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水稻抗稻瘟病基因 Pi35功能性分子标记的开发及其应用

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

马建*, 马小定*, 赵志超, 王帅, 王久林, 王洁, 程治军雷财林*, 雷财林*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
*通讯作者(Corresponding author): 雷财林, E-mail: leicailin@caas.cn **同等贡献(Contributed equally to this work) 第一作者联系方式: 马建, E-mail: jian.ma2018@aliyun.com; 马小定, E-mail: maxiaoding@caas.cn
收稿日期:2015-04-09 接受日期:2015-07-20网络出版日期:2015-08-28基金:本研究由国家自然科学基金项目(30871606, 31471758)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08001)资助

摘要稻瘟病是水稻生产上的严重病害, 利用抗病基因培育抗病品种是控制稻瘟病最经济而有效的措施。在日本, 稻瘟病部分抗性基因 Pi35作为广谱持久抗性基因已广泛应用于水稻育种和稻瘟病防治实践。但是, Pi35基因在我国的资源和品种中的分布情况不清, 制约了这一重要基因在我国育种实践中的应用, 急需开发实用的分子标记, 并系统研究该基因在我国的品种及其亲本中的分布情况, 为稻瘟病抗性育种服务。本研究通过比对抗、感品种中 Pi35等位基因序列, 发现一个能检测抗、感病性差异的特异SNP (3780 T), 并据此开发了 Pi35基因的功能性分子标记Pi35- dCAPS。利用该标记检测了抗源藤系138的衍生品种10份、微核心种质204份和主栽品种67份, 结合测序鉴定, 确认5份藤系138衍生品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34)及2份微核心种质(粳稻品种抚宁紫皮粳子和籼稻品种细麻线)携带 Pi35基因。本研究结果为通过分子育种手段高效利用 Pi35基因改良我国水稻(特别是籼稻)品种的稻瘟病抗性提供了手段。

关键词:水稻; 稻瘟病; 部分抗性基因; 功能性标记; 分子标记辅助选择
Development and Application of a Functional Marker of the Blast Resistance Gene Pi35in Rice
MA Jian**, MA Xiao-Ding**, ZHAO Zhi-Chao, WANG Shuai, WANG Jiu-Lin, WANG Jie, CHENG Zhi-Jun, LEI Cai-Lin*
National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Fund:This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30871606, 31471758) and the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation (2014ZX08001)
AbstractRice blast is one of the most destructive diseases, and breeding resistant cultivars is considered to be the most economical and effective strategy to control this disease. The Pi35gene shows partial resistance to leaf blast and has been used as a broad-spectrum and durable resistance source in rice breeding programs in Japan. However, its distribution is not clear in Chinese rice germplasm and cultivars. For the purpose to facilitate the application of Pi35 in rice breeding programs in China, we compared the coding sequences of Pi35 alleles in multiple resistant and susceptible rice cultivars, found a specific nucleotide 3780T which was only present in the functional resistance allele of Pi35, and further developed a Pi35functional marker (Pi35-dCAPS). Among 281 rice accessions including 10 Fukei 138-derived japonicacultivars, 67 leading cultivars, and 204 accessions of rice mini-core collection of Chinese germplasm, five Fukei 138-derived cultivars (Kenjiandao 3, Kenjiandao 6, Kendao 8, Suijing 3, and Longjing 34) and two mini-core accessions ( japonicacv. Funingzipijingzi and indica cv. Ximaxian) were detected to possess the intact Pi35 gene by using the Pi35-dCAPS marker in combination with the genomic sequencing of Pi35. These results will greatly facilitate the utilization of Pi35 in rice breeding programs by marker-assisted selection.

