杜青¹, 唐照磊¹, 李石初¹, 上官玲玲², 李华娇², 段灿星^,31 广西壮族自治区农业科学院玉米研究所,南宁 530007
2 广西农业职业技术学院,南宁 530007
3 中国农业科学院作物科学研究所/ 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程,北京100081

Composition of Fusarium Species Causing Maize Ear Rot and Analysis of Toxigenic Chemotype in Guangxi

DU Qing¹, TANG ZhaoLei¹, LI ShiChu¹, SHANGGUAN LingLing², LI HuaJiao², DUAN CanXing^,31 Institute of Maize Research, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007
2 Guangxi Agricultural Vocational and Technical College, Nanning 530007
3 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081

通讯作者: 段灿星，E-mail：duancanxing@caas.cn

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-02-19接受日期:2019-03-21网络出版日期:2019-06-01

基金资助:

国家重点研发计划.2018YFD0200705 农作物种质资源保护与利用专项.2018NWB036-12 广西科技重大专项桂科.AA17204050-2 广西农业科学院玉米研究所科技发展基金桂玉科.2017003

Received:2019-02-19Accepted:2019-03-21Online:2019-06-01
作者简介 About authors
杜青,E-mail：duq82@163.com。








摘要
目的 明确广西玉米穗腐病致病镰孢的种群构成及毒素化学型,为玉米穗腐病的综合防治、品种的合理布局和抗病育种提供重要指导和理论依据。方法 从广西玉米主产区采集玉米穗腐病样本,经组织分离和单孢纯化共获得138个镰孢菌分离物,分别来自21个县（区）。利用形态学和分子生物学相结合的方法进行镰孢菌种的鉴定,构建TEF-1α系统发育树,利用产毒基因特异性引物进行毒素化学型检测。结果 在138个镰孢菌分离物中,鉴定出10种镰孢菌,包括拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）、层出镰孢（F. proliferatum）、九州镰孢（F. kyushuense）、南方镰孢（F. meridionale）、甘蔗镰孢（F. sacchari）、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、亚洲镰孢（F. asiaticum）、轮纹镰孢（F. concentricum）、变红镰孢（F. incarnatum）和禾谷镰孢（F. graminearum）,分离频率依次为50.72%、12.32%、10.87%、8.70%、6.52%、3.62%、3.62%、1.45%、1.45%和0.72%。禾谷镰孢复合种（F. graminearum species complex,FGSC）由南方镰孢、亚洲镰孢和禾谷镰孢3个独立种组成。拟轮枝镰孢为优势致病菌,禾谷镰孢复合种、层出镰孢和九州镰孢为次优势致病菌,而甘蔗镰孢和轮纹镰孢则是国内首次报道为玉米穗腐病致病菌。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢和藤仓镰孢检测到伏马毒素关键合成基因FUM1的菌株数分别为67、13、5、3,具有潜在的产伏马毒素能力,轮纹镰孢则未检测到FUM1。供试禾谷镰孢复合种、九州镰孢和变红镰孢菌株的毒素化学型有4种：NIV、15-ADON、NIV+15-ADON和DON+15-ADON。8个九州镰孢菌株、2个亚洲镰孢菌株、2个南方镰孢菌株和1个变红镰孢菌株携带NIV毒素化学型;2个南方镰孢菌株携带15-ADON毒素化学型;8个南方镰孢菌株、2个九州镰孢菌株、1个亚洲镰孢菌株和1个变红镰孢菌株携带NIV+15-ADON毒素化学型;只有1个禾谷镰孢菌株携带DON+15-ADON毒素化学型。未检测到3-ADON毒素化学型菌株。结论 拟轮枝镰孢为广西玉米穗腐病优势致病菌,禾谷镰孢复合种、层出镰孢和九州镰孢为次优势致病菌。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢、藤仓镰孢均检测到FUM1,广西禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为NIV和15-ADON,变红镰孢和部分九州镰孢的主要毒素化学型为NIV。广西玉米穗腐病镰孢菌种群构成与我国温带玉米相关研究结果存在差异,原因可能为镰孢菌种群适应广西热带和亚热带高温、高湿的玉米生长环境并因此导致毒素化学型的不同。
关键词： 玉米;穗腐病;镰孢菌;分离频率;毒素化学型

