, 易华山 西南大学 动物医学院，重庆 402460
收稿日期：2021-03-29；接收日期：2021-06-01；网络出版时间：2021-07-23
基金项目：重庆市基础研究与前沿探索专项项目基金(No. cstc2018jcyjAX0615)，中央高校基本科研业务专项基金(Nos. XDJK2018C060, XDJK2018C059)，国家重点研发计划(No. 2018YFD0501705) 资助
摘要：蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV) 作为由媒介昆虫库蠓传播的引起反刍动物蓝舌病(Bluetongue，BT) 的病原微生物，同时也是研究无囊膜病毒(Non-enveloped virus) 释放机制的经典模型。文中以BTV侵染细胞及组装为始，对BTV诱导细胞自噬并通过多囊泡体以细胞外囊泡形式释放、BTV诱导细胞凋亡而裂解释放、BTV从质膜出芽释放的不同途径以及BTV关键非结构蛋白NS3在调控BTV释放过程中作用机制的研究进展进行综述，为进一步了解BTV感染、增殖、释放的分子机制提供参考。
关键词：蓝舌病毒细胞外囊泡裂解性释放非裂解性释放NS3蛋白
Advances in the release mechanisms of bluetongue virus
Junhong Lin, Rang Wang, Yao Zhao, Yujuan Chen, Xianping Ma
, Huashan Yi College of Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460, China
Received: March 29, 2021; Accepted: June 1, 2021; Published: July 23, 2021
Supported by: Chongqing Basic Research and Frontier Exploration Special Project Foundation, China (No. cstc2018jcyjAX0615), Fundamental Research Funds for the Central Universities, China (Nos. XDJK2018C060, XDJK2018C059), National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFD0501705)
Corresponding author: Xianping Ma. Tel: +86-23-46751714; E-mail: xianpingma@163.com;
Huashan Yi. Tel: +86-23-46751714; E-mail: dyxyihuashan@swu.edu.cn.
Abstract: Bluetongue virus (BTV) causes Bluetongue (BT) of ruminants vectored by culicoides midges. It is also a classic model for studying the release mechanism of non-enveloped virus. This review begins with the infection and assembly of BTV, then summarizes the advances of different ways of releasing BTV. This includes BTV-induced autophagy and the release as extracellular vesicles via multivesicular bodies, BTV-induced apoptosis and the lytic release, as well as different pathways of release through budding via plasma membrane. The regulatory mechanisms of NS3 which is a key non-structural protein during the release of BTV are also discussed, providing a basis for further understanding the molecular mechanisms underpinning the infection, proliferation and release of BTV.
Keywords: bluetongue virusextracellular vesicleslytic releasenon-lytic releaseNS3 protein
蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV) 属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、环状病毒属(Orbivirus)，病毒粒子为核衣壳二十面体对称的圆形无囊膜颗粒，由10条分节段的双链RNA (Double-stranded RNA，dsRNA) 编码7种结构蛋白VP1–VP7和至少4种非结构蛋白NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4以及可能的NS5 (S10-ORF2)[1-2]。其中，VP2与VP5组成外衣壳，VP2锌指基序CCCH感知早期核内体(Endosome) pH后发生构象变化与细胞表面糖蛋白结合促进网格蛋白介导的病毒内吞作用，VP5锚定结构域中组氨酸残基感知晚期核内体低pH (–5.5) 获得膜融合性穿透宿主细胞膜而使病毒核心颗粒进入细胞质，但BTV-1通过一种与巨胞饮作用相似的方式进入晚期核内体[3-5]。核心颗粒由VP3与VP7组成的内衣壳包含VP1 (RNA依赖的RNA聚合酶)、VP4 (加帽酶)、VP6 (RNA解旋酶) 及10条分节段dsRNA[6]。非结构蛋白NS1促进病毒蛋白质合成及聚合后在感染细胞内形成小管(Tubular)；NS2招募单链RNA (Single-stranded RNA，ssRNA) 转录本、VP1、VP4、VP6以及内衣壳；NS3作为BTV唯一具有膜结构域的非结构蛋白调控病毒成熟、转运和释放；NS4拮抗细胞内干扰素的产生[7-10]。目前，BTV作为由媒介昆虫传播的世界范围流行的病原微生物，同时也是无囊膜病毒研究的模型[11]。因此，笔者以近年来BTV侵染、病毒颗粒的组装，成熟BTV颗粒通过细胞外囊泡释放、裂解性释放、出芽释放的不同方式及非结构蛋白NS3调控病毒释放机制的研究进展进行综述，为深入研究BTV致病机制及相关的防控措施提供参考。
1 BTV感染与组装1.1 BTV对细胞的感染性BTV通过媒介昆虫库蠓叮咬传播，感染引起反刍动物蓝舌病(Bluetongue，BT)，患病动物(包括牛、鹿、骆驼、绵羊等，绵羊病症最为典型) 出现舌部发绀、口唇充血肿胀等症状及病毒血症，并产生多种细胞因子，但对主要传播虫媒库蠓并不致病[12]。BTV体外感染不同的哺乳动物(仓鼠、绵羊等) 细胞均引起严重的细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，但在库蠓衍生细胞系KC细胞中以高滴度复制但不引起CPE的方式形成长期的非致命感染(Non-lethal infection)，且KC细胞感染BTV后能产生具有抗病毒作用的21 nt的病毒源小干扰RNA (Virus-derived small interfering RNAs，viRNAs)[13]。研究表明，用胰蛋白酶处理形成的感染性亚病毒颗粒(Infectious subviral particles，ISVPs) 和被库蠓唾液中蛋白酶降解而失去VP2的BTV颗粒在KC细胞与库蠓载体中均表现出高于成熟BTV颗粒的感染性，但NS3基因的敲除可显著降低感染性[14]。研究还表明，自然生活的库蠓幼虫中编码VP7片段的检出率为VP2的两倍，且内衣壳VP7的RGD基序可以结合在KC细胞的表面以促进BTV入胞[15-16]。上述证据说明BTV感染及释放机制在哺乳动物及与虫媒间存在较大差异，这种差异也见于同属成员非洲马瘟病毒，因此针对虫媒病毒感染及释放差异性的研究为从传播途径切断疾病的流行提供了新的思路[17]。
