刘树森, 马红霞, 郭宁, 石洁^,, 张海剑, 孙华, 金戈河北省农林科学院植物保护研究所/农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心, 河北保定071000

Analysis of Main Pathogens and Dominant Species of Maize Stalk Rot in the Main Summer Maize Producing reas of Huang-Huai-Hai

LIU ShuSen, MA HongXia, GUO Ning, SHI Jie^,, ZHANG HaiJian, SUN Hua, JIN GePlant Protection Institute, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture/IPM Centre of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei

通讯作者: 石洁,E-mail： shij99@163.com

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2018-09-4接受日期:2018-11-23网络出版日期:2019-01-16

基金资助:

国家现代农业产业技术体系.CARS-02

Received:2018-09-4Accepted:2018-11-23Online:2019-01-16
作者简介 About authors
刘树森,E-mail：shusenliu@163.com。









摘要
【目的】 明确黄淮海夏玉米主产区玉米茎腐病的主要病原菌组成及优势种,为病原菌致病机制、抗性育种及茎腐病防治提供依据。【方法】 于2014—2017年采集黄淮海夏玉米主产区3个省（河北、河南、山东）的玉米茎腐病样本850份。通过形态学、通用引物和特异引物对病组织分离物进行鉴定,并采用上述引物直接检测病组织。整合分析分离物鉴定法和组织分子检测法的结果以确定玉米茎腐病的主要病原菌及优势种;分析主要病原菌在各省间以及同一省份不同年度的检出率,揭示主要病原菌的种群动态变化;分析单个样本中病原菌的检出率,探讨多种病原菌的共存模式。【结果】 有667份样本检测出真菌或卵菌,占总样本的78.47%;年度间样本检出率存在差异,2014年的检出率不足50%,而2015—2017年的检出率相近,均高于90%。在所有样本中共检出20属46种真菌或卵菌,其中镰孢菌（Fusarium spp.）的检出率最高,为89.96%,包括禾谷镰孢复合种（F. graminearum species complex）、层出镰孢（F. proliferatum）、拟轮枝镰孢（F. verticillioides）、厚垣镰孢（F. chlamydosporum）、亚粘团镰孢（F. subglutinans）、尖镰孢（F. oxysporum）、黄色镰孢（F. culmorum）、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、变红镰孢（F. incarnatum）、木贼镰孢（F. equiseti）和茄镰孢（F. solani）11个种;腐霉菌（Pythium spp.）的检出率为34.18%,包括芒孢腐霉（P. aristosporum）、禾生腐霉（P. graminicola）、棘腐霉（P. acanthicum）、孤雌腐霉（P. amasculinum）和寡雄腐霉（P. oligandrum）5个种。拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢为4种主要病原菌,检出率依次为62.07%、46.93%、29.09%和28.04%,其中拟轮枝镰孢为优势种。各省之间,上述4种主要病原菌的检出率存在一定差异。拟轮枝镰孢在河北省的检出率为73.98%,明显高于该菌在河南省和山东省的检出率;禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率分别为35.78%和34.31%,均高于在其他两省的检出率。同一省份不同年度上述4种主要病原菌的检出率呈动态变化,其中任何一种病原菌均有可能上升为优势种。进一步分析表明,单个样本中可以检测出一种或多种病原菌,检测出1种菌的样本占38.38%,检出2种和3种病原菌的样本分别占29.24%和19.04%;2种及以上病原菌共存以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌模式为主。【结论】 黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢,其中拟轮枝镰孢为优势种;拟轮枝镰孢在河北省的检出率最高,层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率最高,禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;单个样本中存在多种病原菌共存的模式。
关键词： 玉米茎腐病;黄淮海地区;病原菌检测;优势种;镰孢菌;腐霉菌

Abstract
【Objective】 The objective of this study is to determine the main pathogens and dominant species of maize stalk rot in the main summer maize producing areas of Huang-Huai-Hai, and to provide a basis for understanding the pathogenic mechanism, resistant breeding, and ultimately maize stalk rot management.【Method】 In 2014-2017, 850 samples of maize stalk rot were collected from three provinces (Hebei, Henan and Shandong) in the main summer maize producing areas of Huang-Huai-Hai. The isolated fungi or oomycetes were morphologically characterized and confirmed by using universal and specific primers, those primers were also used for detecting pathogens in diseased tissues. The combined results of isolate identification and tissue molecular detection were analyzed to determine the main pathogens and the dominant species. The detection rates of main pathogens in different provinces and different years of the same province were analyzed to reveal the population dynamics. The detection rates of pathogens in individual samples were also analyzed to determine the coexistence patterns of multiple pathogens.【Result】 Fungi or oomycetes were detected in 667 samples, accounting for 78.47% of all samples. The detection rates were different among years, less than 50% in 2014 and more than 90% in 2015-2017. Detected fungi or oomycetes were classified to 46 species of 20 genera. Fusarium spp. had the highest detection rate of 89.96%, including F. graminearum species complex, F. proliferatum, F. verticillioides, F. chlamydosporum, F. subglutinans, F. oxysporum, F. culmorum, F. fujikuroi, F. incarnatum, F. equiseti and F. solani. In addition, Pythium spp. had the second highest detection rate of 34.18%, including P. aristosporum, P. graminicola, P. acanthicum, P. amasculinum and P. oligandrum. The detection rates of four main pathogens, F. verticillioides, F. graminearum species complex, P. aristosporum and F. proliferatum, were 62.07%, 46.93%, 29.09% and 28.04%, respectively. It indicated that the dominant species was F. verticillioides. There were some differences in the detection rates of the four main pathogens among provinces. The detection rate of F. verticillioides in Hebei Province was 73.98%, which was significantly higher than that in Henan and Shandong Provinces, and the detection rates of F. graminearum species complex in the three provinces were similar. The detection rates of F. proliferatum and P. aristosporum in Shandong Province were 35.78% and 34.31%, respectively, which were higher than those in other two provinces. The detection rates of the four main pathogens from the same province were dynamic in different years, and any one of them can be the dominant species. Furthermore, several pathogens could be detected in a single sample. While 38.38% samples were colonized by only one pathogen, 29.24% and 19.04% samples were colonized by two and three pathogens. The patterns of two or multiple pathogens in single samples were mainly coexistence of Fusarium spp. and Pythium spp., or coexistence of Fusarium spp. and Fusarium spp..【Conclusion】 The main pathogens of maize stalk rot in the main summer maize producing areas of Huang-Huai-Hai are F. verticillioides, F. graminearum species complex, P. aristosporum and F. proliferatum, and the dominant species is F. verticillioides. The detection rate of F. verticillioides in Hebei Province and that of F. proliferatum and P. aristosporum in Shandong Province are the highest, and the detection rate of F. graminearum species complex in the three provinces is similar. There is a coexistence pattern of two or multiple pathogens in a single sample.
Keywords：maize stalk rot;Huang-Huai-Hai region;pathogen detection;dominant species;Fusarium spp.;Pythium spp.