Abstract
【Objective】 The objective of this study is to clarify the composition and toxigenic chemotype of Fusarium species causing maize ear rot in Guangxi, and to provide important guidance and theoretical basis for comprehensive control of maize ear rot and reasonable distribution of varieties and resistance breeding.【Method】 The diseased ear samples were collected from main maize producing areas in Guangxi between 2016 and 2018, a total of 138 isolates from 21 counties (districts) were obtained by tissue separation and single-spore purification. Fusarium species were identified and determined according to morphological characteristics and molecular methods. The phylogenetic tree was constructed based on TEF-1α gene sequences, and specific primers were used to detect toxigenic chemotype.【Result】 A total of 10 Fusarium species were identified and confirmed among 138 isolates, including F. verticillioides, F. proliferatum, F. kyushuense, F. meridionale, F. sacchari, F. fujikuroi, F. asiaticum, F. concentricum, F. incarnatum and F. graminearum, with the isolation frequencies of 50.72%, 12.32%, 10.87%, 8.70%, 6.52%, 3.62%, 3.62%, 1.45%, 1.45% and 0.72%, respectively. F. graminearum species complex (FGSC) contained three independent species, i.e. F. meridionale, F. asiaticum and F. graminearum. F. verticillioides was the predominant pathogen, FGSC, F. proliferatum and F. kyushuense were the secondary predominant pathogens. F. sacchari and F. concentricum were the first reported to be the pathogen of maize ear rot in China. The key gene FUM1 responsible for the biosynthesis of fumonisins was detected among 67 F. verticillioides, 13 F. proliferatum, 5 F. sacchari and 3 F. fujikuroi strains, respectively, which indicated the potential ability of producing fumonisins. FUM1 was not detected in the F. concentricum strains. Four toxigenic chemotypes including NIV, 15-ADON, NIV+15-ADON and DON+15-ADON were detected among FGSC, F. kyushuense and F. incarnatum strains. Strains containing NIV chemotype included 8 F. kyushuense, 2 F. asiaticum, 2 F. meridionale, and 1 F. incarnatum. Strains containing 15-ADON chemotype included 2 F. meridionale. The NIV+15-ADON chemotype was detected among 8 F. meridionale, 2 F. kyushuense, 1 F. asiaticum and 1 F. incarnatum strains. Only 1 F. graminearum strain carried DON+15-ADON chemotype. The 3-ADON chemotype was not detected among these strains.【Conclusion】F. verticillioides is the predominant pathogen of maize ear rot in Guangxi. FGSC, F. proliferatum and F. kyushuense are the secondary predominant species. FUM1 was detected among F. verticillioides, F. proliferatum, F. sacchari and F. fujikuroi. The main toxigenic chemtype of FGSC in Guangxi is NIV+15-ADON, while NIV is the main toxigenic chemotype of F. incarnatum and some F. kyushuense. The population composition of Fusarium species causing maize ear rot in Guangxi is different from equivalent study of temperate zone in China, which may be due to the fact that Fusarium species adapt to the high temperature and humidity growth environment in tropical and subtropical Guangxi and thus leads to the differences of toxigenic chemotypes.
Keywords：maize;ear rot;Fusarium spp.;isolation frequency;toxigenic chemotype


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本文引用格式
杜青, 唐照磊, 李石初, 上官玲玲, 李华娇, 段灿星. 广西玉米穗腐病致病镰孢种群构成与毒素化学型分析[J]. 中国农业科学, 2019, 52(11): 1895-1907 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.005
DU Qing, TANG ZhaoLei, LI ShiChu, SHANGGUAN LingLing, LI HuaJiao, DUAN CanXing. Composition of Fusarium Species Causing Maize Ear Rot and Analysis of Toxigenic Chemotype in Guangxi[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(11): 1895-1907 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.005

