张晓星¹, 朱慧¹, 张东民¹, 宋丽雅², 张德贵¹, 翁建峰¹, 郝转芳¹, 李明顺^1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部遗传育种重点实验室, 北京 100081

²北京工商大学 / 北京市植物资源研究开发重点实验室, 北京 100048

^*通讯作者(Corresponding author): 李明顺, E-mail: limingshun@caas.cn, Tel: 010-82108747 第一作者联系方式: E-mail: zhangxiaoxing0401@163.com
收稿日期:2017-03-09 接受日期:2017-07-23网络出版日期:2017-08-10基金:本研究由国家自然科学基金项目(31401390)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CAR02-01)资助

摘要 opaque2基因能够提高糯玉米赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸的含量。用2种优质蛋白玉米(QPM) CA339和鲁2548自交系作为 opaque2基因供体, 25个品质较好的糯玉米自交系作为受体, 利用回交技术和SSR分子标记辅助选择育种, 创制糯玉米 opaque2近等基因系。分子标记结果表明, 不同受体以及两种供体间都存在多态性。5套创制成功的 opaque2近等基因系的赖氨酸含量比其轮回亲本分别提高了59.0%、52.7%、48.5%、46.3%和61.9%, 分别由0.308%、0.313%、0.309%、0.341%、0.323%提高到0.489%、0.478%、0.458%、0.498%、0.522%。本研究表明, 可以利用此方法通过向不同遗传背景的多种受体导入 opaque2, 选取赖氨酸含量提高较大、透明表型的近等基因系, 提高糯玉米的营养价值和经济价值。

关键词:糯玉米; opaque2基因; waxy基因; 近等基因系; 赖氨酸
Construction of Waxy Maize opaque2 Near-isogenic Lines
ZHANG Xiao-Xing¹, ZHU Hui¹, ZHANG Dong-Min¹, SONG Li-Ya², ZHANG De-Gui¹, WENG Jian-Feng¹, HAO Zhuan-Fang¹, LI Ming-Shun^1,*
1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China

²Beijing Technology and Business University / Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing 100048, China

Fund:This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401390) and the China Agriculture Research System (CAR02-01)
AbstractIn waxy maize, the opaque2 gene can increase the content of essential amino acids, such as lysine and tryptophan. Two high quality protein maize (QPM) inbred lines, CA339 and Lu 2548, were used as opaque2 gene donors. Twenty-five waxy maize with advantageous traits were used as receptors. Application of backcrossing and SSR marker-assisted selection in breeding can create waxy maize opaque2 near-isogenic lines. The results of molecular marker indicated that there were polymorphisms in different receptors and between the two donors. Lysine content of five sets of successfully created opaque2 near-isogenic lines was tested, showing that the content of lysine in o2w-NILs was 59.0%, 52.7%, 48.5%, 46.3%, and 61.9% higher than that in their recurrent parents, which was increased from 0.308%, 0.313%, 0.309%, 0.341%, 0.323% to 0.489%, 0.478%, 0.458%, 0.498%, and 0.522%, respectively. Using this method, opaque2 could be introgressed into multiple receptors with different genetic backgrounds to select near-isogenic lines with high lysine content and transparent phenotype, so as to improve nutritional and economic values of waxy maize.

