, 郭瑞庭1 1. 湖北大学 生命科学学院 省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室 工业生物技术湖北省重点实验室 生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430062;
2. 中国科学院 天津工业生物技术研究所, 天津 300308;
3. 华中师范大学 生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079
收稿日期：2020-10-05；接收日期：2021-01-05
基金项目：国家重点研发计划(No. 2019YFA0706900)，国家自然科学基金(No. 31800662) 资助
摘要：聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene terephthalate，PET) 塑料是由对苯二甲酸(Terephthalic acid，TPA) 和乙二醇(Ethylene glycol，EG) 通过酯键聚合而成的高分子聚合物，具有性质稳定、不易分解等特点，目前已成为广泛使用的一种聚酯，然而大量产生的PET废弃物同时也造成严重的环境污染。2016年，一种有效降解PET的PET水解酶在大阪伊德氏杆菌201-F6中被鉴定发现(命名为IsPETase)，且多个IsPETase结构已被解析。为了设计获得PET降解效率更高的IsPETase，针对底物结合位点Ⅱc区的天冬氨酸233 (N233)残基进行了多种突变测试，酶活性检测实验表明，用丙氨酸替代N233可以提高IsPETase的性能，尤其是结合R280A突变后，IsPETase活性增加更为显著。此外，解析了IsPETase N233A突变体的X射线晶体结构。IsPETase N233A突变体与IsPETase野生型整体结构相似，但丙氨酸取代N233后增加了底物识别位点Ⅱ末端的空间结构，推测因此增加了IsPETase的活性。这些结果为进一步基于结构改造PET水解酶提供了新的线索。
关键词：聚对苯二甲酸乙二酯聚对苯二甲酸乙二酯水解酶降解X射线晶体结构N233突变体
Structure-based engineering of PET hydrolase from Ideonella sakaiensis
Chunqi Chen1, Xu Han2, Weidong Liu2, Lixin Ma1, Ke Liu3
, Rey-Ting Guo1 1. Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio-Resources, Hubei Key Laboratory of Industrial Biotechnology, State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China;
2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;
3. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei, China
Received: October 5, 2020; Accepted: January 5, 2021
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2019YFA0706900), National Natural Science Foundation of China (No. 31800662)
Corresponding author: Ke Liu. Tel: +86-27-67862703; E-mail: keliu2015@mail.ccnu.edu.cn;
Rey-Ting Guo. Tel: +86-27-88664297; E-mail: guoreyting@hubu.edu.cn.
Abstract: Polyethylene terephthalate (PET) is a synthetic polymer consisting of ester bond-linked terephthalate and ethylene glycol. Tremendous amounts of PET have been produced and majority of them enters terrestrial and marine environment as wastes, posing serious threats to the global ecosystems. In 2016, a PET hydrolase from a PET-assimilating bacterium Ideonalla sakaiensis was reported and termed as IsPETase. This enzyme outperforms other PET-hydrolyzing enzymes in terms of its PET hydrolytic activity at ambient temperature, thus holds a great promise for PET biodegradation. In order to improve IsPETase activity, we conducted structure-based engineering to modify the putative substrate-binding tunnel. Among the several variants to the N233 residue of IsPETase, we discovered that the substitution of N233 with alanine increases its PET hydrolytic activity, which can be further enhanced when combined with a R280A mutation. We also determined the X-ray crystal structure of the IsPETase N233A variant, which shares nearly identical fold to the WT protein, except for an open end of subsite Ⅱ. We hypothesized that the smaller side chain of N233A variant might lead to an extended subsite Ⅱ for PET binding, which subsequently increases the enzymatic activity. Thus, this study provides new clues for further structure-based engineering of PETase.
