程序：95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s,40个循环,每个样本重复3次,采用2^-ΔΔCT法计算目的基因表达量^[31]。

2 结果

2.1 SsCCS的生物信息学分析

核盘菌中编码SsCCS的基因编号为SS1G_00102,该基因全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04。利用MEGA6.0软件构建系统发育树（图1）,结果显示与SsCCS同源关系近的基因均为编码超氧化物歧化酶铜伴侣基因,其中与灰霉病菌（Botrytis cinerea）BcCCS（EDN25358）基因亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远。

图1

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图1SsCCS系统进化树分析

Fig. 1The phylogenetic tree of SsCCS

2.2 HIGS沉默表达载体的构建

克隆SsCCS的314 bp特异片段,构建HIGS沉默表达载体,载体构建示意图如图2-A所示。以野生菌株1980的cDNA为模板,分别用特异引物SsCCS-SF/ SsCCS-SR、SsCCS-AF/SsCCS-AR扩增SsCCS的特异干扰片段CCSs及CCSa,片段大小为314 bp（图2-B）。将SsCCS的正向和反向特异干扰片段分别连入pCIT载体的内含子两端,采用引物PIF/PIR对p-ccs的重组菌液进行检测,结果显示共获得8个片段大小约1 200 bp的阳性克隆（图2-C）,表明SsCCS干扰载体p-ccs构建成功。提取该质粒,将“CCSs -intron- CCSa”片段插入植物表达载体pBin35SRed3的EcoRI和XhoI 两个酶切位点之间,获得HIGS载体R-ccs。随后,采用EcoRI/XhoI进行双酶切检测R-ccs,酶切片段大小约为1 200 bp（图2-D）,表明植物HIGS沉默表达载体R-ccs构建成功。将R-ccs质粒转化农杆菌,采用引物组合RVF/SsCCS-SR进行检测（图2-E）,结果显示12个重组菌液均在314 bp左右有特异性条带,表明成功转化农杆菌,可用于植物的遗传转化。

图2

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图2SsCCS HIGS载体的构建

A：SsCCS沉默表达载体构建模式图The pattern of vector construction to silence SsCCS;B：SsCCS特异干扰片段扩增Amplification of specific interference fragment of SsCCS;C：p-ccs载体转化大肠杆菌DH5α菌液检测结果Colony PCR verification of Escherichia coli DH5α transformed with p-ccs vector;D：EcoRI和XhoI双酶切鉴定R-ccs Identification of R-ccs vector by double digestion with EcoRI/XhoI enzymes;E：R-ccs载体转化农杆菌GV3101的菌落PCR鉴定Colony PCR identification of Agrobacterium tumefaciens GV3101 transformed with R-ccs vector;M：D2000 Marker
Fig. 2Construction of HIGS vector of SsCCS

2.3 转基因拟南芥的筛选及抗病性鉴定

利用浸花序法转化拟南芥,收获T₀代拟南芥的种子。筛选其中具有红色荧光的种子,共获得17株T₁代转基因植株。提取叶片DNA,利用引物RVF/RVR进行PCR检测,结果发现17株T₁代转基因植株均在1 200 bp左右有特异性条带（图3）,表明17株均为阳性苗。

图3

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图3T₁代转基因拟南芥的PCR鉴定

M：D2000 Marker;WT：野生型拟南芥Col-0 Wild type A. thaliana Col-0 (Control);1—17：17株T₁代转基因植株17 transformed A. thaliana lines of T₁ generation
Fig. 3PCR identification of transformed A. thaliana lines of T₁ generation



接种核盘菌24 h后,发现T₁代转基因拟南芥单株的病斑面积均小于野生型,其中有4个T₁代转基因拟南芥株系的病斑平均面积分别为0.69、0.71、0.89、0.82 cm²,而野生型拟南芥的病斑面积为1.46 cm²（表2）。随后,收获T₁代的转基因种子,并对所有种子进行筛选,从符合红色﹕暗色分离比例为3﹕1的单株自交种中,随机挑选并种植了4个T₂代株系。对T₂代进行菌核病抗性评价发现,3个T₂代转基因拟南芥株系的菌核病抗性显著强于野生型,其病斑平均面积分别为0.79、0.48、0.55 cm²,野生型病斑面积为1.02 cm²（表2）。从T₂代株系中,对抗性表现稳定全部发红光的株系继续培养至稳定纯合的T₃代,菌核病抗性鉴定显示,接种24 h后,3个转基因T₃株系上的病斑明显小于野生型,3个株系的病斑平均面积为0.26、0.38、0.27 cm²,野生型病斑面积为0.69 cm²,转基因株系相对于野生型拟南芥病斑面积减小约46%—61%（图4）。该结果表明,在拟南芥中表达SsCCS的dsRNA能显著增强拟南芥的菌核病抗性。