0 引言

【研究意义】玉米穗腐病（maize ear rot）是玉米生产中的重要病害之一,在世界范围发生十分普遍,也是广西最常见的玉米真菌病害之一。镰孢菌（Fusarium spp.）是玉米最普遍的致病真菌之一,引起的病害包括玉米苗枯病、茎腐病和穗腐病。玉米果穗感染镰孢菌后通常会导致产量损失和品质下降,更重要的是收获感染了镰孢菌的果穗,可能会导致真菌毒素的污染,危害人畜健康^[1,2,3,4,5]。明确广西玉米穗腐病致病镰孢的种群构成及毒素化学型,可为玉米穗腐病的病害流行、综合防治、抗病育种等相关研究提供理论依据。【前人研究进展】国内外多数研究认为拟轮枝镰孢（F. verticillioides）和禾谷镰孢（F. graminearum）是玉米穗腐病的优势种,但各地的镰孢菌种群组成和结构存在较大差异。我国春玉米区,禾谷镰孢复合种（F. graminearum species complex,FGSC）总分离频率最高,其次为拟轮枝镰孢、亚粘团镰孢（F. subglutinans）等^[2],而黄淮海夏玉米区以拟轮枝镰孢最高,其次为禾谷镰孢^[3]。周丹妮等^[4]对重庆及周边地区的玉米穗腐病镰孢菌进行了序列分析鉴定,发现该地区禾谷镰孢复合种由南方镰孢（F. meridionale）和亚洲镰孢（F. asiaticum）组成;DUAN等^[5]对我国约20个省份的玉米穗腐病镰孢菌进行了鉴定,拟轮枝镰孢和禾谷镰孢复合种为优势种,禾谷镰孢复合种中鉴定出3个独立种,分别为禾谷镰孢、南方镰孢和布氏镰孢（F. boothii）。镰孢菌种群的致病性比较复杂,特别是禾谷镰孢复合种和藤仓镰孢复合种（F. fujikuroi species complex,FFSC）,常规形态学结合分子生物学技术有利于镰孢菌种群的鉴定,在镰孢菌种级水平上的系统发育学分析发现,TEF-1α基因序列可以较好地表现镰孢菌种之间的关系,并已成为镰孢种鉴定的重要工具^{[2,3,4,5,6,7]}。已鉴定出40多种病原菌单独或复合侵染均可引发玉米穗腐病,其中,在大多数国家和地区,镰孢菌是玉米穗腐病的主要病原菌^[8]。镰孢菌可引起两种类型的玉米穗腐病,分别为赤霉穗腐病（Gibberella ear rot）和镰孢穗腐病（Fusarium ear rot）^[1],镰孢穗腐病由拟轮枝镰孢、层出镰孢（F. proliferatum）、亚粘团镰孢等引起,会导致伏马毒素（fumonisins）积累;赤霉穗腐病则主要由禾谷镰孢、黄色镰孢（F. culmorum）、燕麦镰孢（F. avenaceum）等引起,会导致脱氧雪腐镰刀烯醇（deoxynivalenoe,DON）、雪腐镰刀烯醇（nivalenol,NIV）和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）等真菌毒素污染^[1,9]。伏马毒素是世界范围内最常见的玉米及玉米加工品的污染物,玉米相比其他作物更容易受到伏马毒素污染,在热带和亚热带环境下,拟轮枝镰孢被认为是镰孢穗腐病和伏马毒素污染的主要因素^[1,9]。欧盟、美国和中国等地区和国家已制定了伏马毒素、单端孢霉烯族毒素等镰孢菌毒素在玉米等粮食作物及加工品中的限量标准^[10]。2011和2012年甘肃省5个地区的225份玉米样品中,伏马毒素的污染率分别为30.5%和50.9%^[11]。2012—2014年间,77%的埃塞俄比亚玉米籽粒样品中检测到伏马毒素,伏马毒素平均浓度为348 μg?kg^-1,部分样品超过欧盟限量标准^[9]。【本研究切入点】玉米是广西最主要的粮食作物之一。广西热带、亚热带的高温、高湿气候特点导致玉米穗腐病发生非常普遍,然而该病害镰孢菌致病种群构成及毒素污染情况仍不明确。【拟解决的关键问题】于2016—2018年采集广西玉米穗腐病病样,利用形态学和分子生物学相结合的方法进行镰孢种鉴定,利用毒素合成基因特异性引物进行毒素化学型检测,为玉米穗腐病的综合防治、品种的合理布局和抗病育种提供重要指导和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病样：2016—2018年从广西玉米主产区的24个区（县）采集疑似感染镰孢菌的玉米病穗167份,将采集样品装在牛皮纸袋中带回实验室尽快进行籽粒带菌检测。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）培养基：马铃薯200 g,琼脂粉和葡萄糖各20 g,蒸馏水1 L;马铃薯葡萄糖（potato dextrose,PD）液体培养基：马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1 L;合成低营养琼脂（spezieller nahrstoffarmer agar,SNA）培养基：KH₂PO₄ 1.0 g,KNO₃ 1.0 g,MgSO₄?7H₂O 0.5 g,KCl 0.5 g,蔗糖0.2 g,葡萄糖0.5 g,琼脂20.0 g,蒸馏水1 L;康乃馨叶片（carnation leaf-piece agar,CLA）培养基：琼脂粉20 g,蒸馏水1 L,每个培养皿中灭菌康乃馨叶片4—5片。

常用仪器：BioRad S 1000 PCR扩增仪;Eppendorf 5424 R高速冷冻离心机;北京市六一仪器厂DYY-6C型电泳仪;BioRad GelDoc XR凝胶成像系统;Nikon E-CLIPSE CI-E生物显微镜。常用试剂：4S green plus无毒核酸染料,真菌基因组DNA快速抽提试剂盒,Taq PCR Master Mix（2×,blue dye）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与鉴定 挑选果穗病健交界处的籽粒,在3%的次氯酸钠溶液中表面消毒1 min,无菌水冲洗两次,然后在PDA平板上培养5—6 d。菌落转移至PDA平板中进行纯化培养及单孢分离^[12]。根据镰孢菌在PDA、SNA和CLA培养基上的形态特征和培养性状,参考《The Fusarium Laboratory Manual》^[13]和《常见镰刀菌鉴定指南》^[14]关于镰孢菌分类依据的描述进行形态学鉴定。

1.2.2 病原菌的分子生物学鉴定 将镰孢菌菌株接种到PD液体培养基中,4—7 d后,利用真菌DNA快速提取试剂盒从纱布过滤后的冻干菌丝中提取DNA,将DNA溶解于100 μL TE buffer。种级特异性引物（表1）用于镰孢菌种群的初步鉴定,PCR反应体系及PCR反应程序参照周丹妮等^[4]。

Table 1
表1
表1镰孢菌种特异性鉴定引物
Table 1Specific primers for Fusarium spp. identification

检测真菌 Detected fungus	引物 Primer	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	扩增片段 Target fragment (bp)	退火温度 Tm (℃)
镰孢菌	ItsF	AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA	431	58
Fusarium spp.	ItsR	TTTAACGGCGTGGCCGC
禾谷镰孢复合种	Fg16NF	ACAGATGACAAGATTCAGGCACA	280	57
F. graminearum	Fg16NR	TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA
species complex
拟轮枝镰孢	VER1	CTTCCTGCGATGTTTCTCC	578	56
F. verticillioides	VER2	AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA
层出镰孢	PRO1	CTTTCCGCCAAGTTTCTTC	585	56
F. proliferatum	PRO2	TGTCAGTAACTCGACGTTGTTG

