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葡萄SAP家族的鉴定与表达分析

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

丁兰, 顾宝, 李培楹, 舒欣, 张剑侠,西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室 陕西杨凌712100

Genome-Wide Identification and Expression Analysis of SAP Family in Grape

DING Lan, GU Bao, LI PeiYing, SHU Xin, ZHANG JianXia,College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas Yangling 712100, Shaanxi

通讯作者: 张剑侠,E-mail: zhangjx666@126.com

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2019-02-25接受日期:2019-05-7网络出版日期:2019-07-16
基金资助:陕西省重点项目-农业.2017ZDXM-NY-026
国家科技支撑计划子课题.2013BAD02B04-06


Received:2019-02-25Accepted:2019-05-7Online:2019-07-16
作者简介 About authors
丁兰,E-mail: Dyrope@163.com。







摘要
【目的】通过生物信息学分析明确SAP(Stress Associated Protein)家族在葡萄基因组中的数量、结构,利用qRT-PCR技术分析SAP家族的生物节律和在激素、非生物胁迫处理下的表达模式,为进一步探究SAP家族在葡萄中的作用奠定基础。【方法】在前期从山葡萄‘双优’(Vitis amurensis cv. Shuangyou)和欧洲葡萄‘红地球’(Vitis vinifera cv. Red Globe)0℃寒胁迫下转录组数据库中筛选出表达量明显上调的基因SAP15基础上,利用NCBI和葡萄基因组数据库中的BLAST功能,根据SAP家族的保守结构域,鉴定葡萄基因组中的SAP。利用生物信息学软件DNAMAN5.0、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA6等对VvSAPs序列、基因结构、蛋白质结构、理化性质、染色体定位和进化树等进行分析。采用qRT-PCR方法检测VvSAP家族的生物节律和在激素、逆境处理下的表达特征。【结果】从葡萄(Vitis vinifera)全基因组中鉴定得到15个SAP家族成员,均含有AN1保守结构域,大多含有A20保守结构域。按照其保守结构域和在染色体上的位置,依次命名为VvSAP1VvSAP15,可分为Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ三类。理化性质分析表明,VvSAP家族编码氨基酸数目介于109—293,理论等电点分布在7.99—9.68。染色体定位分析发现,该基因家族的15个基因分布于葡萄的9条染色体上,其中第8条染色体上分布最多,有3个VvSAP。亚细胞定位分析表明,VvSAP家族主要在细胞核、叶绿体和细胞骨架中进行表达。VvSAP家族的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。基因结构分析表明,VvSAP1VvSAP12的DNA序列中均无内含子,VvSAP13VvSAP15的DNA序列中有1个内含子,基因结构高度保守。qRT-PCR分析结果表明,在VvSAP家族成员中,VvSAP1VvSAP9在无处理和各处理下(激素和非生物胁迫)均表达极低或不表达,初步鉴定为假基因。除VvSAP10在400 mmol·L -1 NaCl处理下呈下调表达,其余基因均在50 μmol·L -1 ABA、100 μmol·L -1SA和400 mmol·L -1NaCl处理下呈上调表达,其中,VvSAP10VvSAP14显著响应50 μmol·L -1 ABA胁迫,处理24 h后相对表达量分别上调为0 h的37.19、36.63、21.69、58.34和267.35倍;VvSAP8VvSAP11在NaCl处理4 h后相对表达量最高,分别为0 h的13.16和12.42倍;在4℃低温胁迫下,相对表达量上调最高的是VvSAP15,处理后8 h相对表达量为0 h的35.90倍。 【结论】从葡萄基因组中共鉴定出15个SAP家族成员,初步鉴定得出VvSAP1VvSAP9为假基因,15个基因分别分布于9条染色体上,并且结构进化高度保守。所有成员均相响应逆境,且均有昼夜节律变化,但该基因家族成员在不同逆境胁迫下的响应程度和在不同时间点的表达模式存在一定的差异。
关键词: 葡萄;SAP家族;生物节律;激素;非生物胁迫;表达分析

Abstract
【Objective】The aim of this paper was to identify the Stress Associated Protein (SAP) family genes of grape (Vitis vinifera L.) genome and to know the profile of SAP family regarding the number and structure of genes. The biological rhythm of SAP family and its expression pattern under different hormones and abiotic stress were analyzed by qRT-PCR. The study would provide theoretical basis for further exploring the roles of SAP family genes in grapevine. 【Method】SAP15, a gene selected from the transcriptome database of Vitis amurensis cv. ‘Shuangyou’ and Vitis vinifera cv. ‘Red Globe’, had a significantly up-regulated expression under the cold treatment. According to the conserved structural domains, the SAPs in grape genome-wide were identified by BLAST of NCBI and grape genome database. DNAMAN5.0, MEME, GSDS2.0, ExPASy and MEGA6 software were used for various bioinformatics analysis of VvSAPs, including the study of nucleotide sequences, gene structure, protein structure, physical and chemical properties, chromosome localization and phylogeny. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was employed to detect the circadian rhythm of VvSAPs and their relative expression levels under hormone and abiotic stress.【Result】In total, 15 SAPs with conservative domains of AN1 were identified from grape genome and most of them contained A20 conservative domain. They could be classified into Class Ⅰ, Class Ⅱ and Class Ⅲ based on their conservative structure domain and the location on chromosome in grape. Analysis of physical and chemical properties of VvSAP family showed that the numbers of amino acids were between 109 and 293, and the theoretical equivalence points were between 7.99 and 9.68. Localization of genes on the chromosome revealed that 15 VvSAPs were distributed on 9 chromosomes of the grape, and there were 3 SAPs on chromosome 8. By the sub-cellular location analysis, we noticed that VvSAPs were mainly expressed in nucleus, chloroplast and cytoskeleton in grape. The secondary structure of VvSAP were mainly irregular crimp and α-helix. The gene structures were highly conserved, and VvSAP1-VvSAP12 had no intron, while VvSAP13-VvSAP15 contained one intron. The results of qRT-PCR analysis showed that VvSAP1 and VvSAP9 had extremely low expression or no expression under hormone and abiotic treatment, so they were preliminarily identified as pseudogenes. While VvSAP10 was proved to be down-regulated under 400 mmol·L -1NaCl treatment, the remaining genes were up-regulated under 50 μmol·L -1 ABA, 100 μmol·L -1SA and 400 mmol·L -1NaCl treatment, respectively. VvSAP10-VvSAP14 were highly responsive to 50 μmol·L -1ABA treatment, and their relative expressions were improved by 37.19, 36.63, 21.69, 58.34 and 267.35 times, respectively, after 24 hours treatment. After 4 hours under NaCl treatment, VvSAP8 and VvSAP11 had the highest relative expression level, which were 13.16 and 12.42 times higher than those without NaCl treatment, respectively. The VvSAP15 had the highest response towards 4℃ treatment, and its relative expression level was 35.90 times after 8 hours treatment comparing to the 0 hour.【Conclusion】15 VvSAPs family were identified from the grape genome, of which VvSAP1 and VvSAP9 were preliminarily identified as pseudogenes. These members were localized across 9 chromosomes of the grape, and the evolution of VvSAP was highly conservative. All members of VvSAP family responded to adversity and had circadian rhythm, However, the expression pattern of VvSAPs was varied under different stress.
Keywords:grape;SAP family;circadian rhythm;hormone;abiotic stress;expression analysis