Keyword:Rice; Blast disease; Partial resistance gene; Functional marker; Marker-assisted selection
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稻瘟病是水稻生产上最主要的病害之一, 严重影响稻谷的产量和质量[1]。利用寄主抗病基因培育并种植抗病品种是控制稻瘟病最安全、经济和有效的措施[2]。水稻对稻瘟病的抗性可被划分为完全抗性(或称质量抗性、主效基因抗性、垂直抗性等)和部分抗性(或称数量抗性、微效基因抗性、田间抗性等)[1, 3]。完全抗性能完全抵抗稻瘟病菌的侵染和繁殖而表现高度抗性, 一般受单个或几个主效基因控制, 这类抗性具有很强的小种专化性, 容易随着小种的变化而丧失[1, 4, 5]。部分抗性一般被视为数量性状, 它不能阻止稻瘟病菌的侵染, 但可以减少病原菌在寄主体内的增殖, 起到降低病斑数目和病斑大小而减轻病害的作用。大多数部分抗性受多个微效基因或数量性状位点(quantitative trait loci, QTL)控制, 无明显的小种专化性, 具有这类抗性的水稻品种往往因其降低了对病原菌的选择压而保持稳定和持久的抗性[4, 6, 7]。因此, 提高部分抗性水平一直是水稻抗稻瘟病育种的一个重要目标[4, 8]
随着分子生物学和QTL定位技术的发展, 水稻稻瘟病抗性基因研究取得很大进展, 迄今已鉴定和定位90多个完全抗性基因及300多个抗性QTL或部分抗性基因, 克隆了PiaPibPitaPi1Pi2Pi5Pi9Pi36Pi37Pi54Pi64Pi-d2Pi-d3PikPik-mPik-pPik-hPishPitPiz-t等20个完全抗性基因, 以及pi21Pb1Pi63Pi35等4个部分抗性基因(http://www.ricedata.cn/gene/gene_ pi.htm)[7, 9, 10, 11, 12]; 并开发了针对Pita[13]Pib[14]Pik[15]Pik-m[15]Pik-p[16]Pi1[17]Pit[18]Pi5[19]Pi25[20]Pi54[21]Pi64[22]等11个完全抗性基因的功能性标记。Pi35是最近被克隆的一个稻瘟病部分抗性基因, 是Pish的等位变异基因[7]。携带Pi35基因的粳稻品种北海188 (Hokkai 188)和藤系138 (Fukei 138)在日本自育成30多年来一直保持稳定的高水平的叶瘟抗性[6, 7, 23]; 其中, 藤系138在上世纪80年代中期被引入黑龙江、吉林等省的有关育种单位, 并以之作为抗性亲本培育了一批推广品种[24]。但是, Pi35基因在我国的资源和品种中的分布情况不清, 制约了这一重要基因在我国育种实践中的应用, 急需开发实用的分子标记, 并系统研究该基因在我国的品种及其亲本中的分布情况, 为稻瘟病抗性育种实践服务。本研究拟通过测序和比对多个抗病和感病水稻品种的Pi35等位基因序列, 在开发出Pi35基因特异功能性分子标记的基础上, 对我国水稻核心种质资源和部分育成品种进行鉴定, 以期发掘携带Pi35基因的新种质, 推进我国水稻(特别是籼稻)品种的稻瘟病持久抗性育种工作。
1 材料与方法1.1 水稻材料供试水稻材料包括抗性品种藤系138, 感病对照品种丽江新团黑谷(LTH)和日本晴; 藤系138的衍生品种10份(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、垦稻12、垦稻16、绥粳3号、龙花00-835、龙粳10号、龙粳13和龙粳34); 水稻微核心种质204份及主栽培品种67份(见附表)。其中, 藤系138和微核心种质由中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质资源平台水稻中期库提供, 藤系138的衍生品种由黑龙江农垦科学院水稻研究所和黑龙江省农业科学绥化分院提供, 67份水稻主栽培品种由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供, 品种LTH和日本晴为本实验室保存的材料。
供试稻瘟病菌株包括日本致病性稳定菌株Ken 54-20(小种003)和Ken 53-33(小种137.1), 用于藤系138及Pi35基因的部分抗性评价[6, 7, 23, 25]
附表
Table
附表(Table)
附表 Table Supplementary table Screening of the Pi35 gene in the mini-core collection of rice germplasm and contemporary leading cultivars in Chinay
品种(系)
Cultivar (line)
亚种
Sub-species
Pi35基因
Pi35gene
品种(系)
Cultivar (line)
亚种
Sub-species
Pi35基因
Pi35 gene
微核心种质 Mini-core collection
抚宁紫皮粳子FuningzipijingziJ+红谷 HongguI-
隆化毛葫芦LonghuamaohuluJ-三颗寸 SankecunI-
高阳淀稻大红芒
Gaoyangdiandaodahongmang
J-山酒谷 ShanjiuguJ-
水原300粒 SuwonsanbailiJ-毫马克(K) Haomake (K)J-
叶里藏花 YelicanghuaJ-文香糯 WenxiangnuoI-
中楼1号 Zhonglou 1J-毫补卡 HaobukaJ-
卫国 WeiguoJ-三磅七十萝 SanbangqishiluoJ-
丹东陆稻 DandongludaoJ-齐头白谷 QitoubaiguJ-
兴国 XingguoJ-木邦谷 MubangguJ-
老光头83 Laoguangtou 83J-大弯糯 DawannuoI-
白毛稻 BaimaodaoJ-紫米 ZimiJ-
木樨球 MuxiqiuJ-香谷 XiangguJ-
老虎种 LaohuzhongJ-小红谷 XiaohongguJ-
有芒早粳 YoumangzaojingJ-清可 QingkeI-
黄壳早廿日 HuangkezaonianriJ-五子堆 WuziduiJ-
百歌稻 BaigedaoJ-老造谷 LaozaoguI-
寸三粒 CunsanliJ-毫巴永1号 Haobayong 1J-
铁秆乌 TieganwuJ-公居73 Gongju 73J-
六十早 LiushizaoI-冷水谷2号 Lengshuigu 2J-
秋前白 QiuqianbaiI-冷水糯 LengshuinuoJ-
雷火占 LeihuozhanI-拉木加 LamujiaJ-
肥东塘稻 FeidongtangdaoJ-齐头谷 QitouguI-
金溪白 JinxibaiI-紫糯 ZinuoI-
微核心种质 Mini-core collection
解放籼 JiefangxianI-鱼眼糯 YuyannuoJ-
三百粒 SanbailiI-黄皮糯 HuangpinuoJ-
台山糯 TaishannuoI-魔王谷内杂 MowangguneizaJ-
矮禾迟 AihechiI-毫莱 HaolaiI-
矮密 AimiI-毫香 HaoxiangI-
红米三担白 HongmisandanbaiI-毫荒腊 HaohuanglaI-
金包银 JinbaoyinJ-南高谷 NangaoguI-
闽北晚籼 MinbeiwanxianI-金枝糯 JinzhinuoI-
陆财号 LucaihaoI-鸡血糯 JixuenuoJ-
乌壳占 WukezhanI-饭毫皮 FanhaopiI-
一支香 YizhixiangI-半节芒 BanjiemangJ-
盐水赤 YanshuichiI-秕五升 BiwushengI-
鼠牙占 ShuyazhanI-八百粒 BabailiJ-
丝苗 SimiaoI-细麻线 XimaxianI+
饿死牛 EsiniuI-乌嘴红谷 WuzuihongguI-
齐眉 QimeiI-背子糯 BeizinuoJ-
南雄早油占 NanxionghanyouzhanI-泽谷 ZeguJ-
白壳花糯 BaikehuanuoI-麻谷糯 MagunuoJ-
黑督4号 Heidu 4I-香糯 XiangnuoJ-