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本文引用格式
刘树森, 马红霞, 郭宁, 石洁, 张海剑, 孙华, 金戈. 黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌及优势种分析[J]. 中国农业科学, 2019, 52(2): 262-272 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.006
LIU ShuSen, MA HongXia, GUO Ning, SHI Jie, ZHANG HaiJian, SUN Hua, JIN Ge. Analysis of Main Pathogens and Dominant Species of Maize Stalk Rot in the Main Summer Maize Producing reas of Huang-Huai-Hai[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(2): 262-272 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.006

0 引言

【研究意义】黄淮海夏玉米区是指收获小麦后播种玉米的区域,包括河南省和山东省的全部、河北省中南部、安徽省和江苏省北部、山西省南部和陕西省东南部地区,种植面积在1 000万公顷左右^[1],主产区为河南省、山东省和河北省。玉米茎腐病是该区域的重要病害,自2013年起连续多年发生,发病重的年份部分品种亩产仅有250 kg,损失高达60%以上,严重影响玉米生产。茎腐病的防治以种植抗性品种和种子包衣为主,两种防治技术的研究和推广均建立在病原菌的研究基础上。因此,明确黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌的种类及其组成,对病害的防控具有重要意义。【前人研究进展】已报道玉米茎腐病的病原菌有20余种^[2],这些病原菌单独或复合侵染导致玉米茎腐病的发生,优势病原菌则因年份、地理环境和气候的差异而有所不同。国内在20世纪80年代末至2000年初是茎腐病病原菌研究的高峰期,随后日趋减少。我国茎腐病主要病原菌为镰孢菌（Fusarium spp.）和腐霉菌（Pythium spp.）^[3]。已明确为病原菌的镰孢菌有禾谷镰孢（F. graminearum）、拟轮枝镰孢（F. verticillioides）、层出镰孢（F. proliferatum）^[4]、腐皮镰孢（F. solani）、木贼镰孢（F. equiesti）、镰状镰孢（F. fusarioidis）^[5]、串珠镰孢中间变种（F. moniliforme var. intarmadium）、半裸镰孢（F. semitectum）^[6]、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、厚垣镰孢（F. chlamydosporum）、尖镰孢（F. oxysporum）^[7]、黄色镰孢（F. culmorum）^[8]、变红镰孢（F. incarnatum）^[9]、亚粘团镰孢（F. subglutinans）^[10]、同色镰孢（F. concolor）^[11]等;腐霉菌为肿囊腐霉（P. inflatum）、禾生腐霉（P. graminicola）、瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、强雄腐霉（P. arrhenomanes）、寡雄腐霉（P. oligandrum）和棘腐霉（P. acanthicum）等^[12]。在黄淮海夏玉米主产区,罗畔池等认为20世纪90年代引起河北省玉米茎腐病的主要病原菌为串珠镰孢、禾谷镰孢和腐霉菌^[13,14],而石洁^[15]认为禾谷镰孢和串珠镰孢是主要病原菌。徐作珽等^[16]认为20世纪80年代山东省茎腐病病原菌以瓜果腐霉为主,其与禾谷镰孢形成复合侵染;张艺铭^[17]于2014年分离鉴定了山东省84份典型茎腐病株的病原菌,认为主要为瓜果腐霉和禾谷镰孢。袁虹霞等研究表明,河南省2009—2012年度茎腐病的优势病原菌为禾谷镰孢^{[18,19,20,21]}。何婧^[22]于2008—2009年共分离鉴定了河北、山东和河南34点次的病样,其中16点次分离到了腐霉菌,32点次分离到了镰孢菌,镰孢菌以禾谷镰孢和拟轮枝镰孢为主。上述研究结果基于对病组织分离物进行形态学和分子生物学鉴定,但样本采集时期以及分离过程中诸多因素常常影响分离结果^[22],进而影响鉴定结果。马红霞等^[23]采用病原菌的通用引物和特异性引物,以病组织基因组DNA为模板,直接检测病组织中的病原菌,同时对分离物进行鉴定,整合分析两种方法的检测结果,在一定程度上提高了检测的灵敏度和结果的准确性。【本研究切入点】黄淮海区域内有关玉米茎腐病病原菌的研究较少,且大部分年代久远,结论分歧也较大^[16,24-25]。已有研究仅为部分省内病原菌的检测结果,而以整个黄淮海夏玉米主产区茎腐病病原菌为对象的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用分离物鉴定和组织分子检测相结合的方法,对2014—2017年黄淮海夏玉米主产区的玉米茎腐病样本进行病原菌检测,以期明确该区域的主要病原菌,为玉米茎腐病抗病育种和病害综合治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 茎腐病样本采集与处理