Keyword:Waxy maize; Opaque2 gene; Waxy gene; Near-isogenic lines; Lysine
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糯玉米起源于中国, 因其口感软糯、香甜适宜鲜食, 深受我国人民的喜爱。糯玉米的糯质主要源于waxy隐性基因, 如果waxy基因发生突变^{[1, 2]}, 将导致颗粒紧密结合型淀粉酶I (GBSS I)表达受到抑制, 使胚乳中直链淀粉合成受阻。由于糯玉米胚乳中的淀粉绝大部分为支链淀粉, 所以糯玉米也是饲料、医药、食品、酿造、纺织、造纸等行业的重要原料, 具有很高的经济价值^[3]。但是糯玉米的营养价值并不完全, 赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸等必需氨基酸含量较少^[4], 不能满足人畜对赖氨酸的需求^[5], 使糯玉米的推广和应用受到了一定限制。所以在育种中提高糯玉米的赖氨酸含量, 对完善其营养品质及提高其食用价值具有重要意义。
近年来, 将opaque2(o2)突变基因导入普通玉米是提高赖氨酸含量最有效的方法^[6]。O2基因位于玉米第7染色体的短臂^{[7, 8]}, 编码的O2蛋白属于碱性亮氨酸拉链家族^{[9, 10, 11]}, 是一个转录调节蛋白, 能够转录激活多个醇溶蛋白基因。经前人研究, 由于o2突变导致转录功能受到抑制, 使醇溶蛋白合成减少, 非醇溶蛋白含量相应增加, 从而使玉米籽粒的赖氨酸含量增加^{[12, 13]}。但是由于o2突变体籽粒的粉质、不透明、抗病性差等农艺性状, 限制了其应用和推广^[14]。国际小麦玉米改良中心(CIMMYT)的科研人员培育出了优质蛋白玉米(QPM), 利用胚乳修饰基因将高赖氨酸玉米的粉质胚乳改良为硬质胚乳^[15]。我国育种家也成功培育出CA335、CA339、齐205、鲁2548等QPM自交系, 既提高了玉米籽粒的赖氨酸含量, 又将玉米胚乳改良为硬质型, 籽粒产量接近或达到普通玉米杂交种^[16]。
目前将o2基因导入糯玉米的研究还较少, 研究表明, 糯玉米中导入o2基因后, 籽粒赖氨酸含量会有不同程度的提高^{[17, 18]}。本研究通过o2供体材料CA339和鲁2548, 将o2导入25份口感好、品质优良、农艺性状稳定、抗病性强的糯玉米自交系, 利用SSR分子标记辅助育种技术监控o2在子代中的传递, 创制糯玉米o2基因近等基因系, 利用o2提高糯玉米的赖氨酸含量, 从而提高糯玉米的营养品质, 为后续研究o2w2-NILs在籽粒形态、营养成分、O2蛋白等方面的变化奠定基础。
1 材料与方法1.1 试验材料选取25个口感好、品质优良、农艺性状稳定、抗病性强的糯玉米自交系作为受体亲本, 优质蛋白玉米CA339和鲁2548作为o2基因的供体亲本。以上材料均由中国农业科学院作物科学研究所玉米优质抗逆课题组提供, 详细材料见表1。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 试验材料 Table 1 Maize materials 编号 Number 名称 Name 基因型 Genotype 编号 Number 名称 Name 基因型 Genotype QN101 中97-7 Zhong 97-7 O2O2wxwx QN115 N6-2 O2O2wxwx QN102 中63-2 Zhong 63-2 O2O2wxwx QN116 SY1-2 O2O2wxwx QN103 中145 Zhong 145 O2O2wxwx QN117 YHN1 O2O2wxwx QN104 中115-2 Zhong 115-2 O2O2wxwx QN118 HN54 O2O2wxwx QN105 中407 Zhong 407 O2O2wxwx QN119 BZH15 O2O2wxwx QN106 赵OP-6 Zhao OP-6 O2O2wxwx QN120 HN15 O2O2wxwx QN107 300父本(♂) 300 male parent O2O2wxwx QN122 糯2 Nuo 2 O2O2wxwx QN108 300母本(♀) 300 female parent O2O2wxwx QN126 糯10 Nuo 10 O2O2wxwx QN109 中501 Zhong 501 O2O2wxwx QN127 黄2杂Huang 2 heterozygosis O2O2wxwx QN110 中522 Zhong 522 O2O2wxwx QN128 糯8 Nuo 8 O2O2wxwx QN111 黄糯1 Huangnuo 1 O2O2wxwx QN129 232郑58 232 Zheng 58 O2O2wxwx QN112 黄糯2 Huangnuo 2 O2O2wxwx QT2 CA339 o2o2WXWX QN113 NT24 O2O2wxwx QT5 鲁2548 Lu 2548 o2o2WXWX QN114 BN3 O2O2wxwx