赤壳糯 ChikenuoI-黏壳糯 ZhankenuoI-
三粒寸 SanlicunJ-马尾黏 MaweinianI-
西什15 Xishi 15J-红壳折糯(2) Hongkezhenuo (2)J-
横县良春畚谷
Hengxianliangchunbengu
I-寸谷糯 CungunuoI-
矮仔占 AizizhanI-飞蛾糯2号 Fei’ enuo 2I-
红粳旱谷 HongjinghanguJ-紫芒飞蛾糯 Zimangfei’ enuoJ-
红矮糯 Hong’ ainuoI-油黏 YounianJ-
七月籼 QiyuexianI-贯推白禾1号 Guangtuibaihe 1J-
光壳香糯 GuangkexiangnuoJ-阳壳糯 YangkenuoI-
洞庭晚籼I Dongtingwanxian II-毫虑光黏 Haolü guangnianJ-
洞庭晚籼II Dongtingwanxian III-小白米XiaobaimiI-
柳叶黏 LiuyenianI-麻谷子MaguziJ-
宣恩长坛青黏
Xuan’ enchangtanqingnian
I-老红稻LaohongdaoJ-
霸王鞭1 Bawangbian 1J-加巴拉 JiabalaI-
矮脚早 AijiaozaoI-黑芒稻 HeimangdaoJ-
须谷糯 XugunuoJ-葡萄黄 PutaohuangJ-
木瓜糯 MuguanuoJ-台东陆稻328 Taichunglutao 328J-
红旗5号 Hongqi 5J-台中65/台中HR539
Taichung 65/Taichung HR539
J-
微核心种质 Mini-core collection
万利籼 WanlixianI-台中在来1号/台中65
Taichung Native 1/Taichung 65
I-
香稻 XiangdaoI-台中籼选220
Taichunghsienhsuan 220
I-
旱麻稻 HanmadaoI-闷加高1号Menjiagao 1J-
细白黏 XibainianJ-闷加丁2号Menjiading 2I-
麻麻谷 MamaguI-包二幅Bao’ erfuI-
南天纲酒谷 NantiangangjiuguJ-金南特B Jinnante BI-
梅花糯 MeihuanuoI-竹珍B Zhunzhen BI-
中农4号 Zhongnong 4I-朝阳1号B Chaoyang 1BI-
L301BI-G珍汕97B G zhenshan 97BJ-
安农晚粳B Annongwanjing BJ-88BI-
金南特43B Jinnante 43BI-古154 Gu 154I-
早熟农虎6号B Zaoshunonghu 6 BJ-圭630 Gui 630I-
青四矮16B Qingsiai 16BI-IR 661-1(早) IR 661-1 (zao)I-
珍汕97B Zhenshan 97BI-培C122 Pei C122J-
献改B Xiangai BI-粳7623 Jing 7623J-
江农早1号B Jiangnongzao 1 BI-宁恢21 Ninghui 21J-
京虎B Jinghu BJ-76-1J-
黎明B Liming BJ-湖恢628 Huhui 628J-
滇瑞409B Dianrui 409BI-特青选恢TeqingxuanhuiI-
包协123B Baoxie 123BI-湘恢91269 Xianghui 91269I-
80BI-JWR 221J-
包协-7B Baoxie-7BI-广陆矮4号 Guanglu’ ai 4I-
苏粳2号 Sujing 2J-矮脚南特 AijiaonanteI-
成都矮3号 Chengdu’ ai 3I-柳沙1号 Liusha 1I-
矮麻抗 AimakangI-郴晚3号 Chenwan 3J-
蜀丰101 Shufeng 101I-二九南1号 Erjiunan 1I-
立新粳 LixinjingJ-南京11 Nanjing 11I-
黑粳2号 Heijing 2J-桂花黄GuihuahuangJ-
桂朝2号 Guichao 2I-湘矮早10号 Xiang’ aizao 10I-
二钢矮 Ergang’ aiI-湘晚籼1号 Xiangwanxian 1I-
包选21 Baoxuan 21I-南特号NantehaoI-
广陆矮15-1 Guanglu’ ai 15-1I-秀水115 Xiushui 115J-
红晚1号 Hongwan 1I-扬稻2号 Yangdao 2I-
黄丝桂占 HuangsiguizhanI-泸科3号 Luke 3I-
早熟香黑米 ZaoshuxiangheimiI-矮沱谷151 Aituogu 151I-
墨米MomiI-中花8号 Zhonghua 8J-
金优1号 Jinyou 1I-晋稻1号 Jindao 1J-
粳87-304 Jing 87-304J-辽粳287 Liaojing 287J-
微核心种质 Mini-core collection
湘晚籼3号 Xiangwanxian 3I-镇籼232 Zhenxian 232I-
湘早籼7号 Xiangzaoxian 7I-早籼240 Zaoxian 240I-
郑稻5号 Zhengdao 5J-当育5号 Dangyu 5J-
四倍体朝6号Sibeitichao 6J-成农水晶 ChengnongshuijingI-
主栽品种Leading cultivar
宁粳16 Ningjing16J-中优早81 Zhongyouzao 81I-
甬粳18 Yongjing 18J-中鉴100 Zhongjian 100I-
豫粳6号 Yujing 6J-扬稻6号 Yangdao 6I-
武香稻14 Wuxiangdao 14J-嘉育948 Jiayu 948I-
五优1号 Wuyou 1J-佳禾早占 JiahezaozhanI-
辽粳294 Liaojing 294J-舟优903 Zhouyou 903I-
松粳6号 Songjing 6J-辐恢838 Fuhui 838I-
辽粳454 Liaojing 454J-CDR22I-
秀水664 Xiushui 664J-93-11I-
富士光 FujihikariJ-明恢86 Minghui 86I-
龙粳8 Longjing 8J-多系1号 Duoxi 1I-
辽294 Liao 294J-蜀恢527 Shuhui 527I-
秀水63 Xiushui 63J-绵恢501 Mianhui 501I-
武育粳3号Wuyujing 3J-9308SCI-
武育粳7号Wuyujing 7J-密阳46 Milyang 46I-
空育131 Kuiku 131J-测64-7 Ce 64-7I-
三江1号 Sanjiang 1J-盐恢559 Yanhui 559I-
吉粳88 Jijing 88J-桂99 Gui 99I-
徐稻3号 Xudao 3J-明恢77 Minghui 77I-
宁粳1号 Ningjing 1J-绵恢725 Mianhui 725I-
粤香占 YuexiangzhanI-R752I-
籼小占 XianxiaozhanI-R207I-
特籼占25 Texianzhan 25I-R3027I-
II-32BI-协青早B Xieqingzao BI-
II-32AI-培矮64s Pei’ ai 64sI-
冈46B Gang 46BI-湘早籼31 Xiangzaoxian 31I-
冈46A Gang 46AI-湘晚籼11 Xiangwanxian 11I-
D62BI-湘晚籼9号 Xiangwanxian 9I-
金23B Jin 23BI-R253I-
金23A Jin 23AI-珍汕97A Zhenshan 97AI-
中9B Zhong 9BI-谷梅2号 Gumei 2I-
中9A Zhong 9AI-谷梅4号 Gumei 4I-
龙特浦B Longtepu BI-菲改B Feigai BI-
新香B Xinxiang BI-
“ I” indicatesindica; “ J” indicatesjaponica; “ +” means the germplasm containing Pi35; “ -” means Pi35is absent in the germplasm.
I: 籼稻; J: 粳稻; “ +” : 含有Pi35基因; “ -” : 不含有Pi35基因。