1.2 BTV组装BTV的10个RNA节段(0.8–3.95 kb) 可分为小、中、大3类，每个RNA节段均具有两端为高度保守六核苷酸序列的短5'和3'未翻译区(Untranslated regions，UTRs)，通过这些UTRs的招募，BTV和其他相关的病毒开始分类募集各自基因组ssRNA节段[18]。基因组的装配始于VP1以ssRNA为模板合成dsRNA[19]；VP6解旋dsRNA并分离转录本与模板RNA[20]；VP4在RNA三磷酸酶(Rtase)、鸟苷转移酶(Gtase)、鸟嘌呤-N7-甲基转移酶(N7Mtase) 以及核苷-2'-O-甲基转移酶(2'OMTase)的作用下在mRNA的5'端形成m7GpppGm的帽子结构[21]。感染细胞胞浆中病毒包涵体(Virus inclusion bodies，VIBs) 是呼肠孤病毒科家族成员的标志以及病毒装配的功能位点，由钙离子水平影响NS2的磷酸化水平而形成网格状骨架并募集病毒ssRNA、VP1、VP3、VP4、VP6与VP7[22-23]。VP5的募集也与VIBs相关，但VP2的募集发生在VIBs之外且VP2能与细胞骨架成分之一的波形蛋白中间丝(Vimentin intermediate filaments) 相互作用，说明外衣壳的组装不全在VIBs中完成[24-26]。VP1、VP4、VP6在五重轴(Five fold axis) 上与VP3组成不稳定的亚核心颗粒，由三聚体VP7沉积形成稳定的核心颗粒，新组装的核心颗粒在VIBs内获得VP5后，离开VIBs并获得VP2，失去转录活性，形成完整的病毒颗粒从感染细胞内释放[6, 25]。
2 BTV的释放细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs) 是细胞来源的具有膜结构的高异质性囊泡，作为细胞间的一种通讯机制参与炎症、肿瘤生成等生命过程，对BTV颗粒的电镜观察发现，BTV可以在EVs内聚集释放(图 1A–D)[27-28]。此外，囊膜病毒主要通过出芽(Budding) 等非裂解性(Non-lytic) 方式释放，而无囊膜病毒主要通过细胞凋亡等裂解性(Lytic) 方式释放，但更多研究表明无囊膜病毒如BK多瘤病毒、脊髓灰质炎病毒等也存在非裂解性释放的方式[29]。BTV作为典型无囊膜病毒，在侵染细胞并完成组装后，既能观察到通过细胞膜非裂解性出芽释放的病毒颗粒(图 1E–F)，也能观察到细胞裂解后释放的裸病毒颗粒(图 1G–H)[28]。研究表明，抑制BTV非裂解性释放时，病毒只能以较弱的毒性传播，说明裂解性释放可能不是BTV释放的主要方式[30-31]。
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| 图 1 BTV不同形式病毒颗粒的电镜观察[28, 32] Fig. 1 Electron microscopic observation of different forms of BTV particles[28, 32]. (A–C[28], D[32]) BTV particles release via EVS. (E[32], F[28]) BTV particles release via budding. (G[32], H[28]) lytic releases of BTV particles (black and yellow arrows indicate BTV particles and white arrows indicate lipid membrane); Scale bar: 100 nm (scale bars of D, E, H are modified for consistency). |
| 图选项 |
2.1 BTV诱导细胞自噬与EVs释放细胞自噬(Autophagy) 是细胞通过溶酶体选择性回收、更新胞内物质从而保持稳态的一种保护性机制，细胞以自噬作为其免疫防御机制清除入侵的病原微生物，但也被病原微生物利用以促进其自身增殖与复制，呼肠孤病毒科的轮状病毒与流行性出血症病毒均可诱发自噬[33-36]。研究表明，BTV抑制蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB)，活化钙离子相关的单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activate d protein kinase，AMPK)，下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR) 磷酸化水平启动细胞自噬，且BTV感染引起的能量代谢中断有助于细胞自噬，而抑制自噬能减缓NS3与VP2的积累从而抑制BTV的复制[37-39]。病毒粒子的整体传播(En bloc transmission) 指若干病毒粒子聚集于具有膜结构的封闭囊泡内释放与传播的形式，如小核糖核酸病毒的颗粒在内质网衍生的EVs中释放；甲型肝炎病毒以类外泌体的形式被宿主细胞源的膜覆盖而释放；呼肠孤病毒科成员轮状病毒在可能来自质膜的EVs中释放等，是病毒增强传染性和适应环境变化的方式[40-42]。对BTV感染细胞的上清液与BTV感染牛的血液中纯化EVs的电镜观察表明，在胞内与胞外的囊泡中均可观察到BTV颗粒的聚集，进一步的研究发现以EVs释放的BTV颗粒感染性高于以裂解释放的裸病毒颗粒，且抑制多囊泡体(Multivesicular bodies，MVBs) 和自噬溶酶体均能减少EVs的释放[32]。此外，BTV感染引起膜上自噬相关的溶酶体相关膜蛋白1 (Lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1) 表达以及溶酶体pH值升高[28]。研究表明，BTV还通过NS3与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4 (Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，NEDD4) 泛素连接酶作用参与MVBs形成且抑制这种相互作用可抑制病毒成熟与释放[43]。以上研究表明，BTV诱导自噬，通过MVBs进入溶酶体，随后被运送至细胞膜上以整体传播的EVs形式释放。
2.2 BTV诱导细胞凋亡与裂解性释放细胞凋亡是细胞主动、程序性清除衰老、损伤或有害细胞的自主死亡方式，细胞通过凋亡抵抗病毒侵染，也被某些病毒诱导以促进其裂解细胞释放，如呼肠孤病毒科的非洲马瘟病毒、轮状病毒等均可诱导细胞凋亡[44-45]。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Mitogen activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK) 通路调控细胞的凋亡，BTV感染激活MAPK通路，并通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)与p38调节线粒体中细胞色素C的释放与半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3) 的激活诱导细胞凋亡，进一步的研究表明，BTV是通过其非结构蛋白NS3与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf作用而激活MAPK通路及下游的ERK1/2和真核起始因子4E (Eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)，与BTV不同，同为环状病毒属的流行性出血症病毒、非洲马瘟病毒的NS3蛋白不具有该作用[46-47]。此外BTV感染还可诱导Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9与核因子κB (Nuclear factor kappa B，NF-κB) 表达，但NF-κB由NF-κB抑制物α (Inhibitor of NF-κB α，IκBα) 而非IκBβ控制，这种短暂而非持续的激活表明NF-κB在BTV感染引起的凋亡中不占据主导地位[48-49]。与哺乳动物细胞中仅表达BTV外衣壳就能诱发细胞凋亡不同，BTV感染库蠓并不引起凋亡，这种差异性使BTV更易在虫媒中传播而增加其感染哺乳动物的机会与能力[17, 48]。综上，BTV感染诱导的凋亡是引发BTV裂解性释放的主要形式。