Keywords: PETIsPETasedegradationX-ray crystal structureN233 variants
塑料制品给人类生活带来生活便利的同时也严重威胁着全球的生态系统。聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene terephthalate，PET) 塑料是由对苯二甲酸(Terephthalic acid，TPA) 和乙二醇(Ethylene glycol，EG) 通过酯键聚合而成的高分子聚合物，具有性质稳定、不易分解等特点，目前已成为广泛使用的一种聚酯[1]，但同时是造成白色污染的主要原因[2-3]。目前对PET废弃物的处理方法主要包括填埋、焚烧以及回收再利用。填埋和焚烧虽然最为简单，但产生的废气废水会对环境造成二次污染。利用生物法(酶降解或者微生物降解) 可以将PET降解成小分子，然后被回收再利用，因此是最理想的处理方法[4-7]。在过去的十几年中，科学家已经发现酯酶、脂肪酶和角质酶等具有降解PET的能力[4-5]，证明了PET生物降解的可能性。生化性质分析发现这些酶都属于丝氨酸水解酶家族，但PET并不是它们的天然底物，所以降解活力很低[8]。定点突变、添加金属离子等方法也被用来尝试提高这些酶的活性，但结果并不理想[9-12]。
2016年，Yoshida等分离出了能够以PET为唯一碳源的大阪伊德氏杆菌Ideonella sakaiensis 201-F6[13]。这株细菌能够分泌PET水解酶(后命名为IsPETase) 到胞外，通过水解PET产生单-(2-羟乙基) 对苯二甲酸(MHET)、TPA和羟乙基(bis-2) TPA (BHET)，这些小分子随后进入细胞进行代谢[13]。前期，我们及其他团队先后报道了IsPETase高分辨率的晶体结构[14-19]。晶体结构显示，IsPETase与典型的角质酶具有近50%的蛋白质序列相似性，同属于α/β水解酶超家族，都具有经典的α/β水解酶折叠以及由丝氨酸(S160)-组氨酸(H237)-天冬氨酸(D206) 构成的催化三联体(Catalytic triad) 结构，而底物坐落于蛋白质表面的一个浅凹槽内(图 1A)[14, 17]。尽管与典型角质酶的序列与结构高度相似，但IsPETase展现了其特有的结构特征，例如典型角质酶具有一对非常保守的二硫键(DS2，图 1A)，而在IsPETase中，除了此保守二硫键外，在活性中心附近多了一对DS1 (图 1A)。结构显示DS1连接着一段IsPETase特有的loop区域，突变DS1的C203或C239氨基酸残基将导致IsPETase水解PET的效率显著降低[14]。上述信息为进一步研究IsPETase的催化机理以及其后续的酶活性改造奠定了重要的基础。
 |
| 图 1 IsPETase的结构特点 Fig. 1 The structure of IsPETase. (A) A cartoon model (PDB code 5xg0). The catalytic triad and disulfide bridges are shown as sticks, and colored as yellow and amaranth, respectively. (B) The substrate binding residues of IsPETase. |
| 图选项 |
除单独的IsPETase晶体结构外，我们同时报道了IsPETase识别底物/产物的复合体晶体结构[14]。复合体结构显示催化三联体附近的第185位色氨酸(W185) 的侧链可以识别PET的MHET基团。基于这些信息，Joo等进行了分子对接分析，并预测IsPETase表面有一个长而浅的通道可以容纳结合底物PET，随后他们将W185附近区域命名为第Ⅰ底物结合位点，向后延伸为第Ⅱ号位点；而Ⅱ号位点又可以分为Ⅱa、Ⅱb及Ⅱc三个MHET基团结合区。利用突变实验他们发现位于Ⅱc位点最末端的精氨酸残基280 (R280) 突变为短侧链氨基酸残基丙氨酸后，可以增加底物PET识别通道的宽度进而提高了IsPETase的降解活性[17]。
自我们解析IsPETase的结构后，本团队一直致力于对IsPETase的改造，希望能够获得活性更高、催化条件更广泛的PET水解酶。本研究基于前期R280A的研究结果，针对IsPETase的Ⅱc结合区进行了深入探索。基于结构分析，我们发现R280相对的天冬酰胺233 (N233) 可能是改善酶活性的关键氨基酸残基, 因此在本文中我们系统地研究了N233突变成为不同氨基酸后的IsPETase酶活性，并且成功解析了酶活表现较优的IsPETase N233A突变体的晶体结构。随后，基于结构揭示了IsPETase N233A/R280A双突变体呈现较高的PET降解活性的分子机理。
1 材料与方法1.1 基因克隆以构建好的野生型大阪伊德氏杆菌201-F6 IsPETase (GenBank登录号：GAP38373.1) (GENE ray Biotech Co.，Shanghai，China) 重组pET32a载体为模板，通过使用QuickChange定点诱变试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA) 构建突变体。其中，突变体PCR产物与Dpn Ⅰ孵育(New England Biolabs，Hitchin，UK) 以消化原始DNA模板。随后，突变体质粒分别转化至大肠杆菌XL1-Blue中，经测序确认突变后利用大肠杆菌进行表达。
1.2 蛋白质表达纯化将IsPETase野生型和突变体质粒转化大肠杆菌BL21 trxB (DE3) 细胞，并利用LB培养基于37 ℃培养至OD600约为0.8，随后降温至16 ℃并利用0.6 mmol/L异丙基β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG) 诱导24 h。次日，离心收集细胞，利用含有25 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑(pH 7.5) 的溶液重悬细胞，然后进行高压破碎。17 000×g高速离心1 h去除细胞碎片，获得的上清液通过FPLC系统(GE，Healthcare) 进行蛋白质纯化，并利用TEV蛋白酶去除His标签。获得的混合物再次通过Ni-NTA柱纯化后，浓缩至30 mg/mL进行酶活性测定和结晶筛选。