附表 Table Supplementary table Screening of the Pi35 gene in the mini-core collection of rice germplasm and contemporary leading cultivars in Chinay

1.2 稻瘟病抗性评价将供试水稻材料浸种至露白后, 穴播于装有草炭土的塑料育苗盘(54 cm × 28 cm × 4 cm, 60穴), 每穴10~15粒种子, 重复3次。待稻苗长至二叶一心叶时, 用木村营养液B[26]定期浇灌。待稻苗生长至四叶一心时喷雾接种稻瘟病菌[27]。7 d后, 参考Mackill和Bonman[5]的标准调查病情。0级为无任何病斑; 1级为直径小于0.5 mm的褐色斑点; 2级为直径0.5~1.0 mm的褐色病斑; 3级为直径1~3 mm的圆形或椭圆形病斑, 中央灰白色, 边缘褐色; 4级为典型的纺锤形病斑, 直径3 mm或更长, 病斑无融合或稍有融合; 5级为同4级病斑, 但病斑融合, 叶片的上半部枯死。0~1级视为抗病(R), 2级视为中抗(MR), 3级视为中感(MS), 4~5级视为感病(S)。
1.3 DNA提取、PCR及扩增产物酶切利用CTAB法[28]提取叶片基因组总DNA。PCR体系为20 μ L, 包括10 μ L 2× PCR buffer for KOD FX、4 μ L dNTP (2 mmol L-1 each)、1 μ L Primers (10 mmol L-1, F+R)、0.4 μ L KOD FX (1 U μ L-1, TOYOBO)、2 μ L基因组DNA (100 ng μ L-1)和2.6 μ L ddH2O。PCR程序为94℃ 2 min; 98℃ 10 s, 59℃ 15 s, 68℃ 0.5~8.0 min (依片段大小而定, 1 kb min-1), 35个循环; 68℃延伸5 min。酶切反应体系为25 μ L, 包括20 μ L PCR产物、2 μ L的10× FastDigest green buffer、1 μ L的Tai I内切酶(Thermo Scientific, USA)和2 μ L的ddH2O, 65℃酶切3 h。PCR产物由北京博迈德生物有限公司测序, 用DNAMAN软件(http://www.lynnon. com/)拼接。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 基因序列分析与标记开发从Gramene网站(http://www.gramene.org/)获得Pish基因序列(Os01g0782100, 登录号为NM_001185663.1), 从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得Pi35基因序列(登录号为FW369319.1)。从感病品种丽江新团黑谷(LTH)中扩增出这2个基因的等位变异序列。利用软件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl. edu/dcaps/dcaps.html)和NCBI网站程序Primer- BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)设计dCAPS标记和PCR扩增用引物(表2), 引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。
表2
Table 2
表2(Table 2)
表2 本研究所用的PCR引物序列 Table 2 PCR primer sequences used in this study
引物名称
Primer name
正向引物
Forward primer (5-3′ )
反向引物
Reverse primer (5-3′ )
目的片段长度
Expected size
(bp)
内切酶
Endonuclease
Pi35TCCATGGCGGAGGTGGTGTTGGCTGAGAGCAAATCTTGGGGTGTCTGCAA4041
Pi35-dCAPSGCCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATACGGGTGTCTGCAAAACAAAGGAAACGTGAAG272Tai I
Pi35-CCCTTCATCCCTCAACGTTTTTGTCTCCAAGATCGGTATGGAACACTCCAATCCAACTTGT7796
Pi35-RTCATCTCTACCAGATCTGCCGTCGACAAACACTTGTACAGTAGCAT605
OsActinTCCATCTTGGCATCTCTCAGGGTACCCTCATCAGGCATCT338