2.3 BTV从质膜出芽释放内吞体分选转运复合体(Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT) 是存在于细胞胞浆中具有自噬、胞质分裂、核内体成熟、膜修复等功能的异多聚体蛋白[50]。人类免疫缺陷病毒等典型囊膜病毒在宿主细胞膜表面以出芽获得囊膜，形成成熟的病毒颗粒的过程通常由ESCRT介导，而无囊膜呼肠孤病毒科的轮状病毒以及BTV均能与ESCRT作用从而促进释放[19, 51-52]。研究发现，纯化的BTV裸病毒颗粒通过细胞膜的“挤压”(Extrusion)释放，而另一部分裸病毒颗粒被感染细胞内短暂存在的囊膜包围后在细胞膜处出芽释放[25, 32]。Hyatt等利用杆状病毒系统对BTV的出芽释放进行了研究，表达由BTV内外衣壳蛋白(VP2、VP5、VP3、VP7) 组成的病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs) 和仅由内衣壳蛋白(VP3、VP7) 组成的核样颗粒(Core-like particles，CLPs)，在NS3的参与下，VLPs与细胞骨架相作用以出芽形式释放，但CLPs无法进行该过程[53]。此外，用免疫胶体金标记的NS3蛋白定位于BTV病毒颗粒出芽部位的细胞膜上，与病毒释放过程中的细胞膜扰动(Membrane perturbation) 有关[30, 32]。上述证据表明，BTV能以出芽方式释放，且其内外衣壳之间的相互作用及NS3蛋白的调控均是BTV出芽必不可少的条件。
3 NS3调控BTV释放NS3由BTV基因组的第10节段编码，以糖基化和非糖基化两种形式存在，翻译后位于内质网腔内，通过内质网到达高尔基体，在反式高尔基体网络(Trans-Golgi network，TGN) 的分选下到达MVBs、溶酶体及细胞膜[54]。NS3可分为25.5 kDa的全长NS3和24 kDa的从N端第14位第2个起始密码子开始翻译的截短亚型NS3A，前13个氨基酸的缺失造成NS3A中膜联蛋白Ⅱ (Annexin Ⅱ) 与S100A10结合域的缺失。此外，NS3、NS3A中均存在卷曲螺旋基序(Coil-coil motif，CCM)、晚期结构域(Late domain，LD) 基序PPRY与PSAP、两个多碱基基序(Polybasic motifs，PBMs)、两个跨膜结构域(Transmembrane domain，TM)、糖基化位点(Glycosylation) 以及VP2结合域(图 2)，NS3通过上述的功能结构域利用宿主细胞不同成分调控BTV的释放[43]。NS3的氨基酸序列在不同血清型中均较为保守，与VP2同为BTV毒力的决定因素，毒力的减弱可能与NS3第24位脯氨酸的变化有关[26, 55-56]。
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| 图 2 NS3功能域模式图 Fig. 2 Structure of the functional domains of NS3. |
| 图选项 |
3.1 NS3的N端结构域作为依钙蛋白复合物(Calpactin complex) 组分之一的膜联蛋白Ⅱ (Annexin Ⅱ) 参与囊膜病毒如麻疹病毒和丙型肝炎病毒的成熟与释放[57-59]。NS3 N端的前13个氨基酸可以形成结合annexin Ⅱ的双亲分子螺旋(Amphipathic helix)，也能与依钙蛋白复合物的另一组分S100A10/p11作用，抑制NS3与annexin Ⅱ的作用能减少BTV的释放，而含有NS3A的突变体BTV在毒力减弱的同时甚至直接失去出胞能力而分散在细胞质中[9, 60]。此外，与轮状病毒NSP4的功能类似，在细菌中纯化表达的NS3可能通过其N端预测的CCM形成二聚体，具有诱导质膜通透的病毒孔蛋白(Viroporin) 活性，但NS3在真核细胞中的具体形式还有待进一步研究[61-63]。
3.2 NS3的LDs作为ESCRT-Ⅰ复合物组分之一的肿瘤易感基因101 (Tumor susceptibility gene 101，TSG101) 调节囊泡运输，参与MVBs的形成，与Annexin Ⅱ类似能被囊膜病毒如人类免疫缺陷病毒等募集以促进病毒释放[64-65]。研究表明，BTV的释放也与TSG101相关，小干扰RNA (Small interfering RNA，siRNA) 对TSG101的抑制减少了BTV的释放，进一步的研究发现BTV通过其NS3蛋白上的LD基序PSAP与TSG101结合，将成熟的BTV颗粒从细胞膜上“截断” (Pinch off)[66]。Celma等应用基于T7转录的BTV反向遗传系统对PSAP基序双突变体(由PSAP变为GAAP) 进行研究，发现该突变体使病毒粒子无法释放出胞而存在于细胞膜上，但并不影响dsRNA合成或蛋白表达等病毒复制行为，表明PSAP前两位氨基酸可能是该基序调控BTV释放而非复制的关键功能位点[67]。
研究表明，囊膜病毒如马尔堡病毒、埃博拉病毒等中鉴定的LD基序PPXY能与E6AP C端同源(Homologous to E6AP C-terminus，HECT) E3泛素连接酶NEDD4家族结合以促进病毒释放，在BTV中的LD基序同样具有该功能，但该基序第3位为精氨酸(即PPRY) 而非常见的脯氨酸，BTV中PPRY的缺失使病毒颗粒分布在囊泡外，影响BTV以EVs形式释放[43, 68-69]。
3.3 NS3的C端结构域及PBMsCelma等和Bhattacharya等对BTV NS3 C端构建的多位点突变体研究表明，NS3通过C端结构域与外衣壳VP2相作用并促进病毒的释放，但不影响病毒复制及蛋白表达等行为[67, 70]。PBMs介导蛋白质通过TGN转运，参与高尔基体与内质网间的信号转导，在病毒蛋白如爬行动物呼肠孤病毒融合相关小跨膜(Fusion-associated small transmembrane，FAST)蛋白P14和尼帕病毒融合蛋白(Fusion protein) 中作为膜融合与膜输出信号参与病毒的转运与释放[71-73]。Labadie等在BTV NS3的氨基酸序列中发现两个由赖氨酸、精氨酸、组氨酸组成的在环状病毒属病毒中保守的PBMs，其中PBM1决定NS3在内质网的集中分布，且PBM1的缺失使BTV核心颗粒只存在于VIBs附近，表明PBM1是一种内质网保留信号(ER retention signal)。另一基序PBM2的缺失使核心颗粒分散在细胞质中，降低了NS3从高尔基体转运至胞膜的效率和NS3的胞膜表达量，表明PBM2是一种膜输出信号(Membrane export signal)。此外，PBMs的缺失还影响BTV外衣壳VP2与VP5的组装，从而形成缺乏感染性的核心颗粒，也减少了病毒的释放，表明NS3的PBMs可促进BTV的成熟[30]。
3.4 NS3与脂筏的作用研究表明，除VP2外，NS3还能与存在于VIBs内的VP5相作用，VP5通过WHXL基序与在多种囊膜病毒的出芽释放中发挥重要作用的脂筏结构域(Lipid raft domain) 相联系，通过胆固醇提取对脂筏的破坏进一步证实了NS3-VP5-脂筏之间的作用，表明NS3可能通过VP5与脂筏相联系从而调控BTV的转运[25, 70]。此外，研究还发现BTV的NS3和VP5与在囊膜病毒如流感病毒和人类免疫缺陷病毒的出芽中发挥重要作用的调控因子磷脂酰肌醇(4, 5)二磷酸(Phosphatidylinositol (4, 5) bisphosphate，PI(4, 5)P2) 共定位，且PI(4, 5)P2的缺失影响了BTV的成熟与释放[74-76]。以上研究表明，BTV NS3通过外衣壳与脂筏产生联系，与具囊膜的流感病毒通过HA、NA、M1、M2等蛋白与脂筏作用的出芽存在相似性，为BTV非裂解性释放与脂筏间作用的研究提供了新的思路。