表1 试验材料 Table 1 Maize materials

1.2 试验方法1.2.1 田间种植与取样 试验材料于2008— 2016年夏季种植于北京, 冬季种植于海南三亚, o2w2-NILs创制过程中分别种植2~5行供受体亲本, 子代群体单穗播种1~2行, 行长3 m, 株距25 cm。在o2w2-NILs创制过程中, 子代群体只保留经SSR分子标记选择基因型正确且植株表型与受体亲本植株表型相似的单株, 并严格进行杂交或自交授粉。
1.2.2 o2w2-NILs创制流程 利用分子标记辅助选择创制o2w2-NILs流程如图1所示。以QPM自交系作为o2供体亲本, 与25个糯玉米自交系杂交, 以受体材料作为轮回亲本回交5~7代, 用SSR引物phi057、phi027选择基因型为O2o2wxwx且表型与受体亲本相似的杂合植株自交, 最后自交多代选择o2基因纯合且稳定遗传的植株, 直至成功创制o2w2-NILs。
图1
Fig. 1

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	图1 o2w2-NILs创制流程图Fig. 1 Flow-process diagram of construction of o2w2-NILs

1.2.3 玉米叶片基因组DNA的提取 植株生长到6~7叶时的单株挂牌, 取1 cm²较幼嫩的叶片装入2.0 mL离心管, 并加入2个小钢珠, 放入液氮冷冻后用研磨机将样品打碎成粉末状, 采用CTAB法^[19]提取叶片基因组DNA, 用灭菌ddH₂O将DNA粉末溶解。使用NanoDrop 2000检测DNA浓度, 将DNA浓度稀释到100 ng µ L^-1左右。
1.2.4 SSR分子标记检测基因型 引物phi057是由先锋公司开发的O2基因内的特异引物, 能够区分显性纯合、杂合和隐性纯合3种基因型; 引物phi027可特异性检测waxy基因型, 在回交过程中用引物phi027检测子代的糯性。引物序列来自MaizeGDB数据库, 由北京天一辉远生物科技有限公司合成, 引物序列见表2。
表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 SSR引物信息 Table 2 Primer information of SSR 引物名称 Primer 引物序列 Sequence (5° -3° ) 退火温度 Annealing temp. phi057-F CTCATCAGTGCCGTCGTCCAT 59.5° C phi057-R CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC phi027-F CACAGCACGTTGCGGATTTCTCT 61.0° C phi027-R GCGTACGTACGACGAAGACAC

表2 SSR引物信息 Table 2 Primer information of SSR

PCR体系10 µ L, 含1.5 µ L 10× buffer、0.8 µ L dNTP (25 mmol L^-1)、0.3 µ L引物(20 µ mol L^-1)、0.2 µ L TaqDNA聚合酶(2 U µ L^-1)、1.0 µ L DNA模板和5.9 µ L ddH₂O。10× buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司。
使用降落式PCR扩增引物phi057, 反应程序为94° C预变性5 min; 94° C变性30 s, 61° C退火30 s, 72° C延伸20 s, 5个循环; 94° C变性30 s, 59° C退火30 s, 72° C延伸20 s, 10个循环; 94° C变性30 s, 57° C退火30 s, 72° C延伸20 s, 20个循环; 72° C延伸10 min, 12° C保存。引物phi027使用普通式PCR扩增, 94° C预变性3 min; 94° C变性30 s, 61° C退火30 s, 72° C延伸20 s, 35个循环; 72° C延伸10 min, 12° C保存。PCR仪为伯乐公司的C2000ThermalCycler。
在PCR产物中加入1× 终浓度的loading buffer, 配置8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.5 籽粒赖氨酸含量测定 选取中97-7/o2o2、中63-2/o2o2、赵OP-6/o2o2、300父本/o2o2、中501/o2o2这5套创制成功的o2w2-NILs及其受体亲本和供体亲本CA339, 称取成熟期干燥籽粒各100 g, 送农业部谷物品质监督检验测试中心, 测定玉米籽粒赖氨酸含量。