表2 本研究所用的PCR引物序列 Table 2 PCR primer sequences used in this study

1.5 RNA提取和RT-PCR方法利用ZR Plant RNA MiniPrep Kit (ZYMO, USA)提取水稻幼苗总RNA, 用DNase I (TaKaRa, 大连)消化基因组DNA 30 min。取5 μ g总RNA合成第1链cDNA (TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒, TransGen Biotech, 北京)。采用RT-PCR方法检测基因的表达情况, PCR体系含10 μ L 2× PCR buffer for KOD FX, 4 μ L dNTP (2 mmol L-1 each), 1 μ L Primers (10 μ mol L-1, F+R), 0.4 μ L KOD FX (1 U μ L -1, TOYOBO), 1 μ L反转录产物, 3.6 μ L ddH2O; 反应程序为94℃ 2 min; 98℃ 10 s, 57℃ 15 s, 68℃ 45 s, 28~33个循环; 68℃ 5 min, 4℃保存; 用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外光下照相。

2 结果与分析2.1 品种藤系138中Pi35基因的确认 Pi35基因克隆自日本品种北海188[7]。藤系138是北海188的衍生品种(图1), 它继承了北海188的高水平部分抗性(图2)。之前的研究认为, 藤系138的抗性由一个主效基因控制, 可能为Pi35基因, 但缺乏更进一步的证据[6, 23]。为确认藤系138携带的就是Pi35基因, 我们利用引物Pi35-F/R (表2)对藤系138的基因组DNA进行PCR扩增、测序、拼接和序列比对, 发现扩增出的DNA序列及氨基酸与数据库中公布的Pi35的序列完全一致(图3)。综合前人[6, 23]及本研究的结果, 我们确信藤系138携带部分抗性基因Pi35, 并将其命名为Pi35-Fukei138
图1
Fig. 1
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图1 藤系138及其衍生品种系谱图Fig. 1 Pedigree of the rice cultivar Fukei 138 and its derived cultivars

图2
Fig. 2
Figure OptionViewDownloadNew Window
图2 藤系138、日本晴和LTH对2个稻瘟病鉴别菌株的反应型Fig. 2 Phenotypes of Fukei 138, Nipponbare, and LTH to two Magnaporthe oryzae isolates


2.2 Pi35/Pish位点基因序列比对分析Pi35Pish的等位变异基因[7], 在日本晴中Pish/Pi35基因簇包含4个串联的NBS-LRR基因Os01g0781100Os01g0781200Os01g0781700Pish[29]。为了设计和开发特异性鉴定Pi35基因的功能性标记, 我们首先从数据库中获得日本晴中上述4个基因的编码区DNA序列, 经序列比对发现第一个基因Os01g0781100与后面3个基因相似性较低(氨基酸序列一致性分别为65.7%、65.6%和65.5%), 存在着较多的碱基差异, 因此, 未将该基因用于后续序列比较。利用引物Pi35-F/R对普感品种LTH[25, 29, 31]的基因编码区进行扩增, 所得产物被命名为pi35-LTH (图3)。利用ClustalW软件对5个基因(Pi35pi35-LTHPishOs01g0781200Os01g0781700)编码的蛋白质序列分析发现, Pi35与pi35-LTH之间仅在LRR区(位置589-1289)存在一个氨基酸的差异(C1260W); Pi35与Pish以及Os01g0781200和Os01g0782100之间在该位置也存在差异, 第1260位的半胱氨酸为Pi35蛋白所特有(图3)。进一步利用引物Pi35-C-F/R对7796 bp (ATG前面2041 bp、3870 bp Pi35编码区和TGA下游1885 bp)目的基因组片段进行扩增、测序, 结果发现, 抗病品种藤系138和感病品种LTH在包括启动子的周边序列上没有其他差异。表达分析结果表明, 基因Pi35Pishpi35-LTH在各自的背景品种中均能正常表达(图4), 不存在其他影响基因表达量的因素。因此, 第1260位的氨基酸的差异是Pi35pi35-LTH基因抗、感病性差异的决定因素, 可以被用于开发特异性的功能性标记。
图3
Fig. 3
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图3 Pi35/Pish位点基因氨基酸序列比对箭头表示Pi35蛋白中第1260位特异的半胱氨酸。Fig. 3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of Pi35/Pishlocus Arrow indicates the 1260th specific cysteine of Pi35 protein.