3.5 NS3拮抗宿主天然免疫研究表明，宿主天然免疫系统产生的干扰素能诱导骨髓基质细胞抗原2 (Bone marrow stromal cell antigen 2，BST2) 在脂筏富集，通过其N端的TM结构域与C端的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI) 锚定蛋白将病毒限制在胞膜表面从而抑制囊膜病毒如人类免疫缺陷病毒的释放，该作用同时可被人类免疫缺陷病毒附属病毒蛋白u (Viral protein u，Vpu) 所拮抗[77-78]。在无囊膜的BTV中，NS3与NS4通过靶向Janus酪氨酸激酶-信号转导子和转录活化子(Janus tyrosine kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT) 通路中STAT1的肉瘤(Sarcoma，Src) 基因同源结构域2 (Src homology domain 2，SH2) 结构域并抑制其磷酸化、二聚化及核内转位等拮抗宿主天然免疫应答[79]。笔者实验室对BTV NS4基因进行的克隆及序列特征分析发现其以亮氨酸拉链(Leucine zipper，LZ) 结构的二聚体形式存在。在此基础上，验证了NS4蛋白在HEK-293T细胞的细胞浆、细胞核内分布，且胞浆内主要沿细胞核膜分布的特征，还通过抑制干扰素通路上游的维甲酸诱导基因Ⅰ (Retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤相关分化基因5 (Melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)、干扰素调节因子9 (Interferon regulatory factor 9，IRF9) 等基因抑制下游干扰素β以及干扰素刺激基因(Interferon-stimulated gene，ISGs) 等的表达，初步探究了NS4拮抗宿主天然免疫应答的机制。有鉴于机体通过天然免疫系统抑制囊膜病毒释放、BTV类似囊膜病毒能以出芽释放、NS3与NS4协同拮抗宿主天然免疫、笔者实验室基于NS4基因拮抗宿主免疫应答而建立的ELISA抗体诊断方法等研究，探究NS4与NS3在BTV释放过程中的协同作用及作用的功能区域是本实验室即将开展的工作。
4 总结与展望综上，BTV作为一种重要的dsRNA虫媒病毒和无囊膜病毒研究的模型系统，通过EVs、凋亡裂解或出芽等不同方式释放。BTV非结构蛋白NS3通过内质网与VIBs相互作用，促进核心颗粒被VP2包裹，进而从VIBs运输至出胞位点以不同的方式释放(图 3)。NS3中发现的PPRY、PASP、PBMs等功能结构域在BTV成熟与释放中扮演着关键的调控作用。
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| 图 3 BTV释放模型 Fig. 3 Model of BTV releases. (A) After assembly in VIBs, BTV is shipped to MVBs by NS3 and secretes as EVs. (B) BTV releases by apoptosis and lysis. (C) BTV interacts with ESCRT and buds via plasma membrane. |
| 图选项 |
文中综述的BTV释放方式与许多经典囊膜病毒如人类免疫缺陷病毒等的释放方式相似，与其同科或同属的病毒之间也存在相同或相异之处。此外，还强调了BTV感染以及释放在虫媒以及宿主之间存在差异。然而，上述虫媒-宿主间差异性产生的具体机制、BTV诱导细胞凋亡与其特异性溶瘤功能的关系[80]、未知的NS3分子结构与NS3可能具有的病毒孔蛋白活性的关系、NS3-VP5-脂筏间的作用与病毒释放的关系等问题仍有待研究。其中，笔者认为探究NS3、NS4调控BTV的释放与其他的结构/非结构蛋白和宿主细胞间的联系具有重要意义，也是本课题组即将进行的工作。总之，上述问题的深入研究能更好地理解BTV感染、复制、释放及致病的分子机制，从而为BTV新型疫苗的研发提供新的思路，对BT防控具有重要意义。
参考文献
| [1] | Stewart M, Hardy A, Barry G, et al. Characterization of a second open reading frame in genome segment 10 of bluetongue virus. J Gen Virol, 2015, 96(11): 3280-3293. DOI:10.1099/jgv.0.000267 |
| [2] | Ratinier M, Caporale M, Golder M, et al. Identification and characterization of a novel non-structural protein of bluetongue virus. PLoS Pathog, 2011, 7(12): e1002477. DOI:10.1371/journal.ppat.1002477 |
| [3] | Wu WN, Celma CC, Kerviel A, et al. Mapping the pH sensors critical for host cell entry by a complex nonenveloped virus. J Virol, 2018, 93(4): e01897-18. |
| [4] | 易华山, 赵瑶, 马鲜平, 等. 蓝舌病毒结构与组装机制研究进展. 家畜生态学报, 2020, 41(7): 79-84. Yi HS, Zhao Y, Ma XP, et al. Advance in structure and assembly mechanism of bluetongue virus. J Domest Animal Ecol, 2020, 41(7): 79-84 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2020.07.015 |
| [5] | Gold S, Monaghan P, Mertens P, et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS ONE, 2010, 5(6): e11360. DOI:10.1371/journal.pone.0011360 |
| [6] | Lourenco S, Roy P. In vitro reconstitution of bluetongue virus infectious cores. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(33): 13746-13751. DOI:10.1073/pnas.1108667108 |
| [7] | Kerviel A, Ge P, Lai M, et al. Atomic structure of the translation regulatory protein NS1 of bluetongue virus. Nat Microbiol, 2019, 4(5): 837-845. DOI:10.1038/s41564-019-0369-x |
| [8] | Butan C, Tucker P. Insights into the role of the non-structural protein 2 (NS2) in bluetongue virus morphogenesis. Virus Res, 2010, 151(2): 109-117. DOI:10.1016/j.virusres.2010.05.014 |