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所有镰孢菌菌株采用TEF-1α基因序列比对方法进行鉴定^{[2,3,4,5,6,7]}。EF1（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAG AC-3′）和EF2（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT -3′）引物对用来扩增TEF-1α基因部分序列,30 μL PCR反应体系：2×Taq Mix 15 μL,基因组DNA模板2 μL,10 μmol?L^-1上下游引物均为1 μL,ddH₂O 11 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min,94℃变性1 min,53℃退火50 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存扩增产物。PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序,Chromas软件查看测序ab1文件序列峰图,DNAman软件正反向序列比对拼接,结合峰图,获得可靠DNA序列,登录GenBank数据库进行BLAST序列比对,利用MEGA 7.0软件ClustalW比对后采用neighbor-joining（NJ）统计方法1 000次自检构建系统发育树。1.2.3 致病性鉴定 拟轮枝镰孢、层出镰孢、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、甘蔗镰孢（F. sacchari）和轮纹镰孢（F. concentricum）采用PD液体培养基培养孢子,制成浓度为2×10⁶个孢子/mL的悬浮液,禾谷镰孢复合种、九州镰孢（F. kyushuense）和变红镰孢（F. incarnatum）采用SNA培养孢子,刮取孢子,制成浓度为1×10⁵个孢子/mL的悬浮液。以清水作对照,分别于吐丝后10 d针刺果穗注射法^[8]穿透苞叶接种2 mL孢子悬浮液至玉米果穗,乳熟后期剥开苞叶调查病害发生情况,取病健交界处的籽粒,于培养基上分离和纯化,观察再分离菌株与接种菌株的形态特征是否一致。1.2.4 毒素合成基因的分子检测 利用Fum5F（5′- GTCGAGTTGTTGACCACTGCG-3′）和Fum5R（5′-CG TATCGTCAGCATGATGTAGC-3′）引物对检测拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢、藤仓镰孢和轮纹镰孢的伏马毒素关键合成基因FUM1,PCR反应体系和扩增程序参照DUAN等^[5]的方法进行。对于禾谷镰孢、亚洲镰孢、南方镰孢、变红镰孢和九州镰孢,采用表2引物检测其毒素化学型。PCR反应体系、PCR程序参照马红霞等^[15]的方法,并略有改动。

Table 2
表2
表2毒素化学型检测所用引物
Table 2Primers used for identification of toxigenic chemotype

引物 Primer	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	毒素化学型 Toxigenic chemotype	扩增片段 Product size (bp)	退火温度 Tm (℃)
Tri13F	TACGTGAAACATTGTTGGC	DON, NIV	234, 415	57
Tri13R	GGTGTCCCAGGATCTGCG
Tri303F	GATGGCCGCAAGTGGA	3-DON	586	56
Tri303R	GCCGGACTGCCCTATTG
Tri315F	CTCGCTGAAGTTGGACGTAA	15-ADON	864	58
Tri315R	GTCTATGCTCTCAACGGACAAC

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2 结果

2.1 玉米穗腐病样中镰孢菌的鉴定及分离频率

从广西24个县（区）采集的167份疑似镰孢菌引起的玉米穗腐病病样中,分离并鉴定出镰孢菌、青霉（Penicillium）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、木霉（Trichoderma）、丝核菌（Rhzochtonia）等,本研究重点对镰孢菌进行种级鉴定,结果见表3。

Table 3
表3
表3广西21个县（区）镰孢菌的分离情况
Table 3Occurrence of Fusarium spp. in 21 counties (districts) in Guangxi

镰孢菌 Fusarium spp.	拟轮枝镰孢 F. v	层出镰孢 F. p	甘蔗镰孢 F. s	藤仓镰孢 F. f	轮纹镰孢 F. c	亚洲镰孢 F. a	禾谷镰孢 F. g	南方镰孢 F. m	九州镰孢 F. k	变红镰孢 F. i	总计 Total
巴马 Bama	2	4	-	-	-	1	-	-	3	-	10
大化 Dahua	2	-	1	1	-	-	-	-	-	-	4
东兰 Donglan	9	-	-	-	-	-	-	-	-	-	9
都安 Duan	4	-	1	-	-	1	-	2	3	-	11
凤山Fengshan	5	-	-	-	-	-	-	3	-	-	8
金城江Jinchengjiang	-	-	2	-	-	-	-	-	-	-	2
乐业 Leye	3	-	-	-	-	2	-	-	-	-	5
凌云 Lingyun	9	-	-	2	-	-	-	-	-	-	11
平果 Pingguo	1	1	-	-	-	-	1	1	3	1	8
靖西 Jingxi	-	6	-	-	2	-	-	-	-	-	8
田东Tiandong	6	-	-	-	-	-	-	1	-	-	7
田林 Tianlin	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	2
田阳 Tianyang	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	2
德保 Debao	1	2	-	1	-	-	-	2	2	-	8
西林 Xilin	-	1	-	-	-	-	-	-	-	-	1
隆安 Longan	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1	1
江南 Jiangnan	7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	7
马山 Mashan	7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	7
武宣 Wuxuan	-	2	2	1	-	-	-	-	2	-	7
大新 Daxin	3	-	1	-	-	1	-	-	1	-	6
天等 Tiandeng	7	1	2	-	-	-	-	3	1	-	14
总计 Total	70	17	9	5	2	5	1	12	15	2	138

F. v=F. verticillioides; F. p=F. proliliferatum; F. s=F. sacchari; F. f=F. fujikuroi; F. c=F. concentricum; F. a=F. asiaticum; F. g=F. graminearum; F. m=F. meridionale; F. k=F. kyushuense; F. i=F. incarnatum