2014—2017年,共采集茎腐病样本850份。采集地点涉及黄淮海夏玉米主产区3个省的154个县,具体为河北省（26县141份）、河南省（62县419份）、山东省（66县290份）。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g,蒸馏水定容至1 L,高温高压灭菌20 min,备用。玉米粉琼脂培养基（CMA）：玉米粉30 g、琼脂粉17 g,蒸馏水定容至1 L,高温高压灭菌20 min,备用。

参考马红霞等^[23]的方法进行样本处理：采集玉米茎腐病发病初期植株,在田间采用70%的酒精棉擦拭茎基部,并将其在酒精灯火焰上掠过进行表面灭菌。用无菌手术刀纵剖茎秆为两半,通过观察排除细菌性茎腐病后,首先切取一侧髓部病健交界处组织放到1.5 mL离心管中,液氮保存;然后切取另一侧髓部相同部位的组织分别放置在准备好的PDA和CMA平板培养基上,每皿4块,常温培养,待采样结束返回实验室后及时将分离物纯化,并于4℃保存待用。

1.2 病原菌鉴定

分离物鉴定法：参照《真菌鉴定手册》^[26]和《中国真菌志-青霉属及其相关有性型属》^[27],依据菌落形态和分生孢子的大小及形态特征等对纯化的分离物进行形态学鉴定;并以真菌基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取的分离物DNA作为模板,采用真菌、镰孢菌和卵菌的通用引物以及镰孢菌的种特异性引物进行PCR扩增,对分离物进行分子生物学鉴定。组织分子检测法^[23]：使用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取玉米髓部组织的基因组DNA,并使用上述引物进行PCR扩增。所用引物如表1所示,由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。PCR扩增体系及反应程序参考孙华等^[28]的方法。25 μL PCR反应体系：DNA 2.0 μL,10 μmol·L^-1上游引物和下游引物各0.5 μL,2×Es Taq MasterMix 12.5 μL,补ddH₂O至25 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min;95℃变性1 min,退火30 s（各引物退火温度如表1所示）,72℃延伸45 s,进行35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存PCR产物。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,阳性产物由北京诺赛基因组研究中心进行测序,测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对。

Table 1
表1
表1本研究使用的引物
Table 1Primer pairs used in this study

引物Primer	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	靶标菌 Target	产物大小 Product size (bp)	退火温度 Annealing temperature (℃)	参考文献 Reference
Fg16NF	ACAGATGACAAGATTCAGGCACA	禾谷镰孢复合种 F. graminearum species complex	280	57	[29]
Fg16NR	TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA
PRO1	CTTTCCGCCAAGTTTCTTC	层出镰孢 F. proliferatum	588	56	[30]
PRO2	TGTCAGTAACTCGACGTTGTTG
VER1	CTTCCTGCGATGTTTCTCC	拟轮枝镰孢 F. verticillioides	578	57	[30]
VER2	AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA
Fc01F	ATGGTGAACTCGTCGTGGC	黄色镰孢 F. culmorum	570	59	[29]
Fc01R	CCCTTCTTACGCCAATCTCG
SUB1	CTGTCGCTAACCTCTTTATCCA	亚粘团镰孢 F. subglutinans	631	56	[31]
SUB2	CAGTATGGACGTTGGTATTATATCTAA
FOF1	ACATACCACTTGTTGCCTCG	尖镰孢 F. oxysporum	340	58	[32]
FOR1	CGCCAATCAATTTGAGGAACG
FEF1	CATACCTATACGTTGCCTCG	木贼镰孢 F. equiseti	389	58	[32]
FER1	TTACCAGTAACGAGGTGTATG
DC6	GAGGGACTTTTGGGTAATCA	卵菌 Oomycota	1100	58	[33]
ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC
EF-1	ATGGGTAAGGARGACAAGAC	镰孢菌 Fusarium	700	54	[34]
EF-2	GGARGTACCAGTSATCATGTT
ITS1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG	真菌通用引物 Universal primer for fungus	550	57	[35]
ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC
EF-1F	CATCGAGAAGTTCGAGAAGG	真菌通用引物 Universal primer for fungus	300	58	[36]
EF-1R	TACTTGAAGGAACCCTTACC

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1.3 检测结果分析

将分离物鉴定法和组织分子检测法检测的结果相结合,任何一种方法从样本中检出某种真菌或卵菌即判定该样本携带该菌。检出率（%）=（某一真菌或卵菌检出样本数量/检出真菌和卵菌的样本总量）×100。

2 结果

2.1 真菌或卵菌的检出情况及主要病原菌

采用分离物鉴定和组织分子检测两种方法,在2014—2017年采集的850份茎腐病样本中,共有667份检测出真菌或卵菌,检出率为78.47%;年度间的检出率差异较大,2014年度的检出率不足50%,而2015—2017年的检出率相近,均高于90%。检出的真菌或卵菌涉及20属46种。其中,镰孢菌普遍存在于各地区样本中,检出率为89.96%,在检出的11个种中拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种和层出镰孢的检出率依次为62.07%、46.93%和28.04%;腐霉菌的检出率为34.18%,芒孢腐霉（P. aristosporum）的检出率最高,为29.09%;其余各属检出率在0.15%—5.70%。所有11种镰孢菌和除孤雌腐霉以外的4种腐霉菌均为明确的茎腐病病原菌。其中,拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、层出镰孢和芒孢腐霉（另文发表）是本区域4种主要的病原菌;其他几种病原菌的检出率较低,说明在田间只有少量或极少量玉米植株被这些病原菌侵染,为不常见病原菌。此外,两种检测方法的效果存在差异,分离物鉴定法能检测出20属44种菌,而组织分子检测法仅能检测出9属22种菌,但组织分子检测法对上述4种主要病原菌的检出率明显高于分离物鉴定法（表2）。

