目的基因的克隆，这一过程即为筛选（screening）或选择（Selection）。根据载体体系、宿

主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法和非直接选择法。

    1．直接选择法    针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，

称为直接选择法（direct selection），其特点是直接测定基因或基因表型。

    （l）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，如ampr、 tetr或

kanr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形

成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标 

志基因内，标志基因失活，通过有、无抗生素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重

组载体（含外源基因）的转化菌落。当然，无论将外源基因插入何处，抗药标志选择仅是

初步、粗略的选择，尚需进一步确定重组体是否含有目的基因。

    （2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷

互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救（maker rescue）。酵母

咪唑甘油磷酸脱水酶基因表达产物与细菌组氨酸合成有关。当酵母DNA与人噬菌体载

体结合后，再将重组子转染或感染组氨酸缺陷型大肠杆菌，在无组氨酸的培养基中培

养。因为只有带咪唑甘油磷酸脱水酶重组基因的菌株才能在无组氨酸的培养基中生长，

所以这样获得的生长菌即含有咪唑甘油磷酸脱水酶基因。

    利用a互补筛选携带重组质粒的细菌也是一种标志补救选择方法。关于a互补原理

在本章第一节已有介绍，这里以质粒pUC 18作载体为例，以图15－9概括说明将外源基

因插入载体LacZ基因N端序列时是如何进行筛选的。

    （3）分子杂交法：这是利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA

或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。图15－10所示方法称原位杂交（in situ hybridization），图 15－11所示方法为 Southern印迹（Southern blotting）技术。在分子生物学技术中，还有一种原位杂交技术是用于检测某一基因在组织内的定位表达，

这与分子克隆筛选的原位杂交是两个不同的概念或技术，应注意区分。

    2．免疫学方法   这类方法不是直接鉴定基因，而是利用特异抗体与目的基因表达产

物相互作用进行筛选，因此属非直接选择法。免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适

用于选择不为宿主菌提供任何选择标志的基因。免疫学方法又可根据具体基因选择操作

过程不同，分为免疫化学方法及酶免检测分析（enzy immunodetection  assay）等。免疫化

学方法的基本工作原理是：将琼脂培养板上的转化子菌落经氯仿蒸气裂解、释放抗原，再将固定有抗血清（目的基因编码蛋白质特异的免疫血清）的聚乙烯薄膜覆盖在裂解菌落上，在薄膜上得到抗原抗体复合物。再使125I一I-IgG与薄膜反应，125I一I-IgG即可结合于抗原

不同位点。最后经放射自显影检出阳性反应菌落。

    （六）克隆基因的表达

    通过上述过程可分离、获得特异序列的基因组DNA或cDNA克隆，即基因克隆，

这是进行重组DNA技术操作的基本目的之一。此外，采用重组DNA技术还可进行目的

基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的。克隆基因在受体细胞表达或大量生产有用的蛋白质是基于正确的基因转录、mRNA翻译及适当的转录后、翻译后加工过程。这些过程的进行在不同的表达体系是不～样的，这些差别不但与基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有关。如今，如何使克隆的目的基因能正确而大量表达有特殊意义的蛋白质已成为重组DNA技术中一个专门的领域，这就是蛋白质表达（protein expression）。在蛋白质表达领域，表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略。下面仅就原核、真核表达体系作简要概述。

    1．原校表达体系    E．coli是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法简

单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺，再加上人们运用E．coli表达外源基因已经

有力多年的经验。运用E．coli表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志；②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子，

如lac、tac启动子或其他启动子序列；③含适当的翻译控制序列，如核蛋白体结合位点

（ribosome－binding site）和翻译起始点等；＠含有合理设计的多接头克隆位点（polylinker

cloning sites），以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接。将目的基因插入适当表达

载体后，经过转化、筛选获得正确的转化子细菌即可直接用于蛋白质的表达，这是一般

方法。在实际工作中，个别具体过程差异很大，表达策略颇不一致。有时表达目的是为

获得蛋白质抗原，以便制备抗体，此时要求表达的蛋白质或多肽片段具有抗原性，同时

要求表达产物易于分离、纯化。较好的策略是在目的基因前连上一个为特殊多肽编码的

附加序列，表达融合蛋白。在这种情况下表达的蛋白质多为不溶性的包涵体（inclusion

body），极易与菌体蛋白分离。如果在设计融合基因时，在目的基因与附加序列之间加

入适当的裂解位点，则很容易从表达的杂合分子去除附加序列。巧妙的附加序列设计还

可大大方便先优产物的分离、纯化。如果表达的蛋白质是为用于生物化学，细胞生物学研究或临床应用，除分离、纯化方便，更重要的是考虑蛋白质的功能或生物学活性。此

时，表达可溶性蛋白质往往具有特异的生物学功能；如果表达的是包涵体形式，还需在

分离后进行复性或折叠。

    E．coli表达体系在实际应用中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，