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经过单孢分离纯化共获得138个镰孢单孢分离物,分别来自广西21个主要玉米种植县（区）,形态学结合分子生物学鉴定,共鉴定出10种致病镰孢。共分离到103个藤仓镰孢复合种分离物,包括拟轮枝镰孢（70个）、层出镰孢（17个）、甘蔗镰孢（9个）、藤仓镰孢（5个）和轮纹镰孢（2个）,分离频率依次为50.72%、12.32%、6.52%、3.62%和1.45%。18个禾谷镰孢复合种分离物包括南方镰孢（12个）、亚洲镰孢（5个）和禾谷镰孢（1个）,分离频率依次为8.70%、3.62%和0.72%。此外,还分离到九州镰孢（15个）和变红镰孢（2个）,分离频率分别为10.87%和1.45%。不难发现,拟轮枝镰孢为广西玉米穗腐病优势致病镰孢,其次是层出镰孢和九州镰孢。禾谷镰孢复合种以南方镰孢分离频率最高,亦具有较强的致病力。拟轮枝镰孢、层出镰孢、九州镰孢和南方镰孢分离频率较高,在百色、河池和崇左市均有不同程度的分布。在南宁市的3个县（区）共获得到15个单孢分离物,14个为拟轮枝镰孢,只有来宾市武宣县等少数县（区）未分离到拟轮枝镰孢。

分别接种甘蔗镰孢和轮纹镰孢孢子悬浮液至玉米果穗,结果证明甘蔗镰孢和轮纹镰孢均能侵染玉米果穗（图1-e、1-E）,发病症状与拟轮枝镰孢、层出镰孢和藤仓镰孢引起的穗腐病症状相似,通常造成果穗局部受害,极少数整穗腐烂,与禾谷镰孢复合种引起的紫红色病穗区别较大。取病健交界处的籽粒分离培养,小型分生孢子、大型分生孢子、小型分生孢子链产孢和复瓶梗假头状产孢（图1-a—d、A—D）等形态学特征与拟轮枝镰孢（孢子链更长,单瓶梗产孢为主）差异较大。甘蔗镰孢与层出镰孢、藤仓镰孢间差异相对较小。

图1

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图1甘蔗镰孢和轮纹镰孢形态学特征及接种玉米后症状

a、A：小孢子Microconidia;b、B：大孢子Macroconidia;c、C：孢子链Microconidia chain;d、D：产孢细胞Conidiogenus cell;e、E：接种后病害症状Symptom after inoculation。a—e：甘蔗镰孢F. sacchari;A—E：轮纹镰孢 F. concentricum。a-b, A: Scale bar=10 μm; c-d, B-D: Scale bar=25 μm
Fig. 1Morphological characteristic and maize symptom after inoculation of F. sacchari and F. concentricum

2.2 TEF-1α系统发育树

形态学和特异性引物扩增初步鉴定后,所有菌株均采用引物延伸因子TEF-1α基因序列构建系统发育树,菌株编号采用“采集县份+序号”表示。将138个镰孢菌菌株进行BLAST序列比对,并下载参考菌株基因序列,138个菌株与参考菌株基因序列构建系统发育树,所有菌株均可划分到彼此独立的10个对应参考菌株的群组中。

采用部分镰孢菌与10个参考菌株的基因序列构建系统发育树（图2）,禾谷镰孢群组自展值为90,亚洲镰孢群组自展值为83,其余8个群组的自展值均为98—99,高度相似,因此鉴定为与参考菌株相同的镰孢种。镰孢菌亦可分为两个大的进化群组,即藤仓镰孢复合种进化群组和禾谷镰孢复合种、九州镰孢与变红镰孢进化群组。藤仓镰孢复合种分为拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢、藤仓镰孢和轮纹镰孢5个群组,拟轮枝镰孢与其他4个复合种可以划分为2个亚群,藤仓镰孢和层出镰孢亲缘关系更近且位于彼此独立的群组。禾谷镰孢复合种分为禾谷镰孢、亚洲镰孢和南方镰孢3个群组。

图2

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图2基于TEF-1α基因序列构建部分镰孢菌菌株的系统发育树

Fig. 2Construction of phylogenetic tree of some Fusarium spp. strains based on TEF-1α gene sequence

2.3 毒素化学型检测

对拟轮枝镰孢、藤仓镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢和轮纹镰孢所携带产伏马毒素合成关键基因FUM1进行PCR检测（图3-a）,88个菌株能扩增出目标条带,占比85.43%,表明这88个菌株携带伏马毒素关键合成基因,具有潜在的产伏马毒素能力。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢和藤仓镰孢检测到FUM1的菌株数分别为67、13、5和3。轮纹镰孢只有2个菌株,均来自百色市靖西市,未检测到该基因。

图3

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图3产毒基因和化学型的PCR检测

M：DNA Marker。a：F. verticillioides的FUM1检测FUM1 detection of F. verticillioides。b：FGSC的DON和NIV检测DON and NIV detection of FGSC;1：F. graminearum;2、3：F. asiaticum;4—12：F. meridionale。C：FGSC的15-ADON检测 15-ADON detection of FGSC;1：F. graminearum;2、3：F. asiaticum;4—12：F. meridionale
Fig. 3PCR amplification of toxigenic gene and chemotypes