| [9] | Beaton AR, Rodriguez J, Reddy YK, et al. The membrane trafficking protein calpactin forms a complex with bluetongue virus protein NS3 and mediates virus release. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(20): 13154-13159. DOI:10.1073/pnas.192432299 |
| [10] | Ratinier M, Shaw AE, Barry G, et al. Bluetongue virus NS4 protein is an interferon antagonist and a determinant of virus virulence. J Virol, 2016, 90(11): 5427-5439. DOI:10.1128/JVI.00422-16 |
| [11] | Pascall DJ, Nomikou K, Bréard E, et al. "Frozen evolution" of an RNA virus suggests accidental release as a potential cause of arbovirus re-emergence. PLoS Biol, 2020, 18(4): e3000673. DOI:10.1371/journal.pbio.3000673 |
| [12] | Maclachlan NJ. Bluetongue: history, global epidemiology, and pathogenesis. Prev Vet Med, 2011, 102(2): 107-111. DOI:10.1016/j.prevetmed.2011.04.005 |
| [13] | Schnettler E, Ratinier M, Watson M, et al. RNA interference targets arbovirus replication in Culicoides cells. J Virol, 2013, 87(5): 2441-2454. DOI:10.1128/JVI.02848-12 |
| [14] | Feenstra F, Drolet BS, Boonstra J, et al. Non-structural protein NS3/NS3a is required for propagation of bluetongue virus in Culicoides sonorensis. Parasit Vectors, 2015, 8: 476. DOI:10.1186/s13071-015-1063-3 |
| [15] | Tan BH, Nason E, Staeuber N, et al. RGD tripeptide of bluetongue virus VP7 protein is responsible for core attachment to Culicoides cells. J Virol, 2001, 75(8): 3937-3947. DOI:10.1128/JVI.75.8.3937-3947.2001 |
| [16] | White DM, Wilson WC, Blair CD, et al. Studies on overwintering of bluetongue viruses in insects. J Gen Virol, 2005, 86(2): 453-462. DOI:10.1099/vir.0.80290-0 |
| [17] | Vermaak E, Maree FF, Theron J. The Culicoides sonorensis inhibitor of apoptosis 1 protein protects mammalian cells from apoptosis induced by infection with African horse sickness virus and bluetongue virus. Virus Res, 2017, 232: 152-161. DOI:10.1016/j.virusres.2017.03.004 |
| [18] | Roy P. Bluetongue virus structure and assembly. Curr Opin Virol, 2017, 24: 115-123. DOI:10.1016/j.coviro.2017.05.003 |
| [19] | Mohl BP, Roy P. Bluetongue virus capsid assembly and maturation. Viruses, 2014, 6(8): 3250-3270. DOI:10.3390/v6083250 |
| [20] | Sung PY, Vaughan R, Rahman SK, et al. The interaction of bluetongue virus VP6 and genomic RNA is essential for genome packaging. J Virol, 2018, 93(5): e02023-18. |
| [21] | Sutton G, Grimes JM, Stuart DI, et al. Bluetongue virus VP4 is an RNA-capping assembly line. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(5): 449-451. DOI:10.1038/nsmb1225 |
| [22] | Rahman SK, Kerviel A, Mohl BP, et al. A calcium sensor discovered in bluetongue virus nonstructural protein 2 is critical for virus replication. J Virol, 2020, 94(20): e01099-20. |
| [23] | Matsuo E, Roy P. Minimum requirements for bluetongue virus primary replication in vivo. J Virol, 2013, 87(2): 882-889. DOI:10.1128/JVI.02363-12 |
| [24] | Bhattacharya B, Noad RJ, Roy P. Interaction between bluetongue virus outer capsid protein VP2 and vimentin is necessary for virus egress. Virol J, 2007, 4: 7. DOI:10.1186/1743-422X-4-7 |
| [25] | Mohl BP, Kerviel A, Labadie T, et al. Differential localization of structural and non-structural proteins during the bluetongue virus replication cycle. Viruses, 2020, 12(3): 343. DOI:10.3390/v12030343 |
| [26] | Janowicz A, Caporale M, Shaw A, et al. Multiple genome segments determine virulence of bluetongue virus serotype 8. J Virol, 2015, 89(10): 5238-5249. DOI:10.1128/JVI.00395-15 |