2 结果与分析2.1 SSR分子标记检测供体和受体亲本遗传多态性利用引物phi057检测供受体亲本o2基因的遗传多态性。如图2所示, 引物phi057在25种糯玉米受体亲本间可以扩增出3类不同大小的条带, 泳道C、17、19所代表的CA339、YHN1、BZH15是一类, 泳道D、3、8、10所代表的鲁2548、中145、300母本(♀)、中522是一类, 其他是一类, 多态性较好。2个供体亲本CA339和鲁2548为o2o2隐性纯合基因型, 受体亲本都为O2O2显性纯合基因型, 为保证引物phi057在O2基因上的共显性以便于SSR分子标记筛选, 在创制o2w2-NILs时, 根据遗传多态性检测结果配置杂交组合, 受体亲本YHN1和BZH15与鲁2548杂交, 其余糯玉米受体亲本与CA339杂交。
图2
Fig. 2

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	图2 引物phi057检测供体和受体亲本间的遗传多态性 C: CA339; D: 鲁2548; M: DNA marker; 1~25: 25个糯玉米自交系。Fig. 2 Polymorphism analysis of SSR primer phi057 between donors and receptors C: CA339; D: Lu 2548; M: DNA marker; 1-25: 25 waxy maize inbred lines.

2.2 回交及自交过程中利用引物phi057筛选单株在创制o2w2-NILs的回交过程中, 用引物phi057对每一单株的基因型进行检测, 根据SSR分子标记结果筛选O2o2杂合基因型植株作为非轮回亲本, 与轮回亲本回交。图3是BC₅F₁世代部分群体的检测结果。从电泳结果可以看出, 泳道1、3、7、8、9、10、11、12、13、14、18、20、21、22为O2o2杂合基因型, 泳道2、4、5、6、15、16、17、19为O2O2显性纯合基因型。在田间砍除显性纯合基因型的植株, 筛选O2o2杂合基因型且表型与轮回亲本相似的植株继续回交或自交。
图3
Fig. 3

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	图3 回交过程中引物phi057检测糯玉米自交系BC5F1世代基因型 C: CA339; R: 轮回亲本; 1~22: BC5F1世代不同单株。Fig. 3 Genotype identification of waxy maize in BC5F1backcross population C: CA339; R: Recurrent parent; 1-22: Different individuals from BC5F1family.

将BC₅F₁回交世代的杂合植株进行严格的自交授粉, 将获得的BC₅F₂世代分离群体播种后, 用引物phi057对每一单株的基因型进行检测。图4是BC₅F₂世代部分群体的检测结果。可以看出, 泳道6、9、10、17、24带型与CA339带型一致, 是o2o2隐性纯合基因型, 泳道1、2、3、4、5、7、11、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23为O2o2杂合基因型, 泳道8、12、25带型与轮回亲本带型一致, 是O2O2显性纯合基因型。筛选基因型为o2o2且田间表型与其轮回亲本相似的植株继续自交。
图4
Fig. 4

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	图4 自交过程中引物phi057检测糯玉米自交系BC5F2世代基因型 C: CA339; R: 轮回亲本; 1~25: BC5F2世代不同单株。Fig. 4 Genotype identification of waxy maize in BC5F2inbred population C: CA339; R: Recurrent parent; 1-25: Different individuals from BC5F2family.

2.3 o2w2-NILs基因型检测对19套创制成功的o2w2-NILs进一步用引物phi057进行SSR检测, 其带型与供体亲本带型一致, 即确保都是隐性纯合基因型。图5所示是已创制成功的o2w2-NILs部分个体引物phi057检测结果, 试验证明opaque2基因已成功导入性状优良的糯玉米自交系。用引物phi027对创制成功的o2w2-NILs的wx基因型进行检测, 结果如图6所示, 其带型与受体亲本带型一致, 全部为wxwx隐性纯合基因型。
图5
Fig. 5

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	图5 引物phi057检测BC5F3世代基因型 C: CA339; R: 轮回亲本; 1~34: BC5F3世代不同单株; M: DNA marker。Fig. 5 Genotype identification of waxy maize in BC5F3family with primer phi057 C: CA339; R: Recurrent parent; 1-34: Different individuals from BC5F3family; M: DNA marker.