Table 2
表2
表2样本中真菌或卵菌的检出率
Table 2Detection rate of fungi or oomycetes in samples

属 Genus	种 Species	组织分子检测 Tissue molecular detection		分离物鉴定法 Isolate identification		种检出率 Detection rate of species (%)	属检出率 Detection rate of genus (%)
		检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率 Detection rate (%)	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率Detection rate (%)
镰孢属 Fusarium	禾谷镰孢复合种 F. graminearum species complex	264	39.58	141	21.08	46.93	89.96
	层出镰孢 F. proliferatum	155	23.24	64	9.53	28.04
	拟轮枝镰孢 F. verticillioides	380	56.97	152	22.81	62.07
	厚垣镰孢 F. chlamydosporum	1	0.15	22	3.30	3.45
	亚粘团镰孢 F. subglutinans	7	1.05	0	0	1.05
	尖镰孢 F. oxysporum	32	4.80	1	0.15	4.95
	黄色镰孢 F. culmorum	26	3.90	0	0	3.90
	藤仓镰孢 F. fujikuroi	3	0.45	3	0.45	0.90
	变红镰孢 F. incamatum	0	0	12	1.80	1.80
	木贼镰孢 F. equiseti	6	0.90	5	0.76	1.50
	茄镰孢 F. solani	0	0	1	0.15	0.15
腐霉属 Pythium	芒孢腐霉 P. aristosporum	169	25.34	23	3.40	29.09	34.18
	禾生腐霉 P. graminicola	9	1.35	3	0.45	1.20
	棘腐霉 P. acanthicum	1	0.15	0	0	0.15
	孤雌腐霉P. amasculinum	4	0.60	0	0	0.60
	寡雄腐霉 P. oligandrum	4	0.60	0	0	0.60
链格孢属 Alternaria	互隔交链格孢 A. alternate	9	1.35	12	1.80	1.80	2.10
	细极链格孢 A. tenuissima	1	0.15	2	0.30	0.30
曲霉属 Aspergillus	黄曲霉 A. flavus	5	0.75	7	1.05	1.05	1.20
	米曲霉 A. oryzae	0	0	1	0.15	0.15
枝顶孢霉属 Acremonium	A. zeae	0	0	1	0.15	0.15	0.15
平脐蠕孢属Bipolaris	玉蜀黍离蠕孢B. maydis	0	0	1	0.15	0.15	0.30
	麦根腐平脐蠕孢B. sorokiniana	1	0.15	1	0.15	0.15
旋孢腔菌属Cochliobolus	异旋孢腔菌C. heterostrophus	1	0.15	1	0.15	0.15	0.15
枝孢霉属Cladosporium	芽枝状枝孢C. cladosporioides	1	0.15	15	2.25	2.25	2.25
突脐蠕孢属Exserohilum	喙突脐蠕孢E. rostratum	0	0	35	5.25	5.25	5.25
附球孢属Epicoccum	黑附球菌E. nigrum	0	0	1	0.15	0.15	0.15
地霉属Geotrichum	白地霉G. candidum	0	0	2	0.30	0.30	0.30
粘帚霉属Gliocladium	粉红粘帚霉G. roseum	0	0	2	0.30	0.30	0.30
属 Genus	种 Species	组织分子检测 Tissue molecular detection		分离物鉴定法 Isolate identification		种检出率 Detection rate of species (%)	属检出率 Detection rate of genus (%)
		检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率 Detection rate (%)	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率Detection rate (%)
漆斑菌属Myrothecium	包围漆斑菌M. cinctum	0	0	2	0.30	0.30	0.30
壳球孢属Macrophomina	菜豆壳球孢M. phaseolina	0	0	1	0.15	0.15	0.15
黑孢霉属 Nigrospora	N. osmanthi	0	0	1	0.15	0.15	4.20
	穗黑孢霉N. oryzae	0	0	25	3.75	3.75
	球黑孢霉N. sphaerica	0	0	2	0.30	0.30
青霉属 Penicillium	草酸青霉P. oxalicum	3	0.45	15	2.25	2.25	3.60
	微紫青霉P. janthinellum	0	0	1	0.15	0.15
	产紫青霉P. purpureogenum	0	0	4	0.60	0.60
	绳状青霉P. funiculosum	0	0	4	0.60	0.60
丝核菌属 Rhizoctonia.	立枯丝核菌R. solani	0	0	3	0.45	0.45	0.45
木霉属 Trichoderma	棘孢木霉T. asperellum	0	0	3	0.45	0.45	5.70
	非洲哈茨木霉T. afroharzianum	0	0	7	1.05	1.05
	哈茨木霉T. harzianum	1	0.15	26	3.90	3.90
	钩状木霉T. hamatum	0	0	1	0.15	0.15
	盖姆斯木霉T. gamsii	0	0	1	0.15	0.15
毛霉属Mucor	未知种Unknown species	0	0	4	0.60	0.60	0.60
盾壳霉属Coniothyrium	未知种Unknown species	0	0	1	0.15	0.15	0.15

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2.2 主要病原菌在省份和年度间的差异

在各省之间,拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、层出镰孢和芒孢腐霉4种主要病原菌的检出率均存在一定差异（表3）。拟轮枝镰孢在河北省的检出率为73.98%,明显高于在河南省和山东省的检出率;禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;层出镰孢在山东省的检出率为35.78%,高于在其他两省的检出率;芒孢腐霉在山东省和河南省的检出率相近,分别为34.31%和30.00%,明显高于该菌在河北省的检出率。拟轮枝镰孢在各省内均处于优势地位,其次为禾谷镰孢复合种;层出镰孢在河北省的检出率略高于芒孢腐霉,河南省与之相反,山东省两种菌的检出率相近。

Table 3
表3
表3不同省份主要病原菌的检出率
Table 3Detection rate of main pathogens in different provinces