| [27] | van Niel G, D'Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol, 2018, 19(4): 213-228. DOI:10.1038/nrm.2017.125 |
| [28] | Labadie T, Roy P. A non-enveloped arbovirus released in lysosome-derived extracellular vesicles induces super-infection exclusion. PLoS Pathog, 2020, 16(10): e1009015. DOI:10.1371/journal.ppat.1009015 |
| [29] | Owusu IA, Quaye O, Passalacqua KD, et al. Egress of non-enveloped enteric RNA viruses. J Gen Virol, 2021, 102(3): 001557. |
| [30] | Labadie T, Jegouic S, Roy P. Bluetongue virus nonstructural protein 3 orchestrates virus maturation and drives non-lytic egress via two polybasic motifs. Viruses, 2019, 11(12): 1107. DOI:10.3390/v11121107 |
| [31] | van Gennip RG, van de Water SG, van Rijn PA. Bluetongue virus nonstructural protein NS3/NS3a is not essential for virus replication. PLoS ONE, 2014, 9(1): e85788. DOI:10.1371/journal.pone.0085788 |
| [32] | Labadie T, Sullivan E, Roy P. Multiple routes of bluetongue virus egress. Microorganisms, 2020, 8(7): 965. DOI:10.3390/microorganisms8070965 |
| [33] | Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell, 2011, 147(4): 728-741. DOI:10.1016/j.cell.2011.10.026 |
| [34] | Shai B, Schmukler E, Yaniv R, et al. Epizootic hemorrhagic disease virus induces and benefits from cell stress, autophagy, and apoptosis. J Virol, 2013, 87(24): 13397-13408. DOI:10.1128/JVI.02116-13 |
| [35] | Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2018, 1864(1): 60-68. DOI:10.1016/j.bbadis.2017.09.028 |
| [36] | 王招弟, 丁红雷. 细菌与自噬的抗争——死亡或重生. 生物工程学报, 2020, 36(8): 1471-1483. Wang ZD, Ding HL. Fighting between bacteria and autophagy——death or rebirth. Chin J Biotech, 2020, 36(8): 1471-1483 (in Chinese). |
| [37] | Lv S, Xu Q, Sun E, et al. Impaired cellular energy metabolism contributes to bluetongue-virus-induced autophagy. Arch Virol, 2016, 161(10): 2807-2811. DOI:10.1007/s00705-016-2924-6 |
| [38] | 吕爽. 蓝舌病病毒感染诱导细胞自噬的作用和机制[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016. Lv S. The effect and mechanism of cellular autophagy induction during bluetongue virus infection[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016 (in Chinese). |
| [39] | Lv S, Xu Q, Sun E, et al. Autophagy activated by bluetongue virus infection plays a positive role in its replication. Viruses, 2015, 7(8): 4657-4675. DOI:10.3390/v7082838 |
| [40] | Chen YH, Du W, Hagemeijer MC, et al. Phosphatidylserine vesicles enable efficient en bloc transmission of enteroviruses. Cell, 2015, 160(4): 619-630. DOI:10.1016/j.cell.2015.01.032 |
| [41] | Feng Z, Hensley L, McKnight KL, et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature, 2013, 496(7445): 367-371. DOI:10.1038/nature12029 |
| [42] | Santiana M, Ghosh S, Ho BA, et al. Vesicle-cloaked virus clusters are optimal units for inter-organismal viral transmission. Cell Host Microbe, 2018, 24(2): 208-220. DOI:10.1016/j.chom.2018.07.006 |
| [43] | Bhattacharya B, Celma CC, Roy P. Influence of cellular trafficking pathway on bluetongue virus infection in ovine cells. Viruses, 2015, 7(5): 2378-2403. DOI:10.3390/v7052378 |
| [44] | Stassen L, Huismans H, Theron J. African horse sickness virus induces apoptosis in cultured mammalian cells. Virus Res, 2012, 163(1): 385-389. DOI:10.1016/j.virusres.2011.09.033 |
| [45] | Sato A, Iizuka M, Nakagomi O, et al. Rotavirus double-stranded RNA induces apoptosis and diminishes wound repair in rat intestinal epithelial cells. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21(3): 521-530. DOI:10.1111/j.1440-1746.2005.03977.x |