图4
Fig. 4
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图4 3个等位基因pi35-LTHPishPi35的RT-PCR分析Fig. 4 RT-PCR analysis of three allelic genes of pi35-LTH, Pish, and Pi35


2.3 Pi35基因特异标记的开发与验证基于藤系138和LTH在该位点上的序列差异, 开发了一个特异性识别Pi35等位基因的标记Pi35-dCAPS (表2图5)。该标记在藤系138 (Pi35供体)、LTH和日本晴(Pish供体)中均能扩增出一条长度为272 bp的目标片段(图6-A), 藤系138的产物可以被Tai I酶切成241 bp和31 bp两段, 由于缺乏酶切位点, LTH和日本晴的产物均不能被切开, 在琼脂糖电泳胶上清楚地显示出Pi35的特异条带(图6-B)。
图5
Fig. 5
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图5 DNA序列多态性和标记Pi35-dCAPS引物的位置Fig. 5 DNA polymorphism and positions of primers for Pi35-dCAPS marker

图6
Fig. 6
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图6 Pi35-dCAPS标记在3个水稻品种中的多态性 Fig. 6 Genotypic analysis of Pi35-dCAPS marker in three rice cultivars


2.4 藤系138衍生品种的Pi35基因型鉴定 利用Pi35-dCAPS标记鉴定10份藤系138衍生的粳稻品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、垦稻12、垦稻16、绥粳3号、龙花00-835、龙粳10号、龙粳13和龙粳34) (http://www.ricedata.cn/ variety/, 图1)的Pi35基因型, 发现其中的5个(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34)可以被Pi35-dCAPS标记识别。进一步利用引物Pi35-F/R对这5份品种的Pi35等位基因编码区扩增、测序表明, 上述5个品种确实含有Pi35基因(图7)。上述结果证实, Pi35-dCAPS和Tai I组合可以特异地鉴定不同水稻品种中Pi35基因的存在。
图7
Fig. 7
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图7 Pi35-dCAPS标记对10份藤系138衍生品种检测的结果 Fig. 7 Genotypic analysis in ten Fukei 138-derived japonicacultivars with Pi35-dCAPS marker


2.5 Pi35基因在水稻微核心种质及主栽品种中的分布利用Pi35-dCAPS标记对204份水稻微核心种质及67份水稻主栽品种(附表)进行PCR检测, 所有供试材料均可特异地扩增出一条272 bp的目标片段, 经限制性内切酶Tai I酶切这些扩增产物, 仅有2份微核心种质材料(抚宁紫皮粳子和细麻线)的PCR片段可以被Tai I酶切而呈现与藤系138一致的带型(图8)。因此, 推断在供试的271份材料中只有1份粳稻材料抚宁紫皮粳子和1份籼稻材料细麻线携带Pi35基因(见附表)。进一步利用引物Pi35-F/R对这2份品种的Pi35等位基因编码区进行扩增, 经测序、拼接和比对发现这2份品种的基因编码区序列与Pi35基因完全一致, 证明这2份品种确实携带Pi35基因。
图8
Fig. 8
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图8 Pi35-dCAPS标记在部分水稻种质资源中检测的结果 Fig. 8 Genotypic analysis in partial rice accessions with Pi35-dCAPS marker


3 讨论与完全抗性基因相比, 部分抗性基因通常无明 显的小种专化性, 其抗性表现广谱而持久, 因此, 利用部分抗性基因被视为最有希望能持续控制稻瘟病的措施[4, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36]。目前已报道的300多个稻瘟病抗性QTL中, 绝大部分在染色体上的定位区间较大, 缺乏紧密连锁的分子标记[37], 尽管已有4个部分抗性基因(pi21Pb1Pi63Pi35)被克隆, 但迄今尚未见其功能性标记开发的报道。这在很大程度上限制了这些QTL或基因在水稻抗稻瘟病育种中的广泛应用。有针对性地选择一些重要的主效QTL或部分抗性基因, 开发与其紧密连锁的分子标记, 尤其是基因位点特异性标记和基因功能性标记, 对于精准鉴定水稻品种的部分抗性基因型, 以及通过基因聚合手段培育持久抗病品种具有重要意义。
部分抗性基因Pi35源自日本品种北海188, 该品种自1961年育成至今一直保持着稳定的高水平叶瘟抗性[6, 7, 23]。由于缺乏北海188的种子, 我们通过对北海188衍生品种藤系138中Pi35等位基因进行基因组全长测序, 确认了藤系138携带Pi35基因。通过分析高度感病的水稻品种LTH的Pi35等位基因pi35-LTH的DNA和蛋白质序列, 发现Pi35与pi35-LTH之间仅在LRR端存在一个氨基酸的差异(C1260W), 且第1260位的半胱氨酸为Pi35蛋白所特有(图2)。Fukuoka等[7]指出, Pi35基因LRR端的多个功能性多态位点(1053D、1056S、1073P和1083W)的累积强化了该基因的抗性, 且第1053位的天冬氨酸残基与该基因介导的数量抗性最相关。在基因组全长测序和基因表达分析的基础上, 我们通过多次重复测序验证了pi35-LTHPi35序列在这些位点上并无序列差异(图3), 我们认为Fukuoka等[7]关于“ 单个抗性基因中多个功能性多态性位点提高稻瘟病持久抗性” 的观点值得商榷, 推断第1260位的半胱氨酸是Pi35蛋白一个功能氨基酸。
基于Pi35pi35-LTH基因DNA序列本身的一个差异位点T3780G, 我们开发了一个可特异鉴定Pi35基因的功能性分子标记Pi35-dCAPS, 利用此标记从281份水稻材料(10份藤系138衍生品种、204份微核心种质和67份主栽品种)中鉴定出7份含有Pi35基因的材料, 其中5份为藤系138衍生品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34), 2份为微核心种质(抚宁紫皮粳子, 细麻线)。这一结果说明, Pi35基因在藤系138衍生品种以外的国内水稻种质中分布频率很低, 而在籼稻品种细麻线中鉴定到Pi35则为利用该基因改良籼稻品种的稻瘟病部分抗性提供了便利。
4 结论证实了水稻品种藤系138携带部分抗性基因Pi35, 鉴定出一个特异存在于Pi35基因编码区的碱基位点3780T, 开发了一个可特异鉴定Pi35基因的功能性分子标记Pi35-dCAPS。利用该标记从281份国内水稻种质资源中鉴定出7份携带Pi35基因的种质, 证实Pi35基因在除藤系138衍生品种以外的国内水稻种质中分布频率很低, 而籼稻种质细麻线携带Pi35基因则为利用该基因改良籼稻品种的稻瘟病部分抗性提供了便利。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.