Table 2
表2
表2转基因拟南芥分离比及接种核盘菌后病斑统计
Table 2Segregation and lesion analyses of transgenic and wild type A. thaliana lines after inoculated with S. sclerotiorum

编号 Code	T1代 T1 generation				T2代病斑面积 T2 generation lesion area (cm2)
	阳性种子数 Positive	非阳性种子数 Negative	分离比 Segregation ratio	病斑面积 Lesion area (cm2)
WT	-	-	-	1.46±0.26a	1.02±0.36a
HIGS-CCS-13	73	27	3﹕1	0.69±0.2b	0.79±0.27b
HIGS-CCS-8	69	31	3﹕1	0.71±0.17b	0.48±0.21b
HIGS-CCS-5	78	22	3﹕1	0.89±0.13b	0.55±0.23b
HIGS-CCS-14	79	21	3﹕1	0.82±0.27b	0.93±0.27a
HIGS-CCS-7	92	8	15﹕1	0.77±0.18b
HIGS-CCS-18	69	31	3﹕1	0.91±0.53a
HIGS-CCS-22	85	25	3﹕1	1.11±0.08a
HIGS-CCS-3	71	29	3﹕1	1.11±0.25a
HIGS-CCS-19	44	56	1﹕1	1.12±0.11a
HIGS-CCS-4	56	44	1﹕1	1.15±0.13a
HIGS-CCS-17	100	0	-	1.27±0.28a
HIGS-CCS-9	78	22	3﹕1	1.37±0.18a
HIGS-CCS-11	95	5	15﹕1	1.21±0.24a
HIGS-CCS-2	70	30	3﹕1	0.91
HIGS-CCS-20	76	34	3﹕1	1.02
HIGS-CCS-1	89	11	15﹕1	1.13
HIGS-CCS-12	74	26	3﹕1	1.26

同列数据后不同小写字母表示0.05水平上差异显著Different lowercases after the data in the same column indicate significant differences at the 0.05 level

新窗口打开|下载CSV

图4

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图4T₃代转基因拟南芥株系抗病性鉴定

A：接种24 h后的病斑Disease phenotypic of transgenic and wild type A. thaliana at 24 h after inoculated with S. sclerotiorum;B：A中的病斑统计结果Lesion area at 24 hpi in A;“*”表示转基因拟南芥材料与对照（WT）相比在0.05水平上差异显著The transgenic group is significantly different from the control group (WT) at the 0.05 level
Fig. 4Resistance identification of T₃ generation transgenic A. thaliana lines

2.4 H₂O₂的积累情况

利用DAB染色检测了HIGS-CCS转基因拟南芥在接种核盘菌过程中H₂O₂的积累情况,以此来反应在侵染过程中植株的ROS发生水平。结果显示,在接种后6、12、24 h,转基因株系的染色区域明显小于野生型,在6 h时已表现出明显差异（图5）。该结果表明,核盘菌在侵染转基因拟南芥过程中的致病力显著小于侵染野生型,侧面反映HIGS-CCS转基因拟南芥的抗性增强。

图5

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图5拟南芥野生型及转基因株系的DAB染色

HIGS-CCS-5：HIGS-CCS-5转基因拟南芥株系叶片Transgenic A. thaliana line HIGS-CCS-5;WT：野生型拟南芥植株叶片Wild type of A. thaliana
Fig. 5DAB staining assay of wild type and transgenic A. thaliana lines