省份 Province	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率Detection rate (%)
		拟轮枝镰孢 F. verticillioides	禾谷镰孢复合种 F. graminearum species complex	层出镰孢 F. proliferatum	芒孢腐霉 P. aristosporum
河北Hebei	123	73.98	45.53	21.95	17.89
河南Henan	340	60.59	48.24	25.59	30.00
山东Shandong	204	57.35	45.59	35.78	34.31

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同一省份不同年度上述4种主要病原菌的检出率存在较大差异（表4）,其中任何一种均有可能上升为该省的优势种。河北省2014—2017年的优势病原菌均为拟轮枝镰孢,且检出率逐年上升,最高达到94.55%;2014年芒孢腐霉的检出率仅为4.17%,但2015年该菌的检出率大幅上升至44.44%,成为仅次于拟轮枝镰孢的病原菌。河南省2014年以芒孢腐霉为优势种,禾谷镰孢复合种次之,拟轮枝镰孢检出率较低,未检出层出镰孢;2015年禾谷镰孢复合种和拟轮枝镰孢检出率大幅上升,前者成为优势种,而芒孢腐霉的检出率则大幅下降;2016年和2017年拟轮枝镰孢的检出率高达73.08%和82.61%,成为该省的优势种,同时层出镰孢的检出率也大幅上升。山东省2014年芒孢腐霉为优势种,其次为拟轮枝镰孢,层出镰孢和禾谷镰孢复合种的检出率较低;2015年拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种和层出镰孢的检出率均大幅升高,芒孢腐霉检出率则下降,禾谷镰孢复合种成为优势种;2016—2017年拟轮枝镰孢则上升为优势种。

Table 4
表4
表4不同年度主要病原菌的检出率
Table 4Detection rate of main pathogens in different years

省份 Province	年份 Year	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	检出率Detection rate (%)
			拟轮枝镰孢 F. verticillioides	禾谷镰孢复合种 F. graminearum species complex	层出镰孢 F. proliferatum	芒孢腐霉 P. aristosporum
河北 Hebei	2014	24	41.67	29.17	0	4.17
	2015	9	55.56	44.44	11.11	44.44
	2016	35	68.57	48.57	34.29	22.86
	2017	55	94.55	50.91	25.45	16.36
河南 Henan	2014	52	13.46	40.38	0	59.62
	2015	92	51.09	58.70	3.26	25.00
	2016	104	73.08	54.81	48.08	16.35
	2017	92	82.61	34.78	36.96	33.70
山东 Shandong	2014	52	30.77	9.62	11.54	40.38
	2015	52	44.23	55.77	46.15	28.85
	2016	35	68.57	45.71	45.71	25.71
	2017	65	83.08	66.15	41.54	38.46

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2.3 单样本中多种菌共存模式

单样本中可以检测出一种至几种菌,最多的一个样本可检出7种菌（表5）。所有能检出菌的样本中,仅有38.38%的样本检出1种菌,检出2种和3种菌的样本分别占29.24%和19.04%,检出4种以上菌的样本比例均在10%以下。检出比例在年度间存在较大差异,2014年检出1种菌的样本占77.34%,其他年度比例明显降低（23.11%—36.21%）;2015—2017年检出2种和3种菌的样本比例较2014年大幅上升,与检出1种菌的样本比例相当。

Table 5
表5
表5检出不同种数真菌或卵菌的样本比例
Table 5Percentage of samples infected with multiple fungi or oomycetes species

年份 Year	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	真菌或卵菌种数及样本比例 Number of species of fungi or oomycetes and percentage of sample (%)
		1	2	3	4	≥5
2014	128	77.34	18.75	3.13	0.78	0
2015	153	29.41	39.87	20.26	7.84	2.61
2016	174	36.21	25.86	24.14	12.07	1.72
2017	212	23.11	30.66	23.58	11.79	10.85
总计Total	667	38.38	29.24	19.04	8.85	4.50

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进一步分析发现,仅检出一种镰孢菌的样本占26.99%,仅检出一种腐霉菌的样本占6%,其余样本均检出2种（含）以上真菌和（或）卵菌。多菌共存模式以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌共存为主,样本比例分别为24.29%和23.39%;镰孢菌和其他菌、腐霉菌和其他菌共存的比例较低,未见2种以上腐霉菌共存的情况（表6）。表明在黄淮海夏玉米主产区茎腐病病株中2种以上病原菌共存的情况非常普遍,甚至在多数年份为主要模式。

Table 6
表6
表6单样本中镰孢菌和腐霉菌的共存模式
Table 6Coexistence pattern of Fusarium spp. and Pythium spp. in a single sample

年份 Year	检出真菌或卵菌的样本数 Number of samples infected with fungi or oomycetes	镰孢菌和腐霉菌共存模式及样本比例 Coexistence pattern of F. spp. and P. spp. and percentage of samples (%)
		F. spp.	P. spp.	Other	F. spp.+ F. spp	P. spp.+ P. spp.	F. spp.+ P. spp.	F. spp.+ Other	P. spp.+ Other	Other + Other
2014	128	40.63	24.22	12.50	2.34	0	15.63	0.78	3.13	0.78
2015	153	21.57	3.27	4.58	22.22	0	24.84	20.92	1.96	0.65
2016	174	30.46	1.15	4.60	31.61	0	23.56	8.62	0	0
2017	212	19.81	0.94	2.36	30.19	0	29.72	15.57	1.42	0
总计Total	667	26.99	6.00	5.40	23.39	0	24.29	12.14	1.50	0.30