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本文引用格式
丁兰, 顾宝, 李培楹, 舒欣, 张剑侠. 葡萄SAP家族的鉴定与表达分析[J]. 中国农业科学, 2019, 52(14): 2500-2514 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.14.009
DING Lan, GU Bao, LI PeiYing, SHU Xin, ZHANG JianXia. Genome-Wide Identification and Expression Analysis of SAP Family in Grape[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(14): 2500-2514 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.14.009


0 引言

【研究意义】葡萄(Vitis vinifera L.)是世界第三大水果,也是我国重要的果树作物,但冻害一直是葡萄生产中存在的突出问题[1],干旱、盐碱等生长环境都给葡萄生产者和葡萄产业造成了不便和严重损失[2]。因此,研究逆境胁迫相关基因,有针对性地对葡萄进行基因改造,对提高葡萄的抗逆性具有重要意义[3]。SAP(Stress Associated Protein)蛋白家族是一类响应和调控多种逆境胁迫的锌指蛋白,在植物抵抗逆境胁迫中发挥着重要作用,开展葡萄SAP家族鉴定、生物信息学和表达分析,将为了解葡萄响应逆境胁迫的分子机制奠定基础。【前人研究进展】锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子,能够调控逆境相关基因,参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应[4]。SAP家族具有AN1或A20保守结构域,在动物中的研究较为成熟,现已研究得出位于蛋白N端的A20结构域,由多个Cys2/Cys2锌指基元组成,保守序列为CX2-4CX11CX2C(X代表任意氨基酸),在免疫、发育和细胞增殖中都发挥了重要作用[5,6]。而对于C端的AN1结构域,目前仅了解到它最早在编码非洲爪蟾动物半球母体RNA的蛋白中被发现,保守序列为CX2Cx9-12CXl-2CX4CX2HX5HXC,其具体功能并未明确[7]。在植物中,关于SAP家族的研究主要集中在水稻(Oryza sativa[8]和拟南芥(Arabidopsis thaliana[9]中,已分别鉴定出18和14个SAP家族基因,并已对其进行了较为系统的研究;在番茄(Solanum lycopersicum[10]、棉花(Gossypium hirsutum[4]、甘蔗(Saccharum officinarum[11]、香蕉(Musa nana L.)[12]、羊草(Leymus chinensis[13]等植物中也对SAP有研究报道。目前在植物中鉴定出的SAP均响应多种非生物胁迫,例如,水稻OsiSAP7负调控种子萌发早期对ABA胁迫信号的响应[14],在水稻和烟草中过表达OsiSAP8可增强其对盐碱、干旱、低温胁迫的耐受性[15],在水稻中过表达高粱SbSAP14可提高其耐盐性[16],过表达AlSAP可以提高旱地中水稻的产量[17]。【本研究切入点】葡萄作为重要的经济果树,迄今在葡萄中未有关于SAP的克隆和功能研究的报道,对于葡萄中SAP的数量、理化性质和功能尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究通过SAP的保守结构域,在NCBI数据库和葡萄全基因组中搜索,鉴定SAP家族成员,分析基因理化性质、染色体定位及系统发育等信息,同时研究葡萄SAP家族在多种逆境下的表达特征及生物节律特征,为进一步探究SAP功能提供依据。

1 材料与方法

试验于2018年在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室进行。

1.1 试材与处理

前期对于葡萄寒胁迫下转录组分析所用试验材料为山葡萄‘双优’(Vitis amurensis cv. Shuangyou)和欧洲葡萄‘红地球’(Vitis vinifera cv. Red Globe),保存于西北农林科技大学葡萄种质资源圃。本试验所用试材为‘红地球’试管苗,保存于本实验室。2018年4月将生长情况一致的试管幼苗(长约12 cm)移栽至人工气候室(条件设置为25℃,200 μmol·m-2·s-1光照16 h,暗培养8 h)中培养3个月。对材料进行激素处理(50 μmol·L-1 ABA、100 μmol·L-1 SA)(等体积蒸馏水处理为对照),高盐处理(400 mmol·L-1 NaCl)和低温处理(4℃)。具体步骤如下:在室温下,将50 μmol·L-1 ABA、100 μmol·L-1 SA和400 mmol·L-1 NaCl分别喷施在葡萄叶片上;低温处理采用RXZ型人工气候箱(条件设置为4℃,200 μmol·m-2·s-1光照16 h,暗培养8 h);每个处理设置3组重复,分别在0、0.5、1、2、4、8、12和24 h采集叶片,并分别于北京时间0:00、3:00、6:00、9:00、12:00、15:00:18:00、21:00采集未处理的葡萄叶片用于昼夜节律分析。将采集的材料用液氮速冻后,保存于-80℃冰箱备用。