2.5 SsCCS表达量分析

提取转基因株系及野生型接种核盘菌6 h后的叶片及病斑组织的RNA,通过qRT-PCR分析核盘菌在侵染转基因拟南芥过程中相对于侵染野生型核盘菌SsCCS的表达情况,结果发现核盘菌在侵染转基因拟南芥过程中,SsCCS的表达量相对于侵染野生型拟南芥下降了98%（图6）。该结果表明,在核盘菌侵染过程中,HIGS-CCS转基因拟南芥成功干扰了核盘菌SsCCS的表达。

图6

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图6核盘菌菌株1980接种野生型及转基因拟南芥株系6 h后SsCCS的相对表达量

以SsTubulin为参考基因,采用2^-ΔΔCT法进行相对定量,数据表示3个生物学重复的平均值,误差线表示标准偏差（±SD）
Fig. 6Relative expression level of SsCCS at 6 h after the wild type and transgenic A. thaliana lines inoculated with S. sclerotiorum strain 1980



2^-ΔΔCT method was used to obtain relative quantification using SsTubulin as reference gene. Data indicate average from three biological replicates and error bars represent standard deviation (±SD)

3 讨论

近年来,越来越多的研究证明HIGS技术是一种控制病原菌的有效方法,已在多种作物中获得了HIGS转基因材料,增强了病原菌抗性,比如小麦-条锈菌^[32]、棉花-黄萎病菌^[33]、番茄-灰霉病菌^[34]等。小RNAs从植物细胞进入真菌细胞的转移途径尚不十分明确,目前大多数的HIGS研究都集中在专性营养型寄生真菌中,真菌与寄主互作过程中伴随小RNA的交换^[35]。核盘菌长久以来被认为是一种典型腐生性真菌,通过杀死寄主植物细胞,从死亡组织中获得营养^[36]。但最近的研究发现核盘菌与植物的互作非常复杂,在其侵染早期存在一段短暂的活体营养时期^[37],这为利用HIGS技术防治核盘菌带来了可能。ANDRADE等尝试在烟草中沉默核盘菌Sschs,发现T₁代转基因烟草的菌核病抗性显著增强^[15],但是由于HIGS受到宿主植物与病原菌的限制,不同病原菌的致病基因或寄主植物的选择可能对于沉默效果有较大的影响^[38,39]。本研究中,将含有核盘菌SsCCS的RNAi结构转入拟南芥中,获得了HIGS-CCS转基因拟南芥,抗性鉴定发现转基因的T₁、T₂及T₃代的菌核病抗性相对野生型都显著增强,证明获得了持久稳定抗菌核病的拟南芥。

CuZn-SOD在生物体的ROS平衡调控中起着重要的作用,核盘菌中敲除CuZn-SOD后,致病力显著下降^[23],而CCS对于CuZn-SOD功能的正常行使起到关键作用^[40]。有研究显示在灰霉病菌中沉默BcCCS,灰霉菌的致病力减弱^[41]。本研究通过构建系统发育树发现,SsCCS与灰霉病菌BcCCS亲缘关系最近,因此推测SsCCS在核盘菌与宿主植物互作过程中起到关键作用,干扰该基因的表达可能会增强寄主的抗病能力。而HIGS-CCS转基因拟南芥中的SsCCS表达受到显著抑制,核盘菌在侵染转基因拟南芥过程中的致病力显著下降,证实了SsCCS是核盘菌致病力的关键基因。

拟南芥是分子生物学研究的模式植物,与油菜、萝卜、卷心菜等农作物同属于十字花科,具有较近的亲缘关系^[42]。在拟南芥中进行SsCCS的HIGS,成功获得了菌核病抗性显著增强的转基因植株,研究结果为HIGS在油菜等十字花科植物的菌核病抗病育种中的应用提供了支撑,同时有助于利用HIGS技术快速挖掘核盘菌致病相关基因,促进核盘菌致病机理的研究。

4 结论

利用HIGS方法可有效干扰核盘菌SsCCS的表达,并能够显著提高转基因拟南芥的菌核病抗性,研究结果为安全防控菌核病提供了一个重要的靶标基因。

参考文献 View Option 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] BOLAND G J, HALL R . Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum
Canadian Journal of Plant Pathology, 1994,16(2):93-108.
[本文引用: 1]