对南方镰孢、亚洲镰孢、亚洲镰孢、变红镰孢和九州镰孢进行毒素化学型检测,检测结果见表4。共检测出4种毒素化学型,即NIV、DON+15DON、15-ADON和NIV+15-ADON。利用引物对Tri13F/ Tri13R,可同时鉴定NIV（415 bp）和DON（234 bp）化学型（图3-b）,35个菌株中,有25个菌株具有产NIV毒素潜力,分别为亚洲镰孢3个,南方镰孢10个,九州镰孢10个,变红镰孢2个。只有禾谷镰孢菌株Pingguo4具有产DON毒素潜力。利用引物对Tri315F/Tri315R可鉴定15-ADON（864 bp）（图3-c）,35个菌株中,有15个菌株具有产15-ADON潜力,分别为禾谷镰孢1个,亚洲镰孢1个,南方镰孢10个,变红镰孢1个,九州镰孢2个。12个菌株同时具有产NIV和15-ADON潜力,其中亚洲镰孢1个,南方镰孢8个,九州镰孢2个,变红镰孢1个。

Table 4
表4
表4镰孢菌菌株的毒素化学型检测
Table 4Toxigenic chemotype detection of Fusarium spp. strains

菌株编号 Strain number	镰孢菌 Fusarium spp.	毒素化学型 Toxigenic chemotype
		NIV	DON	3-ADON	15-ADON
Bama7	F. asiaticum	-	-	-	-
Daxin1	F. asiaticum	+	-	-	-
Duan1	F. asiaticum	-	-	-	-
Leye2	F. asiaticum	+	-	-	-
Leye4	F. asiaticum	+	-	-	+
Pingguo4	F. graminearum	-	+	-	+
Longan1	F. incarnatum	+	-	-	-
Pingguo8	F. incarnatum	+	-	-	+
Bama2	F. kyushuense	+	-	-	+
Bama3	F. kyushuense	+	-	-	+
Bama9	F. kyushuense	-	-	-	-
Daxin5	F. kyushuense	-	-	-	-
Debao3	F. kyushuense	+	-	-	-
Debao5	F. kyushuense	-	-	-	-
Duan3	F. kyushuense	+	-	-	-
Duan4	F. kyushuense	+	-	-	-
Duan5	F. kyushuense	+	-	-	-
Pingguo3	F. kyushuense	+	-	-	-
Pingguo5	F. kyushuense	-	-	-	-
Pingguo6	F. kyushuense	+	-	-	-
Tiandeng12	F. kyushuense	+	-	-	-
Wuxuan6	F. kyushuense	+	-	-	-
Wuxuan7	F. kyushuense	-	-	-	-
Debao6	F. meridionale	+	-	-	+
Debao7	F. meridionale	+	-	-	-
Duan2	F. meridionale	-	-	-	+
Duan8	F. meridionale	+	-	-	+
FengShan2	F. meridionale	-	-	-	+
FengShan3	F. meridionale	+	-	-	+
FengShan7	F. meridionale	+	-	-	+
Pingguo2	F. meridionale	+	-	-	+
Tiandeng1	F. meridionale	+	-	-	+
Tiandeng2	F. meridionale	+	-	-	+
Tiandeng8	F. meridionale	+	-	-	+
Tiandong4	F. meridionale	+	-	-	-

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1个禾谷镰孢菌株具有产DON和15-ADON潜力;1个亚洲镰孢具有产NIV和15-ADON潜力,2个亚洲镰孢只具有产NIV潜力;8个南方镰孢具有产NIV和15-ADON潜力,2个只具有产NIV潜力,2个只具有产15-ADON潜力;2个九州镰孢具有产NIV和15-ADON潜力,8个九洲镰孢只具有产NIV潜力;1个变红镰孢具有产NIV和15-ADON潜力,1个只具有产NIV潜力。所有菌株均未检测到3-ADON。结果表明,NIV是禾谷镰孢复合种、九州镰孢和变红镰孢最主要的潜在毒素化学型,NIV和15-ADON是广西玉米穗腐病禾谷镰孢复合种最主要的潜在毒素化学型（表4）。

3 讨论

在世界范围内,由于栽培制度、气候特点的差异,各地区玉米穗腐病的优势病原菌并不完全一致,我国多以拟轮枝镰孢或禾谷镰孢复合种为优势致病菌^[16]。然而,广西地区由于其特殊的生态环境,该地区玉米穗腐病的致病镰孢种群构成具有一定独特性。本研究结果显示,除拟轮枝镰孢外,层出镰孢、九州镰孢和南方镰孢分离频率也较高,而禾谷镰孢分离频率较低,这与我国其他生态区优势镰孢菌构成存在较大的差异。本研究并未分离到亚粘团镰孢,亚粘团镰孢在冷凉地区更常见^[13],我国陕西、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北、甘肃等地区玉米染病籽粒上分离到该镰孢菌^[2,16],而分离到形态学上与亚粘团镰孢相似的甘蔗镰孢和轮纹镰孢^[12]。甘蔗镰孢和轮纹镰孢过去曾被记录为亚粘团镰孢,本研究还将所有菌株序列与亚粘团镰孢如AF160289.1（菌株NRRL22016）等构建系统发育树,结果表明甘蔗镰孢、轮纹镰孢与亚粘团镰孢三者位于独立的群组。HSUAN等^[17]从马来西亚玉米腐烂籽粒中分离到甘蔗镰孢。本研究经柯赫氏法则验证,接种甘蔗镰孢和轮纹镰孢均能导致玉米穗腐病的发生,再分离菌株与接种菌株的形态学特征一致,本研究为国内首次报道甘蔗镰孢和轮纹镰孢是玉米穗腐病的致病菌。甘蔗镰孢分布于印度、菲律宾等热带地区^[18],可以引起甘蔗鞘腐病、枯萎病^[12],甘蔗镰孢和轮纹镰孢可能与广东和广西香蕉冠腐病相关^[19]。