1.3 酶活性测定根据之前我们报道的酶活测定方法检测IsPETase野生型和突变体降解PET的活性[14]。分别将3 mg/mL底物PET薄膜与10 μg/mL IsPETase野生型或各种突变体蛋白质加入含有50 mmol/L甘氨酸-NaOH (pH 9.0) 的反应体系中，反应混合物在30 ℃、800 r/min振荡下反应18 h，随后在85 ℃淬灭反应10 min。产物利用HPLC系统以及C18柱在流动相为20%–80%甲醇的磷酸缓冲液条件下进行分析。每个独立实验中，每个样品进行3次平行反应。数据分析中，以野生型的产物量为百分之百，其他样品的活力则以百分比来表示。
1.4 IsPETase N233A突变体蛋白质的结晶实验N233A突变体蛋白质利用包括Crystal Screen、Crystal Screen 2、Crystal Screen Cryo、Crystal Screen Lite、MembFac、Natrix、Index、SaltRx和SaltRx 2等Hampton Research Crystal Screen的768种不同条件进行晶体初筛。将1 μL蛋白质溶液与1 μL晶体筛选储液在96孔Cryschem板(Hampton Research) 中混合，利用坐滴式蒸气扩散法在25 ℃条件下进行结晶实验。最终N233A蛋白质晶体在含有17% PEG8000、0.2 mol/L醋酸钙和0.1 mol/L次甲砷酸钠的溶液中获得。
1.5 N233A突变体蛋白质的结构解析在晶体数据收集之前，将晶体浸泡在含有20% PEG8000、0.2 mol/L醋酸钙、0.1 mol/L次甲砷酸钠和10%甘油的冷冻保护剂中，并迅速利用液氮冷冻保存。蛋白质晶体的X射线衍射数据利用台湾同步辐射研究中心(NSRRC，台湾新竹) 的BL15A1和TPS05A线站进行收集。收集数据使用HKL-2000程序进行衍射图像处理[20]，使用PHENIX和COOT构建模型[21-22]，最终结构利用PHENIX和Refmac5进行修正[23]。所有结构图使用PyMOL程序(http://pymol.sourceforge.net/) 呈现。
2 结果与分析2.1 IsPETase突变体设计思路2018年，Joo等通过分子对接预测了IsPETase结合含有4个PET分子的类似物2-HE(MHET)4 (2-hydroxyethyl-(monohydroxyethyl terephthalate)4) 的结构模式。IsPETase识别2-HE (MHET)4的结合位点可分为Ⅰ和Ⅱ两部分，分别结合了1个和3个MHET基团。位点Ⅰ主要由Y87、W185、M161和I208残基组成，而位点Ⅱ由T88、A89、W159、I232、N233、S236、S238、N241、N244、S245、N246和R280等多个氨基酸残基组成一个窄而狭长的槽状结构(图 1B)[17]。
通过晶体结构和酶活性实验分析发现，识别位点Ⅱ末端的R280残基突变为短侧链的丙氨酸后提高了IsPETase的活性[17, 24]。基于结构分析发现，虽然R280残基远离IsPETase的活性中心，但R280突变为丙氨酸后，精氨酸的长侧链消失，致使结合位点Ⅱ末端由原来的正电荷凸起位点变为了疏水性的非凸起位点，进而减少了IsPETase结合底物的空间位阻，增加了IsPETase酶活性[17]。进一步分析发现，R280残基对面的N233侧链为一个较长的亲水性基团。因此我们猜测改变N233这个亲水侧链可能有助于扩展底物的结合空间，或者改变233位的氨基酸侧链性质可能会改变底物结合力，进而提升IsPETase的降解能力。因此，我们对N233进行了不同突变，基于酶活性检测分析了其改造结果。此外，我们同时构建了含有R280A和N233A双突变的IsPETase，希望能够进一步提高IsPETase的水解效率。
2.2 N233突变体的酶活性测定我们首先构建了IsPETase N233不同的突变体，包括含有短侧链的N233G、N233A、N233C和N233S突变体，以及带电N233D、N233E、N233H、N233R和芳香族N233F、N233Y和N233W等突变体。不同突变体与底物PET反应后进行产物MHET和TPA的含量测定。酶活实验显示，相比较于野生型IsPETase，N233各种突变体生成MHET的产量没有明显变化(图 2A)，并且突变体N233C、N233H和N233W产生的MHET的量下降了约50%。另一方面，我们发现N233G、N233A、N233S、N233E、N233R和N233W突变体能够增加产物TPA的产量(图 2A)，但当N233突变为其他氨基酸如C、D、H和F时，显著降低了TPA的产量(图 2A)。在上述突变体中，我们发现N233A突变体产生TPA的量比野生型高出1倍，因此IsPETase N233A突变体的水解活性增加尤为明显(图 2A)。
 |
| 图 2 IsPETase N233突变体降解PET的活性分析 Fig. 2 Analysis of the PET hydrolytic activity of IsPETase N233 variants. (A) Hydrolytic activities of IsPETase and its N233 variants. (B) Hydrolytic activities of IsPETase and its N233A/R280A variant. **P < 0.001 compared with WT MHET, and *P < 0.05 compared with WT TPA. |
| 图选项 |
根据以上结果，我们进一步构建了N233A/ R280A双突变体，并测定其降解PET的能力。有趣的是，PET水解产物分析表明N233A/R280A双突变体同时增加了MHET和TPA的产量(图 2B)。综合上述结果，我们发现R280A/N233A双突变体能够有效改善IsPETase的活性。