[2] BOLTON M D, THOMMA B P, NELSON B D . Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary: Biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, 2006,7(1):1-16.
[本文引用: 1]

[3] ZHANG Y, WANG X, CHANG X, SUN M, ZHANG Y, LI W, LI Y . Overexpression of germin-like protein GmGLP10 enhances resistance to Sclerotinia sclerotiorum in transgenic tobacco
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018,497(1):160-166.
[本文引用: 1]

[4] 张河山, 胡亚亚, 张娜, 魏学军, 杨文香, 刘大群 . 寄主诱导的基因沉默(HIGS)技术研究进展
农业生物技术学报, 2013,21(5):603-611.
[本文引用: 2]

ZHANG H S, HU Y Y, ZHANG N, WEI X J, YANG W X, LIU D Q . Progress of host-induced gene silencing (HIGS) technology
Journal of Agricultural Biotechnology, 2013,21(5):603-611. (in Chinese)
[本文引用: 2]

[5] 张晓娟, 张羽, 胡胜武 . 油菜菌核病抗性机理及抗病遗传育种研究进展
分子植物育种, 2016,14(3):704-711.
[本文引用: 1]

ZHANG X J, ZHANG Y, HU S W . Progress on resistance mechanism of Sclerotinia sclerotiorum and genetic breeding program on disease resistant rapeseed.
Molecular Plant Breeding, 2016,14(3):704-711. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[6] FIRE A, XU S Q, MONTGOMERY M K, KOSTAS S A, DRIVER S E, MELLO C C . Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans
Nature, 1998,391(6669):806-811.
[本文引用: 1]

[7] WIANNY F, ZERNICKA-GOETZ M . Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development
Nature Cell Biology, 2000,2(2):70-75.
[本文引用: 1]

[8] SVOBODA P, STEIN P, HAYASHI H, SCHULTZ R M . Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference
Development, 2000,127(19):4147-4156.
[本文引用: 1]

[9] NUNES C C, DEAN R A . Host-induced gene silencing: A tool for understanding fungal host interaction and for developing novel disease control strategies
Molecular Plant Pathology, 2012,13(5):519-529.
[本文引用: 1]

[10] WANG M, WEIBERG A, LIN F M, THOMMA B P, HUANG H D, JIN H . Bidirectional cross-kingdom RNAi and fungal uptake of external RNAs confer plant protection
Nature Plants, 2016,2(10):16151.
[本文引用: 1]

[11] NOWARA D, GAY A, LACOMME C, SHAW J, RIDOUT C, DOUCHKOV D, HENSEL G, KUMLEHN J, SCHWEIZER P . HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis
The Plant Cell, 2010,22(9):3130-3141.
[本文引用: 1]

[12] PANWAR V, MCCALLUM B, BAKKEREN G . Endogenous silencing of Puccinia triticina pathogenicity genes through in planta-expressed sequences leads to suppression of rust diseases on wheat
The Plant Journal, 2013,73(3):521-532.
[本文引用: 1]

[13] KOCH A, KUMAR N, WEBER L, KELLER H, IMANI J, KOGEL K H . Host-induced gene silencing of cytochrome P450 lanosterol C14 α-demethylase-encoding genes confers strong resistance to Fusarium species
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013,110(48):19324-19329.
[本文引用: 1]

[14] GHAG S B, SHEKHAWAT U K, GANAPATHI T R . Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against fusarium wilt in banana
Plant Biotechnology Journal, 2014,12(5):541-553.
[本文引用: 1]

[15] ANDRADE C M, TINOCO M L P, RIETH A F, MAIA F C O, ARAG?O F J L, . Host-induced gene silencing in the necrotrophic fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum
Plant Pathology, 2016,65(4):626-632.
[本文引用: 2]

[16] 焦春香 . 活性氧与植物防卫反应
大理学院学报(自然科学), 2006,5(10):73-76, 79.
[本文引用: 1]

JIAO C X . Reactive oxygen species in plant stress and defense
Journal of Dali University (Natural Science), 2006,5(10):73-76, 79. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[17] IMLAY J A, LINN S . DNA damage and oxygen radical toxicity
Science, 1988,240(4857):1302-1309.
[本文引用: 1]