1.2 葡萄SAP家族成员鉴定

根据SAP家族的AN1和A20保守结构域,在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和葡萄全基因组数据(http://www.genoscope.cns.fr/externe/ GenomeBrowser/Vitis/)中查询和确定葡萄中的SAP家族成员,手动去除重复序列,最终获得葡萄中的SAP家族成员。

1.3 葡萄SAP家族的生物信息学分析

在Grape Genome Browser(http://www.genoscope. cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/) 中获得葡萄SAP家族各基因的染色体位置、CDS编码区序列及基因组DNA序列,利用在线软件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku. edu.cn/index.php)绘制基因结构示意图[18],并运用Adobe Illustrator软件进行染色体定位作图;利用在线网站EXPASY(http://web.expasy.org/protparam/)中ProtParam工具对葡萄SAP家族所编码蛋白的氨基酸组成、疏水性、等电点等理化性质进行分析;利用WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolfpsort.html)在线软件进行亚细胞定位预测[19];利用在线网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)分析二级结构;基序预测利用在线软件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行motif系列分析;利用本地软件DNAMAN进行蛋白多序列比对;利用MEGA6软件,用最大似然法(Maximum likelihood)对已鉴定的葡萄、拟南芥和水稻SAP家族蛋白进行系统进化树构建,Bootstrap值设置为1 000。

1.4 葡萄SAP家族表达分析

根据基因序列设计实时荧光定量 PCR 特异引物(表1),以葡萄Actin(XM_002265440)作为内参基因,采用OMEGA试剂公司的植物RNA提取试剂盒提取经过处理后的葡萄叶片RNA,利用TaKaRa公司的反转录试剂盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一条链,将cDNA稀释到相同浓度后用作实时荧光定量PCR的模板。qRT-PCR的反应体系为20 μL,包括1 μL cDNA模板,上、下游引物分别0.8 μL,SYBR Green荧光染料为10 μL,ddH2O 7.4 μL。反应程序为:95℃变性1 min,95℃变性10 s,58℃退火20 s,72℃延伸20 s,40个循环。每个处理设置3个重复,基因相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。

Table 1
表1
表1VvSAP家族表达分析的实时荧光定量引物
Table 1qRT-PCR primers for expression on analysis of VvSAP
基因Gene上游引物(5′-3′)Forward primer(5′-3′)下游引物(5′-3′) Reverse primer(5′-3′)
VvSAP1TCCACGAAGAAGTCGGAGCAGCAAACGATGCTTCCCACAG
VvSAP2TGAGCTGCAACAAGAAGGTGTCAGCCTTAACCACCGGATT
VvSAP3ATTGTCGATGCGGTCACCTTCCTTGACAACAGGGTTGGCT
VvSAP4CTGCAATTCTCTGCGCCAATCTTCCTCGATTCCCGAACC
VvSAP5GCGGCCAATGAAATCACTGTTACAGAACGTGATCCCACACC
VvSAP6AGTCCAAGGTCAAGGAGGGATGCAGCAGTCCGGTAATCAA
VvSAP7TTCTGCGCTGAGCATCGGTACAGACTCTCACGATCTTCGCA
VvSAP8TTGTGCTTCACCAAGCGAGACGGTCCTGTAGTCGAATGGG
VvSAP9GGTGTGGGAGTATGTTCTCATAACCTTCCTGGTAACTTC
VvSAP10TTGTTACCTCCATGACTCAATTATCACATACTTCCACATCGGCACTT
VvSAP11CATGAGCTGCAACAAGAAGGAGCCTTAACCACCGGATTAG
VvSAP12CCGAAACTCTAACCCTATGCGTTCACCTCCCTCCTTCTCACA
VvSAP13GAGGGAGGTGAACTGGTGCTGTCCTGCCGCCTTGTAATCG
VvSAP14GATGGAGTGGGACAGAGCAGCTTACAGCAGCTCGGTTGGA
VvSAP15ACTGCGACCCGTCAAAGAAAAACCGATGCTTGAGGCAGAA

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2 结果

2.1 葡萄SAP家族鉴定及序列分析

从葡萄基因组和NCBI数据库中共鉴定出15个SAP家族基因,根据其保守结构域和在染色体上的位置,依次命名为 VvSAP1-VvSAP15。15个VvSAPs图1)分别位于第1、2、6、7、8、13、14、16和18条染色体上,其中VvSAP5、VvSAP6VvSAP14位于第8条染色体,第2、6、13和16条染色体分别分布在两个VvSAP。结果(表2)显示,葡萄SAP家族基因编码区长度为330—882 bp,编码109—293个氨基酸,等电点为7.99—9.68,均为碱性蛋白。氨基酸序列的平均亲水系数在-0.300—-0.904,均为负值,表明这些蛋白均为亲水蛋白,但亲水程度不同。对VvSAP家族基因进行亚细胞定位预测,结果显示(表3)它们都存在于细胞核中,大部分存在于叶绿体和细胞骨架中,初步推测该家族主要存在于进行光合作用的器官中,并参与了细胞壁的形成。其中,只有VvSAP14和VvSAP15不存在于叶绿体和细胞骨架,VvSAP9、VvSAP10还定位于过氧化物酶体和细胞质中。通过二级结构预测表明(表4),VvSAP二级结构以无规则卷曲和α-螺旋结构为主,拓展链结构和β-转角结构所占比例较小,其中VvSAP9VvSAP14和VvSAP15的无规则卷曲结构所占比例最大,分别为60.13%、62.12%和73.02%;VvSAP1、VvSAP3和VvSAP10的α-螺旋结构所占比例最大,分别为为30.26%、31.4%和34.87%。

