所有限制性内切核酸酶切割DNA均产生含5’磷酸基和3’羟基基团的末端。其中有些酶，如EcoRI能使其识别序列相对两链之间的数个碱基对（base pairs。，bp）分开．形成5’末端突出的粘性末端（cohesive end或 sticky end）。还有一些酶产生具有 3’末端突出的粘性末端，如 Pst I：

而另一些酶切割 DNA后产生平头或钝性末端（blunt end），如 Hpa  l：

不同限制性内切核酸酶识别DNA中核苷酸序列长短不一，有的是六或八核苷酸序列。如果DNA序列是随机的，那么特异四核苷酸序列可能在每256 bp出现一次，六核苷酸序列出现的间隔是4 kb，八核苷酸序列出现的间隔是65kb。这种可能性随GC含量变化而变化。不同的酶切割DNA频率不同，切割DNA后产生粘性末端长短不一样，所产生末端的性质也不同，这对重组DNA或有关分子生物学操作及应用影响很大。

    有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端，称配伍末端（compatible end），可进行相互连接；产生平端的酶切割 DNA后，也可彼此连接。

现列举某些限制性内切核酸酶如表15－2。

（三）目的基因

  应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质、这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因又称目的DNA（target DNA). 目的 DNA有两种类型。即由cDNA和基因组DNA。cDNA（complementary  DNA）是指经反转录合成的、与 RNA（通常指mRNA或病毒 RNA）互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA（genomic

DNA）是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。进

行DNA克隆时，所构建的嵌合DNA分子是由载体DNA与某一来源的CDNA或基因DNA连接而成。cDNA或基因组DNA即含有我们感兴趣的基因或DNA序列——目的基因，又称外源DNA。

    （四）基因载体

    基因载体或称克隆载体（cloning vector），这是为“携带”感兴趣的外源 DNA、实现

外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特意设计的克隆载体又称表达载体（expression vector）。可充当克隆载体的  DNA分子有质粒  DNA、噬菌体  DNA和病毒  DNA，它

们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。

    所谓质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子，小的 2一3

kb，大的可达数百kb。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质料DNA的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。

pBR322质粒（图15－7）是稍早构建的质粒载体，其DNA分子中含有单个EcoRI限制了

内切核酸酶位点，可在此插入外源基因。此外还含有terr和ampr抗药基因，分别为抗四环素、抗氨苄青霉素的酶编码，使细菌产生抗性。这个质粒还含有一个复制起始点（Ori）及与DNA复制调节有关的序列，赋予pBR322质粒复制子特性。

    常用作克隆载体的噬菌体DNA有人噬菌体和M13噬菌体。稍早经λ噬菌体DNA改

造成的载体系统有λ噬菌体系列（插入型载体，适用于DNA克隆）和EMBL系列（置换型载体，适用于基因组DNA克隆）。经改造的M13载体有M13mp系列及pUC系列（图15－7）。它们是在M13基因间隔区插入E．coli的一段调节基因及偷lacZ的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物即为β半乳糖苷酶的a片段。突变型Lac－E．coli可表达该酶彻片段（酶的C端）。单独存在的a及ω片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两个片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物，这就是所谓的 a互补（alpha complementation）。由 M13改造的载体含不同

位置的克隆位点，可接受不同限制性内切酶的酶切片段。如果插入的外源基因是在Lac Z基因内，则会干扰Lac Z的表达，利用Lac－ E．coli为转染或感染细胞，在含X一gal的培养基上生长时会出现白色菌落；如果在Lac Z基因内无外源基因插入，则有Lac Z表达，转

化菌在同样条件下呈蓝色菌落（图15－9）。再结合插入片段的序列测定可筛选、鉴定组体与非重组体载体。

    为增加克隆载体插入外源基因的容量，还设计有柯斯质粒载体（cosmid vector）和酵母人工染色体载体（ yeast  artificial  chromosome  vector，     YAC）。为适应真核细胞重组DNA 技术需要，特别是为满足真核基因表达或基因治疗的需要，发展了一些用动物病毒则改造的载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体等。

                    二、重组DNA技术基本原理

    一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目

的基因与载体的拼接，重组DNA分子导人受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受

体细胞（转化子）。图15－8是以质粒为载体进行DNA克隆的模式图。

    （－）目的基因的获取

    目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。

    1．化学会成法  如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出为该多肽链编码的核耷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学会成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及扰素基因等。