2.3 N233A突变体蛋白质的结构解析为了更好地解释N233A和R280A/N233A突变体促进IsPETase活性的分子机理，我们随后进行了蛋白质结晶实验，并最终获得解析了分辨率为1.9 ?的N233A突变体晶体结构(表 1)。结构显示N233A突变体蛋白质同样具有经典的ɑ/β-水解酶折叠结构以及S160-H237-D206催化三联体活性中心(图 3A)。相比较IsPETase野生型的结构，N233A突变体结构没有明显差异(RMSD为0.145 ?) (图 3B)。但在N233A突变体中，我们发现丙氨酸代替N233后虽然没有改变突变体结构的表面电荷分布，由天冬酰胺变为短侧链且不带电的丙氨酸，可能减弱了底物结合的空间位阻作用、增加了结合位点的疏水性，使底物能够更好地进入催化裂隙(图 3C–D)。
表 1 晶体衍射数据收集和模型优化参数Table 1 Data collection and refinement statistics of N233A variant
| PDB code | 7CQB |
| Data collection | |
| Space group | P212121 |
| Unit cell | |
| a (?) | 51.065 |
| b (?) | 51.246 |
| c (?) | 84.806 |
| α/β/γ (°) | 90/90/90 |
| Resolution (?) | 25–1.86 (1.93–1.86) |
| Unique reflections | 19 219 (1 892) |
| Redundancy | 6.3 (6.4) |
| Completeness (%) | 99.3 (99.9) |
| Average I/σ(I) | 25.3 (4.2) |
| CC 1/2 | 0.995 (0.933) |
| Refinement | |
| No. of reflections | 19 170 (1 395) |
| Rwork[a] (95 % of data) | 0.142 (0.198) |
| Rfree[a] (5 % of data) | 0.192 (0.262) |
| r.m.s.d. bonds (?) | 0.010 |
| r.m.s.d. angles (o) | 1.493 |
| Dihedral angles | |
| Most favored (%) | 98.1 |
| Allowed (%) | 1.9 |
| Disallowed (%) | 0 |
| No. of non-H atoms/average B (?2) | |
| Protein | 1 919/21.16 |
| Water | 233/32.48 |
| [a] Values in parentheses are for highest-resolution shell. | |
表选项
 |
| 图 3 IsPETase N233A突变体蛋白质的结构特点 Fig. 3 The structural characteristics of IsPETase N233A variant. (A) The crystal structure of IsPETase N233A variant presented as a cartoon model. The catalytic triad and N233A residues of IsPETase are shown as sticks. (B) Structure comparison of IsPETase WT (blue) with N233A (pink). (C) to (F) Electrostatic potential surface presentation of substrate binding site Ⅱ in IsPETase WT and its different variants. The residues R280, N233 and their mutants are shown as sticks. The electrostatic potential surface change in IsPETase and its variants are indicated with dotted circles. |
| 图选项 |
虽然没有获得R280A/N233A突变体的晶体结构，通过结构模拟我们发现N233A/R280A双突变体中丙氨酸的短侧链可能进一步拓展了IsPETase结合位点Ⅱ末端的疏水性结合槽结构(图 3E–F)，使其能够更好地容纳识别底物。因此，上述结果解释了为什么N233A以及N233A/R280A突变体可以促进IsPETase活性，增加了底物MHET或/和TPA的产量。
3 讨论基于IsPETase晶体结构，前期研究已对IsPETase降解PET的过程进行推测阐述，并且针对影响IsPETase活性的关键氨基酸进行了研究[14, 25]。IsPETase底物结合位点可分为结合一个MHET基团的位点Ⅰ以及识别3个MHET基团的位点Ⅱ。在水解过程中，PET在IsPETase作用下先降解为MHET和TPA，MHET将会进一步被MHETase降解为TPA和EG。前期Yoshida等的研究表明，IsPETase降解PET薄膜过程中也会产生较多的TPA[13]。本实验中，IsPETase N233A对于TPA的产量增加较为明显，这与R280A突变体的结果相类似[17]。我们推测可能是由于N233A和R280A突变位点位于底物位点Ⅱ的末端，促进了MHET基团降解为TPA，但具体的原因还需要进一步研究。除了已报道的结合位点的氨基酸残基改造，N244、S245和N246三个残基位于一个长的链状结构(图 1B)，被认为对于固定识别底物具有重要的作用，其对IsPETase的活性影响还有待研究。