| [46] | Mortola E, Larsen A. Bluetongue virus infection: activation of the MAP kinase-dependent pathway is required for apoptosis. Res Vet Sci, 2010, 89(3): 460-464. DOI:10.1016/j.rvsc.2010.04.001 |
| [47] | Kundlacz C, Pourcelot M, Fablet A, et al. Novel function of bluetongue virus NS3 protein in regulation of the MAPK/ERK signaling pathway. J Virol, 2019, 93(16): e00336-19. |
| [48] | Mortola E, Noad R, Roy P. Bluetongue virus outer capsid proteins are sufficient to trigger apoptosis in mammalian cells. J Virol, 2004, 78(6): 2875-2883. DOI:10.1128/JVI.78.6.2875-2883.2004 |
| [49] | Stewart ME, Roy P. Role of cellular caspases, nuclear factor-kappa B and interferon regulatory factors in bluetongue virus infection and cell fate. Virol J, 2010, 7: 362. DOI:10.1186/1743-422X-7-362 |
| [50] | Vietri M, Radulovic M, Stenmark H. The many functions of ESCRTs. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020, 21(1): 25-42. DOI:10.1038/s41580-019-0177-4 |
| [51] | Silva-Ayala D, López T, Gutiérrez M, et al. Genome-wide RNAi screen reveals a role for the ESCRT complex in Rotavirus cell entry. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(25): 10270-10275. DOI:10.1073/pnas.1304932110 |
| [52] | Votteler J, Sundquist WI. Virus budding and the ESCRT pathway. Cell Host Microbe, 2013, 14(3): 232-241. DOI:10.1016/j.chom.2013.08.012 |
| [53] | Hyatt AD, Zhao Y, Roy P. Release of bluetongue virus-like particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3A. Virology, 1993, 193(2): 592-603. DOI:10.1006/viro.1993.1167 |
| [54] | Bhattacharya B, Roy P. Role of lipids on entry and exit of bluetongue virus, a complex non-enveloped virus. Viruses, 2010, 2(5): 1218-1235. DOI:10.3390/v2051218 |
| [55] | Pudupakam RS, Raghunath S, Pudupakam M, et al. Genetic characterization of the non-structural protein-3 gene of bluetongue virus serotype-2 isolate from India. Vet World, 2017, 10(3): 348-352. DOI:10.14202/vetworld.2017.348-352 |
| [56] | Ftaich N, Ciancia C, Viarouge C, et al. Turnover rate of NS3 proteins modulates bluetongue virus replication kinetics in a host-specific manner. J Virol, 2015, 89(20): 10467-10481. DOI:10.1128/JVI.01541-15 |
| [57] | Aliyu IA, Ling KH, Md Hashim N, et al. Annexin A2 extracellular translocation and virus interaction: a potential target for antivirus-drug discovery. Rev Med Virol, 2019, 29(3): e2038. DOI:10.1002/rmv.2038 |
| [58] | Koga R, Kubota M, Hashiguchi T, et al. Annexin A2 mediates the localization of measles virus matrix protein at the plasma membrane. J Virol, 2018, 92(10): e00181-18. |
| [59] | Saxena V, Lai CK, Chao TC, et al. Annexin A2 is involved in the formation of hepatitis C virus replication complex on the lipid raft. J Virol, 2012, 86(8): 4139-4150. DOI:10.1128/JVI.06327-11 |
| [60] | Celma CC, Roy P. Interaction of calpactin light chain (S100A10/p11) and a viral NS protein is essential for intracellular trafficking of nonenveloped bluetongue virus. J Virol, 2011, 85(10): 4783-4791. DOI:10.1128/JVI.02352-10 |
| [61] | Hyser JM, Collinson-Pautz MR, Utama B, et al. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio, 2010, 1(5): e00265-10. |
| [62] | Chacko N, Mohanty NN, Biswas SK, et al. A coiled-coil motif in non-structural protein 3 (NS3) of bluetongue virus forms an oligomer. Virus Genes, 2015, 51(2): 244-251. DOI:10.1007/s11262-015-1230-9 |
| [63] | Han Z, Harty RN. The NS3 protein of bluetongue virus exhibits viroporin-like properties. J Biol Chem, 2004, 279(41): 43092-43097. DOI:10.1074/jbc.M403663200 |