图1

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图1葡萄SAP家族在染色体上的位置

Fig. 1The chromosome location of the SAP family in Vitis vinifera



Table 2
表2
表2VvSAP家族成员蛋白质的理化性质
Table 2Physicochemical property of VvSAP proteins
基因
Gene
基因号
Gene ID
氨基酸数
Amino acid number
等电点
Theoretical
pI
分子量
Molecular weight (Da)
不稳定指数 Instability index脂溶指数 Aliphatic index总平均疏水指数
Average of hydropathicity (GRAVY)
VvSAP1LOC1002663261529.1017119.9833.3055.52-0.600
VvSAP2LOC1002598451728.7718460.8346.6846.05-0.494
VvSAP3LOC1002672371727.9918502.9527.1556.80-0.500
VvSAP4LOC1002424101418.2815277.2136.5754.75-0.509
VvSAP5LOC1002648221618.9217192.6849.4466.21-0.300
VvSAP6LOC1002435831727.9918153.5730.4368.72-0.327
VvSAP7LOC1008524281728.9518359.6932.9857.50-0.486
VvSAP8LOC1008524601728.2218504.1146.9961.40-0.371
VvSAP9LOC1002651561539.1017153.9838.5650.39-0.699
VvSAP10LOC1002651511528.7716850.5421.9258.36-0.558
VvSAP11LOC1008527561099.2311757.3354.1343.85-0.471
VvSAP12LOC1002518361269.1314293.2954.4353.41-0.901
VvSAP13LOC100854291269.6814575.8941.0453.41-0.904
VvSAP14LOC1002555062938.5632457.7840.1658.84-0.614
VvSAP15LOC1002455741898.7421133.1149.6147.99-0.800

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Table 3
表3
表3葡萄SAP家族亚细胞定位预测
Table 3Subcellular location prediction of SAP family in Vitis vinifera
基因
Gene
细胞核
Nucleus
叶绿体
Chloroplast
细胞外
Extracellular
细胞骨架
Cytoskeleton
线粒体
Mitochondria
过氧化物酶体
Peroxisome
细胞质和细胞核
Cyto_nucl
质膜
Plasma membrane
VvSAP164211---
VvSAP281212---
VvSAP391-4----
VvSAP4310-1----
VvSAP543-34---
VvSAP65423----
VvSAP746112---
VvSAP88213----
VvSAP92.54-1.5-62.5-
VvSAP102.53-2.5-63-
VvSAP1142233---
VvSAP1256111---
VvSAP1382111--1
VvSAP1414-------
VvSAP1513------1

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Table 4
表4
表4VvSAP蛋白的二级结构
Table 4The secondary structure of VvSAP
蛋白名称 Protein nameα-螺旋 Alpha helix (%)拓展链结构 Extended strand (%)β-转角 Beta turn (%)无规则卷曲 Random coil (%)
VvSAP130.2611.184.6153.95
VvSAP226.7411.052.9159.30
VvSAP331.4012.213.4952.91
VvSAP429.7912.773.5553.90
VvSAP525.4710.564.3559.63
VvSAP629.6511.053.4955.81
VvSAP723.8412.214.0759.88
VvSAP823.8412.795.2358.14
VvSAP923.5311.115.2360.13
VvSAP1034.8711.843.2950.00
VvSAP1115.6023.8510.0950.46
VvSAP1217.4620.633.9757.94
VvSAP1327.7817.467.1447.62
VvSAP1424.9110.922.0562.12
VvSAP1511.1111.114.7673.02

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2.2 葡萄SAP家族motif和保守结构域分析

利用MEME在线工具预测VvSAPs蛋白保守基序,由图2可知,VvSAPs中含有8个保守基序,主要的保守基序有5个:VvSAP1—VvSAP10的N端均含有保守的motif1,VvSAP1—VvSAP13的C端均含有保守的motif2、3;VvSAP14和VvSAP15包含保守基序motif7、8。除此之外,VvSAP3、VvSAP6和VvSAP8还包含保守基序motif5和motif6。

图2

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图2葡萄SAP家族的序列分析

A:葡萄SAP家族motif分析;B:MEME预测的8个保守位点LOGO图
Fig. 2SAP family sequence analysis in Vitis vinifera

A: SAP family motif analysis in Vitis vinifera; B: LOGO of 8 conserved motif of SAP domain


通过对15个VvSAP蛋白序列进行多序列比对(图3),发现VvSAP1—VvSAP10蛋白序列都在N端含有1个由21个氨基酸LCXNXCGFXGX2ATXNXCXKC组成的A20保守结构域,VvSAP1—VvSAP13蛋白序列在C端均含有1个由32个氨基酸CX2CX4GX2GFX3CG 2FCX2HRX4HXCX2DX组成的AN1保守结构域,VvSAP14、VvSAP15蛋白序列含有2个AN1结构域,不含A20保守结构域。多序列比对结果和motif分析结果基本吻合,进一步说明该基因家族序列高度保守,所有基因都含AN1保守结构域,大部分基因含有A20保守结构域,在葡萄体内可能行使相似功能。