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被引期刊影响因子

[1]Ou S H. Blast. In: Rice Diseases, 2nd edn. The Cambrian News Ltd, UK. 1985. pp 109-201[本文引用:3]
[2]雷财林, 凌忠专, 王久林. 水稻抗病育种研究进展. 生物学通报, 2004, 39: 4-7
Lei C L, Ling Z Z, Wang J L. Research advances in rice breeding for disease resistance. Bull Biol, 2004, 39: 4-7 (in Chinese)[本文引用:1]
[3]Ezuka A. Field resistance of rice varieties to rice blast disease. Rev Plant Prot Res, 1972, 5: 1-21[本文引用:1]
[4]Kiyosawa A S. Genetic and epidemiological modeling of breakdown of plant disease resistance. Annu Rev Phytopathol, 1982, 20: 93-117[本文引用:4]
[5]Mackill D J, Bonman J M. Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice. Phytopathol, 1992, 82: 746-749[本文引用:2]
[6]Nguyen T T T, Koizumi S, La T N, Zenbayashi K S, Ashizawa T, Yasuda N, Imazaki I, Miyasaka A. Pi35(t), a new gene conferring partial resistance to leaf blast in the rice cultivar Hokkai 188. Theor Appl Genet, 2006, 113: 697-704[本文引用:7]
[7]Fukuoka S, Yamamoto S, Mizobuchi R, Yamanouchi U, Ono K, Kitazawa N, Yasuda N, Fujita Y, Nguyen T T T, Koizumi S, Sugimoto K, Matsumoto T, Yano M. Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast. Sci Rep, 2014, 4: 4550[本文引用:11]
[8]Young N D. QTL mapping and quantitative disease resistance in plants. Annu Rev Phytopathol, 1996, 34: 479-501[本文引用:1]
[9]Fukuoka S, Saka N, Koga H, Ono K, Shimizu T, Ebana K, Hayashi N, Takahashi A, Hirochika H, Okuno K, Yano M. Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice. Science, 2009, 325: 998-1001[本文引用:1]
[10]Hayashi N, Inoue H, Kato T, Funao T, Shirota M, Shimizu T, Kanamori H, Yamane H, Hayano-Saito Y, Matsumoto T, Yano M, Takatsuji H. Durable panicle blast-resistance gene Pb1 encodes an atypical CC-NBS-LRR protein and was generated by acquiring a promoter through local genome duplication. Plant J, 2010, 64: 498-510[本文引用:1]
[11]Ma J, Jia M H, Jia Y L. Characterization of rice blast resistance gene Pi61(t) in rice germplasm. Plant Dis, 2014, 98: 1200-1204[本文引用:1]
[12]Xu X, Hayashi N, Wang C T, Fukuota S, Kawasaki S, Takatsuji H, Jiang C J. Rice blast resistance gene Pikahei-1(t), a member of a resistance gene cluster on chromosome 4, encodes a nucleotide- binding site and leucine-rich repeat protein. Mol Breed, 2014, 34: 691-700[本文引用:1]
[13]刘洋, 徐培洲, 张红宇, 徐建第, 吴发强, 吴先军. 水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用. 中国农业科学, 2008, 41: 9-14
Liu Y, Xu P Z, Zhang H Y, Xu J D, Wu F Q, Wu X J. Marker-assisted selection and application of blast resistant gene Pib in rice. Sci Agric Sin, 2008, 41: 9-14 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[14]Jia Y L, Wang Z H, Singh P. Development of dominant rice blast Pita resistance gene markers. Crop Sci, 2002, 46: 2145-2149[本文引用:1]
[15]Zhai C, Lin F, Dong Z Q, He X Y, Yuan B, Zeng X S, Wang L, Pan Q H. The isolation and characterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytol, 2011, 189: 321-334[本文引用:2]
[16]Yuan B, Zhai C, Wang W J, Zeng X S, Xu X K, Hu H Q, Lin F, Wang L, Pan Q H. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet, 2011, 122: 1017-1028[本文引用:1]
[17]Hua L X, Wu J Z, Chen C X, Wu W H, He X Y, Lin F, Wang L, Ashikawa I, Matsumoto T, Wang L, Pan Q H. The isolation of Pi1, an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast. Theor Appl Genet, 2012, 125: 1047-1055[本文引用:1]
[18]Hayashi K, Yasuda N, Fujita Y, Koizumi S, Yoshida H. Identification of the blast resistance gene Pit in rice cultivars using functional markers. Thero Appl Genet, 2010, 121: 1357-1367[本文引用:1]
[19]Yi G, Lee S K, Hong Y K, Cho Y C, Nam M H, Kim S C, Han S S, Wang G L, Hahn T R, Ronald P C, Jeon J S. Use of Pi5(t) markers in marker-assisted selection to screen for cultivars with resistance to Magnaporthe grisea. Theor Appl Genet, 2004, 109: 978-985[本文引用:1]
[20]Wang H M, Chen J, Shi Y F, Pan G, Shen H C, Wu J L. Development and validation of CAPS markers for marker-assisted selection of rice blast resistance gene Pi25. Acta Agron Sin, 2012, 38: 1960-1968[本文引用:1]