除了对IsPETase的结构进行改造，目前针对影响其活性的一些物理因素也有报道。例如，一定浓度的盐和甘油可以增强IsPETase降解PET的能力，而低浓度的有机溶剂或去污剂能够降低IsPETase的活性。此外，Liu等也对IsPETase活性的最适温度和溶剂pH等进行了研究[26]。因此，除了改变酶活性中心或底物识别位点的关键氨基酸残基外，还可以通过物理方法对IsPETase的活性进行优化。在后期的IsPETase酶活研究改造中，可以采用蛋白质结构及物理因素优化相结合的方式更有效地改善IsPETase降解PET的活性。
参考文献
| [1] | Webb HK, Arnott J, Crawford RJ, et al. Plastic degradation and its environmental implications with special reference to poly (ethylene terephthalate). Polymers, 2013, 5(1): 1-18. |
| [2] | Forrest SA, Holman L, Murphy M, et al. Citizen science sampling programs as a technique for monitoring microplastic pollution: results, lessons learned and recommendations for working with volunteers for monitoring plastic pollution in freshwater ecosystems. Environ Monit Assess, 2019, 191(3): 172. DOI:10.1007/s10661-019-7297-3 |
| [3] | 许楹, 殷超凡, 岳纹龙, 等. 石油基塑料的微生物降解. 生物工程学报, 2019, 35(11): 2092-2103. Xu Y, Yin CF, Yue WL, et al. Microbial degradation of petroleum-based plastics. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2092-2103 (in Chinese). |
| [4] | Wei R, Oeser T, Zimmermann W. Synthetic polyester-hydrolyzing enzymes from thermophilic actinomycetes. Adv Appl Microbiol, 2014, 89: 267-305. |
| [5] | Chen S, Tong X, Woodard RW, et al. Identification and characterization of bacterial cutinase. J Biol Chem, 2008, 283(38): 25854-25862. DOI:10.1074/jbc.M800848200 |
| [6] | 杨宇. 塑料的生物分解: 关键问题及进展//中国生物工程学会第二届青年科技论坛暨首届青年工作委员会学术年会论文集. 广州: 中国生物工程学会, 2017. |
| [7] | 王小丹. 环境中可被生物降解的聚酯塑料的酶降解机制的理论研究[D]. 济南: 山东大学, 2019. Wang XD. Theoretical study on the mechanism of enzyme degradation of biodegradable polyester plastics in environment. Jinan: Shangdong University, Master thesis, 2019 (in Chinese). |
| [8] | De Castro AM, Carniel A, Junior JN, et al. Screening of commercial enzymes for poly ethylene terephthalate (PET) hydrolysis and synergy studies on different substrate sources. J Ind Microbiol Biotechnol, 2017, 44(6): 835-844. DOI:10.1007/s10295-017-1942-z |
| [9] | Acero EH, Ribitsch D, Dellacher A, et al. Surface engineering of a cutinase from Thermobifida cellulosilytica for improved polyester hydrolysis. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(10): 2581-2590. DOI:10.1002/bit.24930 |
| [10] | Ribitsch D, Hromic A, Zitzenbacher S, et al. Small cause, large effect: structural characterization of cutinases from Thermobifida cellulosilytica. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(11): 2481-2488. DOI:10.1002/bit.26372 |
| [11] | Then J, Wei R, Oeser T, et al. Ca2+ and Mg2+ binding site engineering increases the degradation of polyethylene terephthalate films by polyester hydrolases from Thermobifida fusca. Biotechnol J, 2015, 10(4): 592-598. DOI:10.1002/biot.201400620 |