拟轮枝镰孢能在不同环境条件下引起玉米穗腐病的发生和伏马毒素积累^[9,11,20-23]。除了2个轮纹镰孢菌株,其余4个藤仓镰孢复合种均不同程度地检测到FUM1,共在88个菌株中检测到了该基因,其中以优势拟轮枝镰孢检出率最高,FUM1作为伏马毒素合成的关键基因,该基因的存在与否很大程度上决定着伏马毒素是否产生,COVARELLI等^[24]在分离的所有意大利拟轮枝镰孢中均能检测到FUM1,但部分菌株并未检测到伏马毒素;DUAN等^[5]研究结果显示,来自我国18个省（市）的82个拟轮枝镰孢菌株均能检测到FUM1,其中3个菌株未检测到伏马毒素;GLENN等^[25]研究表明,部分拟轮枝镰孢菌不产生伏马毒素是由于FUM1的变异或伏马毒素合成基因的缺失,例如菌株NRRL25059缺失FUM1、FUM2、FUM3和FUM19。本研究所获得的3个拟轮枝镰孢分离物没有检测到FUM1,因此,为了明确拟轮枝镰孢等藤仓镰孢复合种能否产生伏马毒素,还需要进行毒素定量检测。与其他4个藤仓镰孢复合种不同,2个轮纹镰孢菌株均未检测出FUM1,表明这2个菌株不具有产伏马毒素的能力,事实上,轮纹镰孢主要产生白僵菌毒素和恩镰孢菌素^[26]。

本研究中,禾谷镰孢复合种和九州镰孢为次优势镰孢菌,变红镰孢较少。广西禾谷镰孢复合种构成与我国东北地区和黄淮海地区差异较大,与我国西南地区的种群构成更为相近。秦子慧等^[16]研究表明,我国禾谷镰孢分布广泛,南方镰孢主要分布于云南、贵州及陕西商洛等南方生态区;周丹妮等^[4]研究表明,重庆及周边地区的禾谷镰孢复合种由南方镰孢和亚洲镰孢构成,其中南方镰孢为优势种。本研究中禾谷镰孢复合种由南方镰孢、亚洲镰孢和禾谷镰孢3个独立种构成。九州镰孢作为一个较新的种^[27],近年来已被报道是玉米穗腐病致病菌^[5],在本研究中分离频率较高,分布于广西不同区域的7个县。变红-木贼镰孢复合种（Fusarium incarnatum- equiseti species complex,FIESC）至少包括变红镰孢和木贼镰孢2个种,其中变红镰孢主要分布于热带及亚热带地区^[12],本研究共鉴定出2个变红镰孢菌株,分离自南宁市隆安县和百色市平果县的春季玉米病穗。

广西禾谷镰孢复合种毒素化学型研究结果与前人研究相吻合,不同之处可能是由于地理气候的不同导致适应该地区的禾谷镰孢复合种构成的差异,并因此导致产毒类型的不同。在YANG等^[28]研究中,侵染四川、重庆大麦的亚洲镰孢,NIV产生菌所占比例高于80%,而SUGA等^[29]研究发现,日本的246个亚洲镰孢菌株,70%产生NIV,说明亚洲镰孢以产NIV为主。马红霞等^[15]研究表明,我国北方春播区和黄淮海夏播区的禾谷镰孢复合种主要的毒素化学型为DON和15-ADON;DUAN等^[5]对我国东北、黄淮海和西南玉米生态区禾谷镰孢复合种的毒素化学型分析及毒素含量测定结果表明,禾谷镰孢的主要毒素化学型为15-ADON,南方镰孢是NIV型菌株,主要来源于西南玉米区,其中部分南方镰孢同时产生NIV和15-ADON;ZHOU等^[30]对重庆市及周边地区的研究结果类似。本研究中禾谷镰孢复合种产NIV和15-ADON菌株较多,是由于南方镰孢分离频率较高的缘故。SAMPIETRO等^[31]研究显示,在阿根廷温带和亚热带区检测到的单端孢霉烯族类毒素的化学型存在种的特异性,其中禾谷镰孢只产DON型（温带）,南方镰孢和布氏镰孢为产NIV型（亚热带）。AOKI等^[27]采用的九州镰孢菌株具有产NIV能力,THRANE等^[32]研究发现九州镰孢具有产NIV和恩链霉素的能力,本研究中10个九州镰孢菌株具有产NIV的潜力。变红镰孢具有产白僵菌素、单端孢霉烯族类毒素能力^[12],本研究中两个菌株均具有产NIV潜力,其中一个还具有产15-ADON潜力。

