E．col表达体系只能表达克隆的cDNA，不直表达真核基因组DNA；②由于缺乏适当的

翻译后加工机制，     E.col表达体系表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化

修饰；③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；④很难在E．col表达体系表达大量的可溶性蛋白。

    2．真核表达体系    与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动

物细胞表达体系显示了较大优越性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达克隆的CDNA，

而且还可表达真核基因组DNA；哺乳类细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。当然，操作技术难、费时、不经济是哺乳类动物细胞表达体系的缺点。如何将克隆的重组DNA分子导人真核细胞是关键步骤。将表达载体导入真核细胞的过程称转染（transfection），它比转染E．col的方法要难得多。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染（ calcium  phosphate transfection  ）。DEAE葡聚糖介导转染（DEAE dextran－mediated transfection）、电穿孔（electroporatio）、脂质体转染（lipofectin transfection）及显微注射（microinjetion）等。转染方法的选择项根据细胞的种类、特性及表达载体性质而定。例如，采用爪赠卵母细胞（oocyte）作表达体系时，卵母细胞极大，适合采用显微注射法导入外源基因。一般说，大多数细胞均可采用磷酸钙转染和 DEAE葡聚糖介导转染方法进行瞬时转染（transient transfection），操作条件简单，不需特殊设备；而且通过这两种方法与电穿孔技术一样均会使小部分外源基因整合进细胞染色体，实现稳定转染（Stable transfection）入稳定转绕转化子细胞的筛选依赖特异的抗性标志。如果在重组的哺乳类细胞表达载体中含有可供筛选的遗传标志是细菌的

neor基因，neor基因编码的新霉素磷酸转移酶可使细胞培养液中的G418（Geneticin）磷酸化而失活，稳定转染的细胞就会在含C418的培养液中存活并增殖。另一用于筛选稳定转染的哺乳类细胞的体系是二氢叶酸还原酶（DHFR）及DHFR缺陷细胞，如果表达载体含有dhfr基因，稳定转染的DHFR缺陷细胞就会在有氨甲蝶吟（MTX）的培养液中生存；非转染的缺陷细胞不能存活而被淘汰。当前采用最多的哺乳类细胞是COS细胞（猿猴肾细胞）和CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）。

                    三、重组DNA技术与医学的关系

    1990年，分子医学（molcular medicine）的诞生及其在近几年的发展正是重组 DNA技

术与医学实践相结合的结果。分子医学包含的领域及内容概括如下几个方面。

    （－）疾病基因的发现

    重组DNA技术的应用使分子遗传学家有可能根据基因定位，而不是它的功能来克

隆一个基因。根据克隆基因的定位和性质研究所提供的线索，可进一步确定克隆的基因

在分子遗传病中的作用。因此，一个疾病相关基因的发现不仅可导致新的遗传病的发

现，而且对遗传病的诊断和治疗都是极有价值的。设想，如果能对人类全部基因组进行制图或定位，并掌握其全部序列信息，人类则完全可能通过对候选基因的控制和改造，

从根本上治疗和防止遗传病的发生和流行。人类基因组工程（human genome project，

HGP）（见第二十二章）就是根据这一设想而提出的。

    通过发现基因及其性质研究认识疾病分子机制的两个典型例子是脆性X综合征及

Kallmann综合征。若干年来，已发现细胞内有含脆性位点（fragile site）的 DNA存在，并

鉴定了脆性X位点范围的DNA特殊标志。这部分DNA与常见的精神痴呆——脆性X综

合征（fragile X syndrome）发病有关，但对其确切分子机制并无深入认识。应用酵母人工

染色体（YAC）克隆及分子杂交技术现已证明，所谓脆性位点就是（CGG）n重复序列。这

种重复序列具有多态性（polymorphism），即在正常群体可有6－54个重复单位，但在受

累个体却高达数百（＞200个重复单位）。重复序列的扩增使（CGG）n所属相应基因

（FMR－l）不能转录相应的RNA，从而使受累个体表现脆性X综合征。K综合征系因促性

腺激素分泌不足而引起性腺发育不良、性腺功能低下，嗅觉功能减退或丧失。染色体步

移（chromosome  walking）方法证明K综合征患者KALIG-I基因有缺失突变。KALIG-I基因产物参与神经细胞的粘连和神经轴突的导向。KALIG-I蛋白与神经迁移和演变的关系说

明该基因缺失突变是K综合征的发病基础。

    （二）发展生物制药

    利用重组DNA技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大

产业。重组蛋白质药物生产是在功能研究、基因克隆基础上，构建适当的表达体系表达

有生物活性的蛋白质、多肽；再经过科学的动物实验、严格的临床试验和药物审查，发

展为新药物。目前已经或正投入市场的主要产品见表15-3：

（三）DNA诊断

DNA诊断又称基因诊断，目目前已发展成为一门独具特色的诊断学科——DNA诊断学（DNA diagnostics）。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。目前用于DNA诊断的方法很多，但其基本过程相似——首先分离、扩增待测的DNA片段，然后利用适当分析手段，区分或鉴定DNA的异常。按现代遗传病诊断标准，一种可靠的DNA诊断学方法必须符合：①能正确扩增靶基因；②能准确区分单个碱基的差别；③本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定；④便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查（详见第二十二章）。

    （四）基因治疗

    所谓基因治疗（gene therapy）就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正