2．基因组DNA  分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性内切核酸酶（如Sau 3A I 或Mbo I）将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内。由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库（genomic DNA  library）。基因组 DNA文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。与一般图书馆不同的是，基因组DNA文库没有图书目录，建立基因文库后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无性繁殖系——克隆。

    3．cDNA    以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（complementary

DNA，cDNA），再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA）

文库（cDNA library）。与上述基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含

了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。然后，采用适当

方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是

这样分离的。

    4．聚合酶链反应目前，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）获取目

的DNA十分广泛。实际上，PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门持术（见第二十二章）。   

（二）克隆载体的选择和构建

    外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连到复制子上，外源

DNA则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体（见本章第

一节）。重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术性的专门工作，目的不

同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

    （三）外源基因与载体的连接

    通过不同途径获取含目的基因的外源DNA、选择或改建适当的克隆载体后，下一

步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。与自然界发生

的基因重组（见本章第一节）不同，这种人工DNA重组是靠 DNA连接酶将外源 DNA与载体共价连接的。改建载体、着手进行外源基因与载体连接前，必须结合研究目的及感兴

趣基因的特性，认真设计最终构建的重组体分子。应该说，这是～件技术性极强的工

作，除技巧问题，还涉及对重组DNA技术领域深刻的认识。这里仅就连接方式作扼要

介绍。

    1．粘性末端连接有以下方式：

    （1）同一限制酶切割位点连接：由同一限制性内切核酸酶切割的不同DNA片段具

有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突变（5’突出及3’突出）的粘性末端，

如：

同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火

（anneal）时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结

合的重组DNA分子。

    （2）不同限制性内切酶位点连接：由两种不同的限制性内切核酸酶切割的DNA片

段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末端，也可以进行粘性末端连接。例如Mbol（▼GATC

）和  BamHI（ G▼ GATCC）切割  DNA后均可产生 5’突出的  GATC粘性末端，彼此可相互连接。

    2．平端连接   DNA连接酶可催化相同和不同限制性内切核酸酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单键突出处被补齐或削平，变为平端，也可施行平端连接。

    3．同聚物加尾连接  同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶（terminal transferase）作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，属于粘性末端连接的一种特殊形式。

    4．人工接头连接  对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头（linker）或适当分子连到平末端，使产生新的限制性内切核酸酶位点，再用识别新位点的限制性内切核酸酶切除接头的远端，产生粘性末端。这也是粘性末端连接的一种特殊形式。

     （四）重组DNA导人受体菌

    外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA）后，需将

其导人受体菌。随受体菌生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆。进行无性繁殖时所采用的受体菌多为从大肠杆菌K－12改造的安全宿主菌，在人的肠道几无存活率或存活率极低。除安全标准，所采用的宿主菌应为限制酶和重组酶缺陷型。在选择适当的受体菌后，经特殊方法处理，使之成感受态细胞（competent cell），即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化（transformation）、转染（transfection）和感染（infection）等不同方式。

    （五）重组体的筛选

    通过转化、转染或感染，重组体DNA分子被导人受体细胞，经适当涂布的培养基

培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一段外源基因，而转

化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，所以设法将众多的转化菌落或菌斑

区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，即可得到