| [64] | B?nfer S, Schneider D, Dewes J, et al. Molecular mechanism to recruit galectin-3 into multivesicular bodies for polarized exosomal secretion. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(19): E4396-E4405. DOI:10.1073/pnas.1718921115 |
| [65] | Garrus JE, von Schwedler UK, Pornillos OW, et al. Tsg101 and the vacuolar protein sorting pathway are essential for HIV-1 budding. Cell, 2001, 107(1): 55-65. DOI:10.1016/S0092-8674(01)00506-2 |
| [66] | Wirblich C, Bhattacharya B, Roy P. Nonstructural protein 3 of bluetongue virus assists virus release by recruiting ESCRT-Ⅰ protein Tsg101. J Virol, 2006, 80(1): 460-473. DOI:10.1128/JVI.80.1.460-473.2006 |
| [67] | Celma CC, Roy P. A viral nonstructural protein regulates bluetongue virus trafficking and release. J Virol, 2009, 83(13): 6806-6816. DOI:10.1128/JVI.00263-09 |
| [68] | Urata S, Yasuda J. Regulation of Marburg virus (MARV) budding by Nedd4.1: a different WW domain of Nedd4.1 is critical for binding to MARV and Ebola virus VP40. J Gen Virol, 2010, 91(Pt 1): 228-234. |
| [69] | Yasuda J, Nakao M, Kawaoka Y, et al. Nedd4 regulates egress of Ebola virus-like particles from host cells. J Virol, 2003, 77(18): 9987-9992. DOI:10.1128/JVI.77.18.9987-9992.2003 |
| [70] | Bhattacharya B, Roy P. Bluetongue virus outer capsid protein VP5 interacts with membrane lipid rafts via a SNARE domain. J Virol, 2008, 82(21): 10600-10612. DOI:10.1128/JVI.01274-08 |
| [71] | Parmar HB, Barry C, Duncan R. Polybasic trafficking signal mediates Golgi export, ER retention or ER export and retrieval based on membrane-proximity. PLoS ONE, 2014, 9(4): e94194. DOI:10.1371/journal.pone.0094194 |
| [72] | Hamard-Peron E, Juillard F, Saad JS, et al. Targeting of murine leukemia virus gag to the plasma membrane is mediated by PI(4, 5)P2/PS and a polybasic region in the matrix. J Virol, 2010, 84(1): 503-515. DOI:10.1128/JVI.01134-09 |
| [73] | Aguilar HC, Matreyek KA, Choi DY, et al. Polybasic KKR motif in the cytoplasmic tail of Nipah virus fusion protein modulates membrane fusion by inside-out signaling. J Virol, 2007, 81(9): 4520-4532. DOI:10.1128/JVI.02205-06 |
| [74] | Curthoys NM, Mlodzianoski MJ, Parent M, et al. Influenza hemagglutinin modulates phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate membrane clustering. Biophys J, 2019, 116(5): 893-909. DOI:10.1016/j.bpj.2019.01.017 |
| [75] | Beaumelle B, Tóth P, Malak OA, et al. Phosphatidylinositol (4, 5)-bisphosphate-mediated pathophysiological effect of HIV-1 Tat protein. Biochimie, 2017, 141: 80-85. DOI:10.1016/j.biochi.2017.05.014 |
| [76] | Bhattacharya B, Roy P. Cellular phosphoinositides and the maturation of bluetongue virus, a non-enveloped capsid virus. Virol J, 2013, 10: 73. DOI:10.1186/1743-422X-10-73 |
| [77] | Perez-Caballero D, Zang T, Ebrahimi A, et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell, 2009, 139(3): 499-511. DOI:10.1016/j.cell.2009.08.039 |
| [78] | Neil SJ, Zang T, Bieniasz PD. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature, 2008, 451(7177): 425-430. DOI:10.1038/nature06553 |
| [79] | Li ZR, Lu DF, Yang H, et al. Bluetongue virus non-structural protein 3 (NS3) and NS4 coordinatively antagonize type Ⅰ interferon signaling by targeting STAT1. Vet Microbiol, 2021, 254: 108986. DOI:10.1016/j.vetmic.2021.108986 |
| [80] | Li JK. Oncolytic bluetongue viruses: promise, progress, and perspectives. Front Microbiol, 2011, 2: 46. |