F. spp.: Fusarium spp.; P. spp.: Pythium spp.; Other: Fungi except Fusarium spp. and Pythium spp.

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3 讨论

玉米茎腐病作为一种以症状命名的病害,除由生物因素引起外,其他非生物因素如干旱、涝渍、早衰等也可以引起相同的症状。在本研究中,每年都有表现典型茎腐病症状的植株检测不出任何病原菌（包括细菌）。这些植株地上部呈灰绿色失水干枯状,根系可见水浸状坏死,刚枯死植株茎基部剖开未见明显坏死区域,这种现象在2014年尤为明显。有研究表明,连续的降雨会导致土壤缺氧,造成根系活力降低,甚至窒息死亡^[37],而随后的暴晴会造成叶片快速失水,植株枯死,症状和病原菌引起的茎腐病基本相同。据资料记载,2014年黄淮海夏播玉米区大部分地区从9月7日至20日连续阴雨,局部暴雨,低温寡照,从9月18日开始陆续暴晴,随后出现大范围的植株枯死^[38]。因此,笔者认为本研究中未检测到病原菌的、具有典型症状的植株是长时间涝渍形成的生理性病害。

本研究表明,在黄淮海夏播区近90%的病株中检测到镰孢菌,该菌是此区域的优势病原菌种群;在镰孢菌中,拟轮枝镰孢占据优势地位,其次为禾谷镰孢复合种和层出镰孢。大多数研究认为在我国茎腐病病原菌中,禾谷镰孢复合种比其他镰孢菌的致病力强^[7,18,39-40],因此多年来针对禾谷镰孢复合种开展了侵染机制、发生规律、抗性基因挖掘、防治药剂的筛选、品种的抗性鉴定等大量研究工作,对拟轮枝镰孢和层出镰孢引起的茎腐病研究较少。拟轮枝镰孢和层出镰孢都属于藤仓赤霉复合种（Gibberella fujikuroi species complex）,种内成员形态特征相似,2004年前均认定为串珠镰孢（该种名已废弃）^[19,41]。这两种病原菌也是玉米根腐病、穗腐病和鞘腐病的主要病原菌^[33,34],目前这几种病害在黄淮海区域均有加重趋势。与禾谷镰孢复合种主要通过根部侵入途径引起茎腐病不同,拟轮枝镰孢和层出镰孢还可经种子带菌途径进入玉米植株,也可以通过叶鞘和茎节连接处侵入引起茎腐病^[42],加大了侵染的机会,使茎腐病的防治更加困难。因此,应加强拟轮枝镰孢和层出镰孢茎腐病的致病机理、发生规律和防治技术等研究。本研究中,腐霉菌的检出率为34.18%,是仅次于镰孢菌的病原菌,在多雨潮湿的2014年甚至成为河南省和山东省的优势种。据报道,腐霉菌是北京、浙江^[25]、江苏^[43]、山西^[44]、河北、山东、辽宁^[45]、新疆^[46]、四川^[47]等地茎腐病的主要病原菌。但在腐霉菌的分离过程中样本采集时期、培养基类型、培养条件等多种因素常常影响最终的检测结果,本研究结合分离物鉴定法和组织分子检测法,在一定程度上提高了腐霉菌检测结果的可靠性。

进一步分析发现,有60%以上的病株可以检测出2种（含）以上的病原菌,表明单株中多种病原菌共存是茎腐病病原菌研究中不可回避的事实。孙秀华等研究表明,无论在培养基上还是植株体内,镰孢菌均对腐霉菌有较强的抑制作用^[48,49]。本研究中,同时检出腐霉菌和镰孢菌的样本占24.29%,有必要对这种共存模式形成的机制及其在侵染致病中的作用做进一步研究。病原菌可以通过种子携带、根系侵染、茎秆侵染、伤口侵入、自然孔口（气孔、水孔等）等不同方式进入植株,在不同环境条件影响下,可能会通过竞争资源、代谢产物或诱导植物免疫反应产生相互作用来影响彼此生长,进而导致不同类型的茎腐病。因此,控制一种或一类病原菌,有可能导致植株体内的次要病原菌上升为主要病菌。

4 结论

黄淮海夏玉米主产区茎腐病的主要病原菌种群为镰孢菌和腐霉菌,优势种为拟轮枝镰孢,其次为禾谷镰孢复合种、层出镰孢和芒孢腐霉;各省主要病原菌在年度间的检出率呈现动态变化,任何一种病原菌均有可能上升为当地的优势种;单样本中可以同时检测出多种病原菌,以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌的共存模式为主。镰孢菌和腐霉菌应作为防治茎腐病的主要靶标,在抗性育种中也要兼顾品种对拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、层出镰孢和腐霉菌的抗性,才有可能达到较好的防治效果。

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[29] NICHOLSON P, SIMPSON D R, WESTON G, REZANOOR H N, LEES A K, PARRY D W, JOYCE D . Detection and quantification o f Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays
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[30] MULè G, SUSCA A, STEA G, MORETTI A . A species-specific PCR assay based on the calmodulin partial gene for identification of Fusarium verticillioides, F
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[31] RAHJOO V, ZAD J, JAVAN-NIKKHAH M, GOHARI A M, OKHOVVAT S M, BIHAMTA M R, RAZZAGHIAN J, KLEMSDAL S S . Morphological and molecular identification of Fusarium isolated from maize ears in Iran
.Journal of Plant Pathology, 2008,90(3):463-468.