| [12] | Then J, Wei R, Oeser T, et al. A disulfide bridge in the calcium binding site of a polyester hydrolase increases its thermal stability and activity against polyethylene terephthalate. FEBS Open Bio, 2016, 6(5): 425-432. DOI:10.1002/2211-5463.12053 |
| [13] | Yoshida S, Hiraga K, Takehana T, et al. A bacterium that degrades and assimilates poly ethylene terephthalate. Science, 2016, 351(6278): 1196-1199. DOI:10.1126/science.aad6359 |
| [14] | Han X, Liu WD, Huang JW, et al. Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase. Nat Commun, 2017, 8: 2106. DOI:10.1038/s41467-017-02255-z |
| [15] | Chen CC, Han X, Ko TP, et al. Structural studies reveal the molecular mechanism of PETase. FEBS J, 2018, 285(20): 3717-3723. DOI:10.1111/febs.14612 |
| [16] | Austin HP, Allen MD, Donohoe BS, et al. Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(19): E4350-E4357. DOI:10.1073/pnas.1718804115 |
| [17] | Joo S, Cho IJ, Seo H, et al. Structural insight into molecular mechanism of poly ethylene terephthalate degradation. Nat Commun, 2018, 9: 382. DOI:10.1038/s41467-018-02881-1 |
| [18] | Fecker T, Galaz-Davison P, Engelberger F, et al. Active site flexibility as a hallmark for efficient PET degradation by I. sakaiensis PETase. Biophys J, 2018, 114(6): 1302-1312. DOI:10.1016/j.bpj.2018.02.005 |
| [19] | Liu B, He LH, Wang LP, et al. Protein crystallography and site-direct mutagenesis analysis of the poly ethylene terephthalate hydrolase PETase from Ideonella sakaiensis. ChemBioChem, 2018, 19(14): 1471-1475. DOI:10.1002/cbic.201800097 |
| [20] | Otwinowski Z, Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol, 1997, 276: 307-326. |
| [21] | Adams PD, Afonine PV, Bunkoczi G, et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010, 66(2): 213-221. DOI:10.1107/S0907444909052925 |
| [22] | Emsley P, Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004, 60(12 Pt 1): 2126-2132. |
| [23] | Murshudov GN, Skubák P, Lebedev AA, et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011, 67(4): 355-367. DOI:10.1107/S0907444911001314 |
| [24] | Son HF, Cho IJ, Joo S, et al. Rational protein engineering of thermo-stable petase from Ideonella sakaiensis for highly efficient PET degradation. ACS Catal, 2019, 9(4): 3519-3526. DOI:10.1021/acscatal.9b00568 |
| [25] | Ma Y, Yao MD, Li BZ, et al. Enhanced poly ethylene terephthalate hydrolase activity by protein engineering. Engineering, 2008, 4(6): 888-893. |
| [26] | Liu CC, Shi C, Zhu SJ, et al. Structural and functional characterization of polyethylene terephthalate hydrolase from Ideonella sakaiensis. Biochem Biophys Res Commun, 2019, 508(1): 289-294. DOI:10.1016/j.bbrc.2018.11.148 |