图3

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图3葡萄SAP氨基酸序列一致性分析

Fig. 3Identify analysis of grape SAP proteins



2.3 葡萄SAP家族基因结构和进化树分析

通过对VvSAP家族基因进行结构分析,如图4所示,发现VvSAP1VvSAP12均无内含子,VvSAP13vSAP15均含有1个内含子,说明该基因家族相对保守。

图4

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图4葡萄SAP家族进化树及基因结构

Fig. 4The phylogenetic tree and gene structure of SAP family in Vitis vinifera



为了了解葡萄SAP成员间的亲缘关系和进化特性,推测其生物功能,利用MEGA6软件构建拟南芥、水稻和葡萄SAP家族的系统进化树(图5)。结果表明,这3个物种的SAP成员相互嵌合在一起,形成3大分支(Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ),表明植物SAP在进化过程中相对保守。其中,Class Ⅲ含有成员最多,共计21个,包括7个葡萄VvSAPs,5个拟南芥AtSAPs和9个水稻OsSAPs;Class Ⅱ所含成员最为保守,都具有A20/AN1保守结构域,共计15个,包括葡萄中6个(VvSAP3VvSAP8),拟南芥中5个(AtSAP2AtSAP6)和4个水稻OsSAPs;Class Ⅰ包括2个葡萄VvSAPs,4个拟南芥AtSAPs和5个水稻OsSAPs,其成员保守结构域为AN1/AN1-AN1/AN1- AN1-C2H2-2H2。在这些成员中VvSAP6VvSAP8分别与AtSAP4AtSAP6、AtSAP5、OsSAP4的亲缘关系较近,VvSAP11VvSAP15分别与AtSAP7、AtSAP8、AtSAP10、AtSAP14、AtSAP12的亲缘关系较近,推测这些SAP可能具有类似的生物功能。

图5

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图5葡萄(●)、拟南芥和水稻SAP家族的系统发育进化树

Fig. 5Phylogenetic tree of SAP gene family in V.vinifera(●), A. thaliana and O. sativa



2.4 葡萄SAP表达特征分析

为了明确葡萄SAP的生物钟节律和在逆境胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR技术对葡萄叶片中的SAP在不同时间点和不同处理下的相对表达量进行分析。结果显示(图6),VvSAP1VvSAP9在各种处理下均表达非常低或不表达,初步预测VvSAP1VvSAP9为假基因。

图6

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图6葡萄SAP家族的生物钟节律和在不同处理下的相对表达量

CR:生物钟节律;ABA:脱落酸;SA:水杨酸;NaCl:氯化钠;LT:低温
(横坐标)CR 1—8:北京时间 0:00、3:00、6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00;ABA/SA/NaCl/LT 1—8:处理后0、0.5、1、2、4、8、12和24 h
误差线代表3个生物学重复的标准偏差,星号代表处理内显著性差异水平,*:P <0.05;**:P <0.01;***:P<0.001
Fig. 6Relative expression of SAPs under circadian and different treatments

CR: Circadian rhythm; ABA: Abscisic acid; SA: Salicylic acid; NaCl: Sodium chloride; LT: Low temperature
(Abscissa)CR 1-8: Beijing time 0:00, 3:00, 6:00, 9:00, 12:00, 15:00, 18:00, 21:00;ABA/SA/NaCl/LT 1-8: 0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h and 24 h after treatment
Error bars represent the standard deviation of three biological replicates. *, **, *** indicate P<0.05, P<0.01and P<0.001, respectively


VvSAP7、VvSAP14、VvSAP15在0:00时,其相对表达量最高,VvSAP5、VvSAP10VvSAP13在18:00时表达量较高,初步推断葡萄叶片中的SAP在北京时间0:00、18:00相对表达量最高。

VvSAP家族受50 μmol·L-1 ABA、100 μmol·L-1 SA、400 mmol·L-1 NaCl和4℃低温的诱导,各基因在各处理下表达量具有较显著的差异。在50 μmol·L-1 ABA处理条件下,VvSAP家族均呈现上调表达,VvSAP3、VvSAP5、VvSAP6VvSAP15分别在处理后12 h、8 h、8 h、24 h相对表达量达到最高值;其余SAP相对表达量均在处理24 h时达到最高值,其中VvSAP7、VvSAP10、VvSAP11、VvSAP12、VvSAP13VvSAP14在处理24 h时分别是0 h的17.51、37.19、36.63、21.68、58.34和266.83倍,初步推测SAP家族受50 μmol·L-1 ABA强烈诱导,且为中后期响应,其中VvSAP14响应最为剧烈。相比之下,100 μmol·L-1 SA处理后的SAP家族中,VvSAP11、VvSAP13、VvSAP14在处理4 h内,相对表达量明显上调,表明这3个基因可以迅速响应SA信号,其他基因在处理后期相对表达量较高。

NaCl盐胁迫和4℃低温胁迫结果显示,在NaCl胁迫下,VvSAP10在0 h相对表达量最高,虽然在2 h、12 h时候表达量略微上升,但总体呈下调趋势;其余SAP均受盐胁迫诱导,VvSAP3、VvSAP4、VvSAP5、VvSAP6、VvSAP7、VvSAP12、VvSAP15的相对表达量均在处理后期达到最高值。4℃低温处理下,VvSAP2、VvSAP3、VvSAP4、VvSAP5、VvSAP8、VvSAP10在处理4 h时相对表达量最高,VvSAP15在处理8 h时相对表达量达到最高,为0 h的35.90倍。初步推测葡萄中SAP家族基因对盐胁迫的响应多在后期,其中,VvSAP11表达量上调最明显;对低温胁迫的响应多在中期,其中,VvSAP15表达量上调最明显。上述结果表明,VvSAP家族基因参与了葡萄的非生物胁迫应答,且只有VvSAP10在盐胁迫下表达受到抑制,其他基因在盐胁迫和低温胁迫下表达均受到诱导。