[18] BYRD S, REINS D, DOETSCH P W . Effects of oxidative DNA damage on transcription by RNA polymerases
Free Radical Biology and Medicine, 1990,9(1):47.
[本文引用: 1]

[19] XU L, CHEN W . Random T-DNA mutagenesis identifies a Cu/Zn superoxide dismutase gene as a virulence factor of Sclerotinia sclerotiorum
Molecular Plant-Microbe Interactions, 2013,26(4):431-441.
[本文引用: 2]

[20] BOWLER C, VAN CAMP W, VAN MONTAGU M, INZé D . Superoxide dismutase in plant
Critical Reviews in Plant Science, 1994,13(3):199-218.
[本文引用: 1]

[21] BARONDEAU D P, KASSMANN C J, BRUNS C K, TAINE J A, GETZOFF E D . Nickel superoxide dismutase structure and mechanism
Biochemistry, 2004,43(25):8038-8047.
[本文引用: 1]

[22] 邹国林, 裘名宜, 朱彤 . 超氧化物歧化酶研究的历史、现状及应用前景
氨基酸杂志, 1991(3):28-32.
[本文引用: 1]

ZOU G L, QIU M Y, ZHU T . The history, current status and application prospects of superoxide dismutase research.
Journal of Amino Acids, 1991(3):28-32. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[23] VELUCHAMY S, WILLIAMS B, KIM K, DICKMAN M B . The CuZn superoxide dismutase from Sclerotinia sclerotiorum is involved with oxidative stress tolerance, virulence, and oxalate production
Physiological and Molecular Plant Pathology, 2012,78:14-23.
[本文引用: 2]

[24] HIMELBLAU E, MIRA H, LIN S J, CULOTTA V C, PE?ARRUBIA L, AMASINO R M . Identification of a functional homolog of the yeast copper homeostasis gene ATX1 from Arabidopsis
Plant Physiology, 1998,117(4):1227-1234.
[本文引用: 1]

[25] SCHMIDT P J, RAE T D, PUFAHL R A, HAMMA T, STRAIN J, O’HALLORAN T V, CULOTTV V C . Multiple protein domains contribute to the action of the copper chaperone for superoxide dismutase
The Journal of Biological Chemistry, 1999,274(34):23719-23725.
[本文引用: 1]

[26] LI Y, CAO X L, ZHU Y, YANG X M, ZHANG K N, XIAO Z Y, WANG H, ZHAO J H, ZHANG L L, LI G B, ZHENG Y P, FAN J, WANG J, CHEN X Q, WU X J, ZHAO J Q, DONG O X, CHEN X W, CHERN M, WANG W M . Osa-miR398b boosts H₂O₂ production and rice blast disease-resistance via multiple superoxide dismutases
New Phytologist, 2019,222(3):1507-1522.
[本文引用: 1]

[27] 周元委 . 叶绿素合成酶基因在甘蓝型油菜及拟南芥种子生育酚合成过程中的作用研究
[D]. 武汉: 华中农业大学, 2017
[本文引用: 1]

ZHOU Y W . The role of chlorophyll synthetase for tocopherol synthesis in canola and Arabidopsis seeds
[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2017. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[28] 张莉芳, 杨正修, 张学文, 龙炎杏, 赵燕 . 荠菜雌蕊调控转录因子SPT基因的克隆与拟南芥遗传转化
作物研究, 2018,32(3):202-207.
[本文引用: 1]

ZHANG L F, YANG Z X, ZHANG X W, LONG Y X, ZHAO Y . Cloning of the gene of pistil-regulated transcription factor in Capsella bursa-pastoris and its genetic transformation in Arabidopsis thaliana.
Crop Research, 2018,32(3):202-207. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[29] 远俊虎, 丁一娟, 杨文静, 闫宝琴, 柴亚茹, 梅家琴, 钱伟 . 利用TRV-HIGS技术鉴定核盘菌致病相关的分泌蛋白基因
中国农业科学, 2019,52(23):4274-4284.
URL [本文引用: 1]

YUAN J H, DING Y J, YANG W J, YAN B Q, CHAI Y R, MEI J Q, QIAN W . Identification of genes encoding secretory proteins related to the pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum using TRV-HIGS.
Scientia Agricultura Sinica, 2019,52(23):4274-4284. (in Chinese)
URL [本文引用: 1]