图6
Fig. 6

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	图6 引物phi027检测BC5F3世代基因型 1~26: BC5F3世代不同单株; C: CA339; R: 轮回亲本。Fig. 6 Genotype identification of waxy maize in BC5F3family with primer phi027 1-26: Different individuals from BC5F3family; C: CA339; R: Recurrent parent.

2.4 o2w2-NILs及其供受体亲本籽粒赖氨酸含量检测对中97-7/o2o2、中63-2/o2o2、赵OP-6/o2o2、300父本/o2o2、中501/o2o2这5套创制成功的o2w2-NILs及其受体亲本和供体亲本CA339的成熟期干燥籽粒赖氨酸含量检测(图7)表明, o2供体亲本CA339的籽粒赖氨酸含量为0.453%, 比5个轮回亲本都高, 而且5套o2w2-NILs的籽粒赖氨酸含量比其受体亲本均显著提高, 分别由0.308%、0.313%、0.309%、0.341%、0.323%提高到0.489%、0.478%、0.458%、0.498%、0.522%, 分别提高了59.0%、52.7%、48.5%、46.3%和61.9% (P< 0.01)。说明o2基因的导入使糯玉米自交系的赖氨酸含量有了较大的提高, 增加了其营养价值。
图7
Fig. 7

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	图7 赖氨酸含量检测结果 * * 表示差异达到0.01显著水平。Fig. 7 Test results of lysine content * * indicates significance at the 0.01 probability level.

3 讨论玉米品质的改良一直受到育种家的重视, 糯玉米具有很高的营养价值和经济价值, 但是缺少赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸等必需氨基酸, 使糯玉米的应用受到了限制。遗传学家在20世纪初在玉米中发现了o2突变基因, 能够使玉米籽粒中赖氨酸含量提高, 但是o2突变体产量低、抗逆性差、籽粒为粉质等农艺性状阻碍了其商业化生产。CIMMYT的科研人员利用胚乳修饰基因, 将高赖氨酸玉米的粉质胚乳改良为硬质胚乳, 育成优质蛋白玉米(QPM)^[20], 促进了o2突变基因在玉米育种和生产中的应用。
我国的QPM育种工作也取得了一定的进展, 培育出CA335、CA339、齐205、鲁2548等QPM自交系, 可使玉米籽粒的赖氨酸含量提高到0.4%左右。利用分子标记辅助选择技术将糯玉米自交系转育为优质蛋白糯玉米自交系, 是一种高效、快速的改良糯玉米品质的方法。20世纪末, 先锋公司^[21]和密苏里大学开发出O2基因的3对SSR特异性引物, phi057、phi112和umc1066。引物phi057是共显性标记, 能够区分显性纯合、杂合和隐性纯合基因型, 比另2种引物的标记效果更好^{[22, 23]}。在创制o2w2-NILs时, 必须先检测供体亲本和受体亲本之间的多态性, 如图2所示, 必须选择具有多态性的两个亲本进行杂交, 否则在后代进行分子标记筛选单株时无法确定基因型, 选择正确的杂交组合是创制o2w2-NILs的关键。
本试验中检测了5套o2w2-NILs的籽粒中赖氨酸含量, 其供体亲本都是CA339, 赖氨酸含量较其受体亲本都有了较大幅度的提高, 普通糯玉米自交系的赖氨酸含量平均为0.318%, o2w2-NILs的赖氨酸含量平均为0.489%。但是在不同遗传背景中提高的幅度不同, 最低的提高了46.3%, 最高的提高了61.9%, 这说明赖氨酸含量提高的不一致可能与其受体亲本有关。
4 结论通过SSR分子标记监控o2突变基因在子代中的传递, 把o2导入到口感好、品质优良、抗病性强的糯玉米自交系中, 构建玉米双隐性o2w2-NILs, 建立了一套在糯玉米中导入o2的分子标记辅助育种方法。通过此方法向不同遗传背景的多种受体导入o2, 选取赖氨酸含量提高较大、表型透明的o2w2-NILs, 提高了糯玉米的营养价值和商品价值。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


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