3 讨论

葡萄的生长受多种非生物胁迫的影响,分子生物学的不断发展为提高葡萄的抗逆性提供了一条崭新途径。迄今,已有一些抗逆性相关基因被从葡萄中克隆分离出来,但对葡萄抗逆相关基因的功能及响应冷胁迫的信号转导通路仍然知之甚少[20,21,22,23,24,25]。SAP是一类含A20或AN1保守结构域的C2H2双锌指蛋白,可直接参与植物对逆境胁迫的响应。A20/AN1型蛋白在动物细胞凋亡、免疫、炎症和植物响应胁迫中都起着重要作用[26,27,28,29,30]。研究表明,A20/AN1蛋白是植物响应逆境胁迫分子机制中的上游调控因子,通过抑制或激活信号传递相关蛋白进而调控下游基因表达[4]

SAP家族成员已从多个物种中被分离鉴定出来,但不同物种中SAP家族成员数量不同。本研究利用葡萄基因组数据库,共鉴定出VvSAP 15个,比拟南芥(14个)[31]、番茄(13个)[10]中的成员数量均多,但少于水稻(18个)[31]和胡杨(18个)[32]。对VvSAP家族的保守结构域进行分析,发现所有VvSAP都含有AN1保守结构域,66.67%的VvSAP中含有A20和AN1两个保守结构域,这和其他物种中的SAP家族特征相符。在低等生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中仅发现了AN1蛋白,在植物SAP家族中仅发现OsSAP18只含有A20结构域,因此预测AN1在进化上可能比A20更为古老[31]。通过分析葡萄、拟南芥和水稻的进化树,发现结构相似的SAP往往亲缘关系较近,此规律在Class Ⅱ类SAP中最为明显,所有此类SAP均含A20/AN1结构域。大片段重复和串联重复是植物基因家族扩展的两个主要原因[33],为了更深入地了解葡萄SAP家族的扩张模式,本研究在植物基因组复制数据库发现SAP2SAP10,SAP6SAP8,SAP6SAP12,SAP8SAP12为片段复制基因,未发现串联重复,因此初步推测大片段复制可能是葡萄SAP家族进化的主要动力。

外显子-内含子结构多样性在基因家族进化中发挥着重要作用,可为系统发育分析提供依据[34,35]SAP家族的一个重要特征是普遍缺乏内含子,在水稻中,11个OsSAPs没有内含子,6个只有1个内含子,只有一个成员(OsSAP8)有2个内含子[31]。在拟南芥中,3个AtSAPs没有内含子,9个有1个内含子,只有AtSAP2AtSAP14分别有2和3个内含子。这些无内含子的SAP可以减少转录后的加工,在非生物胁迫下可以被快速转录和翻译[36,37]。然而,VvSAPs并不完全符合这一假设,VvSAP13VvSAP15都包含1个内含子,但它们在低温、NaCl、SA和ABA处理下的响应速度和表达变化与其他家族成员没有明显差别。

通过对VvSAPs表达模式进行分析,发现多数VvSAP都具有生物节律,且在0:00和18:00表达量较高,初步推测原因可能因为夜间的生长环境相比于白天较恶劣。所有VvSAPs均受ABA诱导,部分家族成员受NaCl、SA和低温诱导。其中,具有A20和AN1两个结构域的Class Ⅱ亚族中的VvSAPs在ABA处理下表达量持续上升。VvSAP6、VvSAP8和OsSAP8[15]同源性较高,且均响应盐胁迫和低温胁迫;VvSAP3、VvSAP5、VvSAP7和OsSAP1[38]亲缘关系较近,在NaCl胁迫下的表达模式相似,相对表达量均为上升-下降-上升趋势;VvSAP15和AtSAP12在进化树上属于同一分枝,且都具有2个AN1保守结构域,其相对表达量在低温和盐胁迫下均上调,根据现有研究,推测VvSAP15为一个氧化还原剂感应器,在氧化还原剂的处理下,其构象改变,与蛋白结合,激活或抑制调控信号传递[39]。根据SAP家族的进化树分析和表达模式分析,推测SAP家族高度保守的结构域使不同物种间亲缘关系较近的SAP表达模式相似,但与所含A20和AN1蛋白的数量无明显关联。

4 结论

从葡萄基因组中鉴定出15个SAP,均含有SAP蛋白特有的A20或AN1保守结构域,可分为3大类。除VvSAP13VvSAP15含有1个内含子外,其余成员均无内含子。亚细胞定位预测显示,葡萄SAP家族成员在细胞核中均存在。通过实时荧光定量PCR技术对葡萄SAP家族进行表达分析,结果表明VvSAP1VvSAP9为假基因,其余VvSAP均具有生物节律,且在0:00和18:00相对表达量较高。在响应不同时间、不同逆境胁迫时,不同的基因具有不同的表达模式。