[30] GUAN L M, SCANDALIOS J G . Hydrogen peroxide-mediated catalase gene expression in response to wounding
Free Radical Biology and Medicine, 2000,28(8):1182-1190.
[本文引用: 1]

[31] 陈秀秀, 张彤, 余倩文, 周薇, 安逸民, 杜秉昊, 郭长虹 . 紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL的克隆及功能分析
植物遗传资源学报, 2019,20(3):750-759.
[本文引用: 1]

CHEN X X, ZHANG T, YU Q W, ZHOU W, AN Y M, DU B H, GUO C H . Cloning and functional analysis of F-box protein gene MsFTL in alfalfa(Medicago sativa L.).
Journal of Plant Genetic Resources, 2019,20(3):750-759. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[32] ZHU X, QI T, YANG Q, HE F, TAN C, MA W, VOEGELE R T, KANG Z, GUO J . Host-induced gene silencing of the MAPKK gene PsFUZ7 confers stable resistance to wheat stripe rust
Plant Physiology, 2017,175(4):1853-1863.
[本文引用: 1]

[33] ZHANG T, JIN Y, ZHAO J H, GAO F, ZHOU B J, FANG Y Y, GUO H S . Host-induced gene silencing of the target gene in fungal cells confers effective resistance to the cotton wilt disease pathogen Verticillium dahlia
Molecular Plant, 2016,9(6):939-942.
[本文引用: 1]

[34] WEIBERG A, WANG M, LIN F M, ZHAO H, ZHANG Z, KALOSHIAN I, HUANG H D, JIN H . Fungal small RNAs suppress plant immunity by hijacking host RNA interference pathways
Science, 2013,342(6154):118-123.
[本文引用: 1]

[35] HUA C, ZHAO J H, GUO H S . Trans-Kingdom RNA silencing in plant-fungal pathogen interactions
Molecular Plant, 2018,11(2):235-244.
[本文引用: 1]

[36] WILLIAMS B, KABBAGE M, KIM H J, BRITT R, DICKMAN M B . Tipping the balance:Sclerotinia sclerotiorum secreted oxalic acid suppresses host defenses by manipulating the host redox environment
PLoS Pathogens, 2011,7(6):e1002107.
[本文引用: 1]

[37] KABBAGE M, YARDEN O, DICKMAN M B . Pathogenic attributes of Sclerotinia sclerotiorum: switching from a biotrophic to necrotrophic life style
Plant Science, 2015,233:53-60.
[本文引用: 1]

[38] ZHANG M X, WANG Q H, XU K, MENG Y L, QUAN J L, SHAN W X . Production of dsRNA sequences in the host plant is not sufficient to initiate gene silencing in the colonizing oomycete pathogen Phytophthora parasitica
PLoS ONE, 2011,6(11):e28114.
[本文引用: 1]

[39] GOVINDARAJULU M, EPSTEIN L, WROBLEWSKI T, MICHELMORE R W . Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce
Plant Biotechnology Journal, 2015,13(7):875-883.
[本文引用: 1]

[40] WANG L, GE Y, KANG Y J . Effect of copper on nuclear translocation of copper chaperone for superoxide dismutase-1
Experimental Biology and Medicine, 2016,241(14):1483-1488.
[本文引用: 1]

[41] ROLKE Y, LIU S, QUIDDE T, WILLIAMSON B, SCHOUTEN A, WELTRING K M, SIEWERS V, TENBERGE K B, TUDZYNSKI B, TUDZYNSKI P . Functional analysis of H₂O₂-generating systems in Botrytis cinerea: The major Cu-Zn-superoxide dismutase (BCSOD1) contributes to virulence on French bean, whereas a glucose oxidase (BCGOD1) is dispensable
Molecular Plant Pathology, 2004,5(1):17-27.
[本文引用: 1]

[42] 张金平 . “植物中的果蝇”—拟南芥
农药市场信息, 2016(10):70-71.
[本文引用: 1]

ZHANG J P . “Drosophila in Plants”- Arabidopsis.
Pesticide Market News, 2016(10):70-71. (in Chinese)
[本文引用: 1]