玉米穗腐病在广西各玉米主产市（县）均有不同程度的发生,高温、高湿、多雨的环境气候为病虫侵染玉米提供了良好的条件,穗腐病已成为玉米生产上的重要问题。笔者项目组近年来调查了广西玉米主产区穗腐病的自然发生情况并采集发病果穗,镰孢菌穗腐病在各玉米主产县份均有发生,以藤仓镰孢复合种引起的穗腐病数量更多,由禾谷镰孢复合种、九州镰孢引起的单端孢霉烯族毒素危害也不容忽视。穗腐病在偏冷凉山区危害重于平原地区。引起镰孢穗腐病的玉米穗部害虫在本地区主要有玉米螟、桃蛀螟和棉铃虫等,玉米螟和桃蛀螟发生率低于棉铃虫,但是引发可见穗腐病症状的概率却远高于棉铃虫,这是由于棉铃虫体型较大以危害花丝为主。在不同地点,害虫和镰孢菌种群对不同玉米品种果穗的影响并不一致,这是由于品种的抗性、栽培方式以及适宜镰孢菌生长的温度、湿度等多因素造成的。因此,在玉米品种选育过程中,需要选育兼抗玉米螟和不同镰孢菌的自交系和品种,以减少镰孢菌的感染,从而降低真菌毒素污染。

玉米穗腐病遗传抗性的利用将有利于减少玉米产量损失、农药施用量和真菌毒素污染,然而,广西本体玉米育种机构极为缺乏优异的抗穗腐病自交系,且不具有抗穗腐病接种鉴定技术。目前,我国在进行玉米品种和自交系的抗穗腐病鉴定过程中,普遍采用拟轮枝镰孢或禾谷镰孢进行接种鉴定,拟轮枝镰孢作为广西玉米穗腐病优势致病镰孢可以作为病原菌进行接种鉴定,但禾谷镰孢在广西分布极少,层出镰孢、九州镰孢和南方镰孢分布较多,致病性测定表明禾谷镰孢复合种中的南方镰孢对玉米果穗致病能力强,对人畜毒性更重,需要持续关注,因此,禾谷镰孢在广西地区不适宜作为抗穗腐病的接种体使用,应考虑采用致病能力强和产毒能力强的南方镰孢进行接种鉴定。除拟轮枝镰孢和南方镰孢外,抗源筛选还需兼顾层出镰孢和九州镰孢的抗性,以选择出更适应本区域的种质资源。

4 结论

广西21个县（区）的138个单孢分离物鉴定为10种镰孢菌,其中拟轮枝镰孢为优势致病菌,禾谷镰孢复合种、层出镰孢和九州镰孢为次优势致病菌,而甘蔗镰孢则是首次报道引起玉米穗腐病。拟轮枝镰孢、层出镰孢、甘蔗镰孢、藤仓镰孢均不同程度地检测到FUM1,广西禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为NIV和15-ADON,变红镰孢和部分九州镰孢的毒素化学型为NIV。广西地区玉米种质资源抗源筛选应主要考虑拟轮枝镰孢、层出镰孢、九州镰孢和南方镰孢的抗性,以选择出更适应本区域的种质资源。

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Fusarium species are important pathogens of banana, especially causing such serious diseases as Panama disease and crown rot disease. F. oxysporum f. sp. cubense race 1 (Foc1) and race 4 (Foc4) were reported as the pathogenic populations of Panama disease in China, but it has been confused with the Fusarium species of crown rot disease. In order to understand the Fusarium diversities associated with banana in both interspecific and intraspecific levels, 143 Fusarium isolates were cultured from 90 banana samples collected from fruit markets and banana orchards in South China in 2008 2011. Based on morphological observation and phylogenetic analyses with partial translation elongation factor-1 alpha (EF-1 ) gene, ten Fusarium species were recognized, including F. oxysporum, F. solani, F. camptoceras, F. pallidoroseum, F. stiloides, F. chlamydosporum, F. verticillioides, F. proliferatum, F. concentricum, F. sacchari, and three undescribed taxa in Gibberella fujikuroi species complex (GFC). F. concentricum is newly recorded in China. F. sacchari is firstly reported from banana. F. concentricum and F. sacchari were the most common GFC species in banana fruits. Phylogenic analyses were conducted for GFC and the F. oxysporum species complex (FOSC). 27 partial EF-1 sequences of GFC strains were employed and seven clades were recognized, including F. verticillioides, F. proliferatum, F. concentricum, F. sacchari and three undescribed lineages recorded as Fusarium sp. 1, Fusarium sp. 2 and Fusarium sp. 3. 50 partial EF-1 sequences of FOSC were employed and their phylogenetic analysis generated two major clades and 12 monophyletic lineages, 21 South China isolates in seven lineages, and 13 pathogenic strains distributing in three of them. The phylogenetic studies showed that the pathogens of Panama disease in China Mainland were closely related to those from Southeast Asia and Taiwan, China and wider genetic differentiation were found among the race 1 strains than the race 4 strains. Race 1 was genetically closer to the isolates obtained from fruits as compared with race 4. It is concluded that more Fusarium species and genetic groups are associated with banana and show plentiful intraspecific diversity.

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AbstractFusarium and fusaproliferin were produced by a few isolates. Enniatin A and fumonisins were not detected in any of the isolates. Although F. oxysporum and F. solani are well-known bulb pathogens, many isolates of F. oxysporum and F. solani, and all of the F. concentricum and F. proliferatum were isolated from asymptomatic bulbs, suggesting their endophytic association with lilies.

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