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【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 &mu;g&bull;mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol&bull;L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U&bull;g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg&bull;g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg&bull;g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol&bull;g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol&bull;g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。
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<P><FONT face=Verdana>【目的】以河北怀来霞多丽葡萄为研究对象,分析温度、日照时间对霞多丽葡萄成熟度指标的影响。【方法】根据2004—2008这5年的田间试验结果与气象材料,综合运用相关性分析、主成分分析、回归分析以及方差分析等方法进行分析。【结果】4月最高温度、5月平均温度、5月最低温度、7月最高温度、7月日照时间对霞多丽葡萄糖度的积累有显著影响。5月活动积温、6月最高温度对霞多丽葡萄总酸含量有显著影响。5月活动积温、8月日照时间、8月最高温度、9月最高温度对霞多丽葡萄糖酸比值有显著影响。4月活动积温、7月日照时间对霞多丽葡萄的pH具有显著影响(在0.05水平上)。【结论】不同时段的温度和日照时间对怀来地区霞多丽葡萄的糖度、酸度、糖酸比、pH等成熟度指标产生不同程度的规律性影响。<BR></FONT></P>
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低温胁迫严重影响植物的生长发育及作物的产量。为了生存,植物形成了复杂而高效的调控网络以抵御和适应低温胁迫,其中转录调控起关键作用。转录因子通过结合启动子区域的顺式作用元件,调控一系列基因的表达,在植物非生物逆境应答网络中起着关键作用。文章全面综述了参与调控植物低温胁迫应答的转录因子,包括AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)、MYB(myeloblastosis)、bHLH(basic helix-loop-helix)、NAC(NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2)、ZFP(zinc finger protein)、WRKY、VOZ(vascular plant one zinc-finger protein)、CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)及EIN3(ethylene-insensitive 3)等,简要概述了各类转录因子的结构特征,重点介绍了其在植物抗寒中的功能及调控机制,并基于转录因子间的调控关系,绘制出植物低温应答的转录调控网络。在该调控网络中,CBF(C-repeat binding factor)转录因子起着关键分子开关的作用。CBFs特异地与启动子区域的DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat element,A/GCCGAC)顺式作用元件结合,从而激活<em>COR</em>(cold regulated)、<em>LTI</em>(low-temperature induced)、<em>DHN</em>(dehydrin)及<em>RD</em>(responsive to dehydration)等一系列低温应答基因的表达。<em>CBFs</em>的表达受ICE1/2(inducer of CBF expression 1/2)、CAA1(circadian clock-associated 1)、LHY(late elongated hypocotyl)、MYB56、ZFP1/182及CAMTA1/2/3等转录因子的正调控,而受MYB15、MYBS3、ZAT12、PIF4/7、WRKY34及EIN3等转录因子的负调控。ICE1蛋白的转录活性受翻译后修饰的严谨调控,包括SIZ1(SAP and Miz 1)介导的SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰和HOS1(high expression of osmotically responsive gene 1)介导的泛素化修饰。HOS1-SIZ1系统精细严谨地调控着ICE1-CBFs及其靶基因的表达,以适应外界温度的变化。同时,<em>ICE1</em>的表达还受JAZ1/4的负调控和ERF2的正调控。除CBF依赖的低温应答信号途径外,一些转录因子则通过不依赖于CBF的途径调控植物低温应答,如JERF3、MYB2/4/96/3R-2、WRKY19/21/76、NAC1/2及SAP1/8等。植物低温应答转录调控网络为通过转基因技术提高农作物抗寒性提供了理论基础。转基因结果表明,<em>AtCBF1</em>&ndash;<em>AtCBF3</em>、<em>AtICE1</em>、<em>AtCCA1&alpha;</em>、<em>TaCBF14</em>/<em>15</em>、<em>TaNAC2</em>、<em>TaWRKY19</em>、<em>VrCBF1</em>/<em>4</em>、<em>MdCIbHLH1</em>、<em>PtrbHLH</em>、<em>OsMYB2</em>、<em>GmNAC20</em>、<em>JERF3</em>及<em>ZFP182</em>等转录因子在植物抗寒遗传改良中具有潜在的应用价值。此外,文章还探讨了此领域研究中存在的主要问题及今后研究的重点,以期为进一步解析植物适应低温胁迫的分子机制提供参考。
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低温胁迫严重影响植物的生长发育及作物的产量。为了生存,植物形成了复杂而高效的调控网络以抵御和适应低温胁迫,其中转录调控起关键作用。转录因子通过结合启动子区域的顺式作用元件,调控一系列基因的表达,在植物非生物逆境应答网络中起着关键作用。文章全面综述了参与调控植物低温胁迫应答的转录因子,包括AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)、MYB(myeloblastosis)、bHLH(basic helix-loop-helix)、NAC(NAM、ATAF1、ATAF2和CUC2)、ZFP(zinc finger protein)、WRKY、VOZ(vascular plant one zinc-finger protein)、CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)及EIN3(ethylene-insensitive 3)等,简要概述了各类转录因子的结构特征,重点介绍了其在植物抗寒中的功能及调控机制,并基于转录因子间的调控关系,绘制出植物低温应答的转录调控网络。在该调控网络中,CBF(C-repeat binding factor)转录因子起着关键分子开关的作用。CBFs特异地与启动子区域的DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat element,A/GCCGAC)顺式作用元件结合,从而激活<em>COR</em>(cold regulated)、<em>LTI</em>(low-temperature induced)、<em>DHN</em>(dehydrin)及<em>RD</em>(responsive to dehydration)等一系列低温应答基因的表达。<em>CBFs</em>的表达受ICE1/2(inducer of CBF expression 1/2)、CAA1(circadian clock-associated 1)、LHY(late elongated hypocotyl)、MYB56、ZFP1/182及CAMTA1/2/3等转录因子的正调控,而受MYB15、MYBS3、ZAT12、PIF4/7、WRKY34及EIN3等转录因子的负调控。ICE1蛋白的转录活性受翻译后修饰的严谨调控,包括SIZ1(SAP and Miz 1)介导的SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰和HOS1(high expression of osmotically responsive gene 1)介导的泛素化修饰。HOS1-SIZ1系统精细严谨地调控着ICE1-CBFs及其靶基因的表达,以适应外界温度的变化。同时,<em>ICE1</em>的表达还受JAZ1/4的负调控和ERF2的正调控。除CBF依赖的低温应答信号途径外,一些转录因子则通过不依赖于CBF的途径调控植物低温应答,如JERF3、MYB2/4/96/3R-2、WRKY19/21/76、NAC1/2及SAP1/8等。植物低温应答转录调控网络为通过转基因技术提高农作物抗寒性提供了理论基础。转基因结果表明,<em>AtCBF1</em>&ndash;<em>AtCBF3</em>、<em>AtICE1</em>、<em>AtCCA1&alpha;</em>、<em>TaCBF14</em>/<em>15</em>、<em>TaNAC2</em>、<em>TaWRKY19</em>、<em>VrCBF1</em>/<em>4</em>、<em>MdCIbHLH1</em>、<em>PtrbHLH</em>、<em>OsMYB2</em>、<em>GmNAC20</em>、<em>JERF3</em>及<em>ZFP182</em>等转录因子在植物抗寒遗传改良中具有潜在的应用价值。此外,文章还探讨了此领域研究中存在的主要问题及今后研究的重点,以期为进一步解析植物适应低温胁迫的分子机制提供参考。