[32] MISHRA P K, FOX R T, CULHAM A . Development of a PCR-based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria
FEMS Microbiology Letters, 2003,218(2):329-332.
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[33] BONANTS P, WEERDT M H, VAN GENT-PELZER M, LACOURT I, COOKE D, DUNCAN J . Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman by the polymerase chain reaction
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[34] O’DONNELL K, KISTLER H C, CIGELNIK E, PLOETZ R C . Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies
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Mycologia, 1999,91(3):553-556.
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[37] 邱法展 . 玉米单倍体育种及苗期耐渍性研究
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QIU F Z . Study on waterlogging tolerance during seedling stage and haploid breeding in maize
[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2007. ( in Chinese)
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[38] 全国农业技术推广服务中心. 中国玉米新品种动态2014年国家级玉米品种区试报告. 北京:中国农业科学技术出版社, 2015: 106.
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The National Agro-tech Extension and Service Center. China’s Corn Varieties Dynamic-2014 National Corn Variety Regional Test Report. Beijing:China Agricultural Science and Technology Press, 2015: 106. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[39] 张瑞英, 张坪 . 黑龙江省玉米茎基腐病病原菌研究初报
植物保护学报, 1993,20(3):287-288.
Magsci [本文引用: 1]
玉米茎基腐病乃世界性玉米病害,自70年代以来我国春、夏玉米产区均有不同程度发生为害。据各地调查,一般年份发病率10%―20%,严重地块可达50%以上。该病主要在玉米灌浆―成熟期发病,从而引起玉米植株的根部及茎基部腐烂、变软,叶片青枯,果穗下垂,导致植株早死,籽粒松瘪,产量严重下降,是我国目前玉米生产上急待研究解决的主要病害之一。作者自1988―1991年从全省各玉米主产区,采集了大量的病
ZHANG R Y, ZHANG P . The preliminary study on corn stalk base rot in Heilongjiang Province
Acta Phytophylacica Sinica, 1993,20(3):287-288. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
玉米茎基腐病乃世界性玉米病害,自70年代以来我国春、夏玉米产区均有不同程度发生为害。据各地调查,一般年份发病率10%―20%,严重地块可达50%以上。该病主要在玉米灌浆―成熟期发病,从而引起玉米植株的根部及茎基部腐烂、变软,叶片青枯,果穗下垂,导致植株早死,籽粒松瘪,产量严重下降,是我国目前玉米生产上急待研究解决的主要病害之一。作者自1988―1991年从全省各玉米主产区,采集了大量的病

[40] 许明学, 冯芬芬, 柳迎春 . 玉米抗茎腐病育种的研究
玉米科学, 1993,1(3):67-70.
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XU M X, FENG F F, LIU Y C . Research progress on maize breeding for resistance to stalk rot
Maize Science, 1993,1(3):67-70. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[41] 吕国忠, 赵志慧, 孙晓东, 姜子德, 杨红 . 串珠镰孢菌种名的废弃及其与腾仓赤霉复合种的关系
菌物学报, 2010,29(1):143-151.
Magsci [本文引用: 1]
采用双向发酵的原理，运用“发酵过程动态比较法”研究了灵芝接种于雷公藤药性基质上发酵不同时间所得菌质的化学成分、急性毒性和免疫功能的变化，以其确定雷公藤解毒持效双向发酵的最佳发酵终点。研究结果表明：发酵第30天所得的菌质（G30）总二萜的含量最低，为0.57%；与雷公藤生药比较，G30的LD50最高，且发酵第30天所得菌质的体液免疫和细胞免疫抑制作用最强。综合对成分含量、毒性及药效的动态数据联系比较、分析，确定了雷公藤解毒持效双向发酵的发酵终点与适宜的发酵周期是菌丝长满瓶后的第30天。
Lü G Z, ZHAO Z H, SUN X D, JIANG Z D, YANG H . The abandonment of the name Fusarium moniliforme and the concept of Gibberella fujikuroi species complex
. Mycosystema, 2010,29(1):143-151. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
采用双向发酵的原理，运用“发酵过程动态比较法”研究了灵芝接种于雷公藤药性基质上发酵不同时间所得菌质的化学成分、急性毒性和免疫功能的变化，以其确定雷公藤解毒持效双向发酵的最佳发酵终点。研究结果表明：发酵第30天所得的菌质（G30）总二萜的含量最低，为0.57%；与雷公藤生药比较，G30的LD50最高，且发酵第30天所得菌质的体液免疫和细胞免疫抑制作用最强。综合对成分含量、毒性及药效的动态数据联系比较、分析，确定了雷公藤解毒持效双向发酵的发酵终点与适宜的发酵周期是菌丝长满瓶后的第30天。

[42] 任旭, 朱振东, 李洪杰, 段灿星, 王晓鸣 . 轮枝镰孢SSR标记开发及在玉米分离群体遗传多样性分析中的应用
中国农业科学, 2012,45(1):52-66.
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.01.007Magsci [本文引用: 1]
【目的】开发轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的SSR标记，为轮枝镰孢遗传多样性研究提供技术支持。【方法】利用Fastpcr在轮枝镰孢基因组中查找符合条件的SSR位点，采用Primer5.0软件设计引物，利用NTSYS及Popgene分析来自玉米的轮枝镰孢单孢分离物群体的PCR扩增结果。【结果】共设计有效扩增SSR引物158对，经筛选，109对（69.0%）可扩增出2条及以上的条带，其中55对引物（34.8%）多态性较好，可扩增出3条及以上的条带。从11条已组装的轮枝镰孢染色体上各选出2对多态性引物，计22对引物，对66株轮枝镰孢玉米分离物进行扩增，共获得125个等位变异，变异范围为2&mdash;11个，平均为5.68个。轮枝镰孢玉米分离物之间Nei&rsquo;s基因多样性指数为0.1139&mdash;0.8687，平均为0.6199，表现出较高的遗传多样性。【结论】基于轮枝镰孢基因组序列开发的SSR标记具有很好的多态性，可用于轮枝镰孢的遗传多样性分析。用22对SSR引物扩增，以遗传相似系数0.3进行划分，可将66株轮枝镰孢玉米分离物分为3群；中国轮枝镰孢玉米分离物的遗传多样性与地理分布无相关性。
REN X, ZHU Z D, LI H J, DUAN C X, WANG X M . SSR marker development and analysis of genetic diversity of Fusarium verticillioides isolated from maize in china
. Scientia Agricultura Sinica, 2012,45(1):52-66. (in Chinese)
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.01.007Magsci [本文引用: 1]
【目的】开发轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的SSR标记，为轮枝镰孢遗传多样性研究提供技术支持。【方法】利用Fastpcr在轮枝镰孢基因组中查找符合条件的SSR位点，采用Primer5.0软件设计引物，利用NTSYS及Popgene分析来自玉米的轮枝镰孢单孢分离物群体的PCR扩增结果。【结果】共设计有效扩增SSR引物158对，经筛选，109对（69.0%）可扩增出2条及以上的条带，其中55对引物（34.8%）多态性较好，可扩增出3条及以上的条带。从11条已组装的轮枝镰孢染色体上各选出2对多态性引物，计22对引物，对66株轮枝镰孢玉米分离物进行扩增，共获得125个等位变异，变异范围为2&mdash;11个，平均为5.68个。轮枝镰孢玉米分离物之间Nei&rsquo;s基因多样性指数为0.1139&mdash;0.8687，平均为0.6199，表现出较高的遗传多样性。【结论】基于轮枝镰孢基因组序列开发的SSR标记具有很好的多态性，可用于轮枝镰孢的遗传多样性分析。用22对SSR引物扩增，以遗传相似系数0.3进行划分，可将66株轮枝镰孢玉米分离物分为3群；中国轮枝镰孢玉米分离物的遗传多样性与地理分布无相关性。