[21]Ramkumar G, Srinivasarao K, Madhan Mohan K, Sudarshan I, Sivaranjani A K P, Gopalakrishna K, Neeraja C N, Balachand ran S M, Sundaram R M, Prasad M S, Shobha Rani N, Rama Prasad A M, Viraktamath B C, Madhav M S. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54 (Pikh). Mol Breed, 2011, 27: 129-135[本文引用:1]
[22]Ma J, Lei C L, Xu X T, Hao K, Wang J L, Cheng Z J, Ma X D, Ma J, Zhou K N, Zhang X, Guo X P, Wu F Q, Lin Q B, Wang C M, Zhai H Q, Wang H Y, Wan J M. Pi64, encoding a novel CC-NBS-LRR protein, confers resistance to leaf and neck blast in rice. Mol Plant-Microbe Interact, 2015, 28: 558-568[本文引用:1]
[23]Mikami T, Kawamura Y, Horisue N. Estimation of resistant genes and field resistance to leaf blast of a rice cultivar ‘Fukei 138’. Rep Tohoku Br, Crop Sci Soc Japan, 1990, 33: 87-88 (in Japanese)[本文引用:5]
[24]孙淑红. 日本优异种质资源藤系138的利用和评价. 黑龙江农业科学, 2011, (5): 4-6
Sun S H. Evaluation and utilization of Japanese excellent germplasm resources Tengxi 138. Heilongjiang Agric Sci, 2011, (5): 4-6 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[25]Ling Z Z, Mew T V, Wang J L, Lei C L, Hang N. Development of Chinese near-isogenic lines of rice and their differentiating ability of pathogenic races of blast fungus. Chin Agric Sci, 2001, 1: 50-56[本文引用:2]
[26]Yoshida S, Forno D A, Cock J H. Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice, 2nd edn. Philippines: The International Rice Research Institute, 1971. pp 57-63
雷财林, 张国民, 程治军, 马军滔, 王久林, 辛爱华, 陈平, 肖家雷, 张欣, 刘迎雪, 郭秀平, 王洁, 翟虎渠, 万建民. 黑龙江省稻瘟病菌生理小种毒力基因分析与抗病育种策略. 作物学报, 2011, 37: 18-27[本文引用:1]
[27]Lei C L, Zhang G M, Cheng Z J, Ma J T, Wang J L, Xin A H, Chen P, Xiao J L, Zhang X, Liu Y X, Guo X P, Wang J, Zhai H Q, Wan J M. Pathogenic races and virulence gene structure of Magnaporthe oryzae population and rice breeding strategy for blast resistance in Heilongjiang province. Acta Agron Sin, 2011, 37: 18-27(in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[28]Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acid Res, 1980, 8: 4321-4325[本文引用:1]
[29]Takahashi A, Hayashi N, Miyao A, Hirochika H. Unique features of the rice blast resistance Pish locus revealed by large scale retrotransposon-tagging. BMC Plant Biol, 2010, 10: 175[本文引用:2]
[30]Kobayashi N, Telebanco-Yanoria M J, Tsunematsu H, Kato H, Imbe T, Fukuta Y. Development of new sets of international stand ard differential varieties for blast resistance in rice (Oryza sativa L. ). Jpn Agric Res Q, 2007, 41: 31-37[本文引用:1]
[31]Lei C L, Hao K, Yang Y L, Ma J, Wang S, Wang J L, Cheng Z J, Zhao S S, Zhang X, Guo X P, Wang C M, Wan J M. Identification and fine mapping of two blast resistance genes in rice cultivar 93-11. Crop J, 2013, 1: 2-14[本文引用:1]
[32]Okutsu Y, Koga M, Ishihara M, Suga R. Inheritance of blast-resistance of upland rice varieties. Part 4. Improvement of blast resistance by combining of polygenes responsible for blast field resistance. Bull Ibaraki Agric Exp Stn, 1984, 24: 17-24[本文引用:1]
[33]杨一龙, 程治军, 李伟, 马建, 马进, 王久林, 雷财林. 水稻稻瘟病部分抗性基因的定位与克隆研究进展. 作物杂志, 2010, (6): 10-14
Yang Y L, Cheng Z J, Li W, Ma J, Ma J, Wang J L, Lei C L. Advances in molecular mapping and cloning of partial blast resistance genes in rice. Crops, 2010, (6): 10-14 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[34]Fukuoka S, Norikuni S, Mizukami Y, Koga H, Yamanouchi U, Yoshioda Y, Hayashi N, Ebana K, Mizobuchi R, Yano M. Gene pyramiding enhances durable blast disease resistance in rice. Sci Rep, 2015, 5: 7773[本文引用:1]
[35]Ashkani S, Rafii M Y, Rahim H A, Latif M A. Mapping of the quantitative trait locus (QTL) conferring partial resistance to rice leaf blast disease. Biotechnol Lett, 2013, 35: 799-810[本文引用:1]
[36]Mizobuchi R, Sato H, Fukuoka S, Yamamoto S, Kawasaki-tanaka A, Fukuta Y. Mapping of a QTL for field resistance to blast (Pyricularia oryzae Cavara) in ingngoppor-tinawon, a rice (Oryza sativa L. ) land race from the Philippines. Jpn Agric Res Q, 2014, 4: 425-431[本文引用:1]
[37]Ballini E, Morel J B, Droc G, Price A, Courtois B, Notteghem J L, Tharreaul D. A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance. Mol Plant-Microbe Interact, 2008, 21: 859-868[本文引用:1]
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