XU W R, JIAO Y T, LI R M, ZHANG N B, XIAO D M, DING X L, WANG Z P . Chinese wild-growing Vitis amurensis ICE1 and ICE2 encode MYC-type bHLH transcription activators that regulate cold tolerance in Arabidopsis.
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.20.013URLMagsci [本文引用: 1]
【目的】研究100 mmol&bull;L-1 NaCl胁迫下,葡萄酿酒品种&lsquo;赤霞珠&rsquo;、砧木&lsquo;5BB&rsquo; 和砧穗组合苗&lsquo;赤霞珠/5BB&rsquo;叶片细胞解剖结构和光合特性,为葡萄品种、砧木及砧穗组合苗耐盐性的筛选提供理论依据和技术方案。【方法】采用盆栽方法,当葡萄苗生长到高度约60 cm时,用100 mmol&bull;L-1 NaCl 处理30 d,随后测定叶片的叶绿素含量、光合作用参数及叶绿素荧光参数等指标,并用显微和透射电镜观察其细胞结构特征。【结果】100 mmol&bull;L-1NaCl胁迫下,葡萄叶片表皮细胞、栅栏组织和海绵组织厚度增加,栅栏组织/海绵组织比降低;叶绿体长宽分别扩大1.3&mdash;1.5倍和1.3&mdash;2.0倍,类囊体肿胀变大;叶绿素含量降低,特别是叶绿素b(Chl b)下降明显;叶片光系统Ⅱ(PSII)潜在活性(Fv/Fo)、原初光能转换效率(Fv/Fm)和叶片净光合速率(Pn)均显著降低。3种类型苗木对NaCl胁迫的反应不同,100 mmol&bull;L-1 NaCl对砧木&lsquo;5BB&rsquo;叶片细胞和叶绿体的结构、叶绿素含量和光合速率的影响程度最小,其次为砧穗组合苗&lsquo;赤霞珠/5BB&rsquo;,而对品种&lsquo;赤霞珠&rsquo;的影响最大。【结论】100 mmol&bull;L-1 NaCl胁迫下,葡萄叶片厚度增加,叶绿素含量降低,最终导致PSII潜在活性中心受损,光能转化效率和净光合速率明显降低。葡萄砧木&lsquo;5BB&rsquo;有较强的耐盐能力,可一定程度提高酿酒葡萄&lsquo;赤霞珠&rsquo;的耐盐能力。
QIN L, KANG W H, QI Y L, CAI A J . Effects of salt stress on mesophyll cell structures and photosynthetic characteristics in leaves of wine grape (Vitis spp.).
Scientia Agricultura Sinica, 2012,45(20):4233-4241. (in Chinese)

DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.20.013URLMagsci [本文引用: 1]
【目的】研究100 mmol&bull;L-1 NaCl胁迫下,葡萄酿酒品种&lsquo;赤霞珠&rsquo;、砧木&lsquo;5BB&rsquo; 和砧穗组合苗&lsquo;赤霞珠/5BB&rsquo;叶片细胞解剖结构和光合特性,为葡萄品种、砧木及砧穗组合苗耐盐性的筛选提供理论依据和技术方案。【方法】采用盆栽方法,当葡萄苗生长到高度约60 cm时,用100 mmol&bull;L-1 NaCl 处理30 d,随后测定叶片的叶绿素含量、光合作用参数及叶绿素荧光参数等指标,并用显微和透射电镜观察其细胞结构特征。【结果】100 mmol&bull;L-1NaCl胁迫下,葡萄叶片表皮细胞、栅栏组织和海绵组织厚度增加,栅栏组织/海绵组织比降低;叶绿体长宽分别扩大1.3&mdash;1.5倍和1.3&mdash;2.0倍,类囊体肿胀变大;叶绿素含量降低,特别是叶绿素b(Chl b)下降明显;叶片光系统Ⅱ(PSII)潜在活性(Fv/Fo)、原初光能转换效率(Fv/Fm)和叶片净光合速率(Pn)均显著降低。3种类型苗木对NaCl胁迫的反应不同,100 mmol&bull;L-1 NaCl对砧木&lsquo;5BB&rsquo;叶片细胞和叶绿体的结构、叶绿素含量和光合速率的影响程度最小,其次为砧穗组合苗&lsquo;赤霞珠/5BB&rsquo;,而对品种&lsquo;赤霞珠&rsquo;的影响最大。【结论】100 mmol&bull;L-1 NaCl胁迫下,葡萄叶片厚度增加,叶绿素含量降低,最终导致PSII潜在活性中心受损,光能转化效率和净光合速率明显降低。葡萄砧木&lsquo;5BB&rsquo;有较强的耐盐能力,可一定程度提高酿酒葡萄&lsquo;赤霞珠&rsquo;的耐盐能力。

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