[43] 朱华, 梁继农, 王彰明, 陈厚德, 奚京平, 仇宝华, 王全领 . 江苏省玉米茎腐病菌种类鉴定
植物保护学报, 1997,24(1):49-54.
Magsci [本文引用: 1]
作者于1992～1995年,从江苏省玉米主产区采集的玉米茎腐病标样中分离获得105个菌株,经鉴定,致病菌种类有肿囊腐霉(Pythium inflatum)、禾生腐霉(P.graminicola)、串珠镰孢浙江变种(Fusarium moniliforme var.zhejiangensis)、串珠镰孢中间变种(F.moniliforme var.intermedium)、串珠镰孢胶孢变种(F.moniliforme var.subglutinans)、禾谷镰孢(F.graminearum)、拟枝孢镰孢厚膜变种(F.sporotrichioides var.chlamydosporum)、尖孢镰孢芬芳变种(F.oxysporum var.redolens)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、茄病镰孢(F.solani)、半裸镰孢(F.semitectum)等11个种或变种。其中串珠镰孢浙江变种出现频率最高,占44.8％,肿囊腐霉和禾生腐霉致病力最强,这两类菌是江苏玉米茎腐病主要病原。
ZHU H, LIANG J N, WANG Z M, CHEN H D, XI J P, QIU B H, WANG Q L . Identification of pathogens causing maize stalk rot in Jiangsu Province
Acta Phytophylacica Sinica, 1997,24(1):49-54. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
作者于1992～1995年,从江苏省玉米主产区采集的玉米茎腐病标样中分离获得105个菌株,经鉴定,致病菌种类有肿囊腐霉(Pythium inflatum)、禾生腐霉(P.graminicola)、串珠镰孢浙江变种(Fusarium moniliforme var.zhejiangensis)、串珠镰孢中间变种(F.moniliforme var.intermedium)、串珠镰孢胶孢变种(F.moniliforme var.subglutinans)、禾谷镰孢(F.graminearum)、拟枝孢镰孢厚膜变种(F.sporotrichioides var.chlamydosporum)、尖孢镰孢芬芳变种(F.oxysporum var.redolens)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、茄病镰孢(F.solani)、半裸镰孢(F.semitectum)等11个种或变种。其中串珠镰孢浙江变种出现频率最高,占44.8％,肿囊腐霉和禾生腐霉致病力最强,这两类菌是江苏玉米茎腐病主要病原。

[44] 王富荣, 傅玉红, 陈永欣 . 山西省玉米茎腐病病原菌的分离及致病性测定
山西农业科学,1992(9):20-21.
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WANG F R, FU Y H, CHEN Y X . Isolation and pathogenicity determination of pathogen for corn stalk rot in Shanxi ProvinceJournal of Shanxi Agricultural Sciences,1992(9):20-21. (in Chinese)
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[45] 宋佐衡, 梁景颐, 白金铠 . 辽宁省玉米茎腐病病原菌的研究
沈阳农业大学学报, 1990,21(3):214-218.
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SONG Z H, LIANG J Y, BAI J K . Preliminary studies on the etiology of stalk rot of corn in Liaoning Province
Journal of Shenyang Agricultural University, 1990,21(3):214-218. (in Chinese)
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[46] 杨山山, 郝彦俊, 邱荣芳, 王晓鸣, 吴全安 . 新疆玉米青枯病病原菌分离和鉴定
新疆农业大学学报, 1997,20(2):29-36.
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YANG S S, HAO Y J, QIU R F, WANG X M, WU Q A . Etiology of corn stalk rot in Xinjiang
Journal of Xinjiang Agricultural University, 1997,20(2):29-36. (in Chinese)
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[47] 吴小龙 . 玉米青枯病菌的鉴定、生物学特性及生物防治研究
[D]. 雅安: 四川农业大学, 2010.
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WU X L . Isolation and identification and biological characteristics of pathogen of corn stalk rot and primary study on diseases biological control
[D]. Yaan: Sichuan Agricultural University, 2010. ( in Chinese)
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[48] 孙秀华, 孙亚杰, 张春山, 白金铠, 宋佐衡, 陈捷 . 玉米茎腐病病原菌相互作用研究
沈阳农业大学学报, 1992,23(2):93-96.
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SUN X H, SUN Y J, ZHANG C S, BAI J K, SONG Z H, CHEN J . Studies on the relationship among pathogens of corn stalk rot
Journal of Shenyang Agricultural University, 2016, 23(2):93-96. (in Chinese)
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[49] 陈绍江, 宋同明, 吴全安 . 玉米青枯病病原腐霉对其伴生镰刀菌的影响
植物病理学报, 1997,27(3):251-256.
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CHEN S J, SONG T M, WU A Q . Effect of Pythium on the growth of Fusarium in maize stalk rot
. Acta Phytopathologica Sinica, 1997,27(3):251-256. (in Chinese)
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