马萌, 郑孟加, 李晓齐, 高丽, 曹红, 王永强, 郑世军
中国农业大学动物医学院 农业动物流行病学重点实验室，北京 100193
收稿日期：2020-09-25；接收日期：2020-12-07；网络出版时间：2021-01-06
基金项目：国家自然科学基金(No. 31430085)，现代农业产业技术体系建设专项(No. NYCYTX-40) 资助

摘要：为获得鸡源CD40L (chCD40L) 蛋白，以鸡脾细胞制备cDNA并以之为模板扩增chCD40L基因，构建pFastBac-chCD40L供体重组质粒，转化感受态细胞DH10Bac，通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒，转入真核表达系统sf9昆虫细胞进行蛋白表达与纯化，获得His-chCD40L蛋白。此外，构建pQM01-chCD40L质粒，转染HEK 293T细胞进行蛋白表达与纯化，获得Strep-chCD40L蛋白。亲和层析纯化的chCD40L蛋白浓度为0.01 mg/mL。为检测chCD40L蛋白的生物活性，分离和培养3周龄SPF雏鸡的法氏囊组织原代细胞，将chCD40L加入细胞培养液刺激细胞增殖，通过Western blotting试验、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测，发现该蛋白能够与法氏囊B淋巴细胞表面的CD40结合，说明chCD40L具有生物活性。成功获得chCD40L蛋白，为原代B淋巴细胞体外培养及IBDV野毒分离与诊断奠定了基础。
关键词：鸡CD40L法氏囊原代细胞培养真核表达生物活性检测杆状病毒表达系统
Gene cloning, protein expression and examination of biological activity of chicken CD40L
Meng Ma, Mengjia Zheng, Xiaoqi Li, Li Gao, Hong Cao, Yongqiang Wang, Shijun Zheng
Key Laboratory of Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Received: September 25, 2020; Accepted: December 7, 2020; Published: January 6, 2021
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31430085), The Modern Agricultural Industry Technology System, China (No. NYCYTX-40)
Corresponding author: Yongqiang Wang. Tel: +86-10-62734483; E-mail: vetwyq@cau.edu.cn;
Shijun Zheng. Tel: +86-10-62734681; E-mail: sjzheng@cau.edu.cn.

Abstract: To obtain chicken CD40L protein, the cDNA was prepared from chicken splenic cells and used as a template to clone and amplify CD40L by PCR. The target gene was cloned into pFastBac vector to construct a pFastBac-chCD40L donor plasmid. Recombinant plasmid was transformed into DH10Bac and recombinant Bacmid-chCD40L was obtained. The Bacmid-chCD40L plasmid was transfected into sf9 insect cells to obtain His-chCD40L protein. In addition, the target gene was cloned into pQM01 vector to construct a pQM01-chCD40L plasmid, recombinant plasmid was transfected into HEK 293T cells to obtain Strep-chCD40L protein. The chCD40L protein was purified by affinity chromatography, and the concentration of purified chCD40L protein was determined to be 0.01 mg/mL. Primary cells were isolated from the bursal tissue of 3-week old SPF chickens, and the chCD40L protein was added to the culture medium to stimulate cells. The chCD40L could bind to CD40 on B cells as examined by Western blotting, indirect immunofluorescence assay and flow cytometry, suggesting that chCD40L protein is biologically active. We successfully obtained chicken CD40L protein of biological activity, which laid the foundation in the in vitro culture of primary B lymphocytes for the isolation and diagnosis of virulent IBDV.
Keywords: chickenCD40Lchicken primary bursal cell cultureeukaryotic expressionbiological activity assaybaculovirus expression system
CD40L位于CD4⁺ T细胞膜上，是重要的免疫共刺激分子，与B细胞膜上的CD40结合促进B细胞活化。鸡CD40L基因位于4号染色体，有6个外显子，其mRNA的长度为892 nt，其中CDS区域有819 nt，编码272个氨基酸。2005年，Tregaskes等表达了鸡CD40L可溶性融合蛋白并研究了其生物学特性，发现鸡CD40L具有与哺乳动物相似的生物学活性^[1]。鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virous，IBDV) 主要感染雏鸡的法氏囊B淋巴细胞，而B淋巴细胞一旦从法氏囊组织分离将很快进入细胞凋亡状态，难以进行传代培养^[2]。据研究发现，鸡CD40L能诱导B淋巴细胞分裂增殖并维持B细胞的体外培养^[2-3]。进一步研究发现，以鸡CD40L刺激培养的法氏囊原代B淋巴细胞可以培养IBDV^[4-5]，为IBDV野毒的分离提供了新方法。然而，目前尚没有商品化的鸡CD40L，限制了对IBDV野毒的细胞培养、分离和鉴定。因此，本研究通过鸡CD40L基因克隆、蛋白表达及生物活性检测获得了具有生物活性的鸡CD40L蛋白，为原代B淋巴细胞的体外培养及IBDV野毒的分离与诊断奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料HEK 293T细胞、sf9细胞为本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自擎科生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH10Bac、pFastbac质粒由中国农业大学封文海教授实验室惠赠。3周龄SPF鸡购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，原代法氏囊细胞分离自3周龄SPF鸡。pQM01线性化载体购自粒曼生物科技有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Zymo公司；去内毒素质粒小提试剂盒购自美基生物科技有限公司；鼠源His-tag单克隆抗体购自Abmart公司；鼠源Strep-tag单克隆抗体购自MBL公司；转染试剂jetPRIME购自Ployplus公司；转染试剂FuGENE6购自普洛麦格公司；IMDM细胞培养基购自迈晨科技有限公司；Strep-Tactin蛋白纯化填料购自IBA生命科学公司；His-tag蛋白纯化填料购自康为世纪生物科技有限公司；亲和层析柱购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 鸡CD40L基因克隆与蛋白表达1.2.1 鸡CD40L基因的获取根据鸡CD40L基因序列(GenBank登录号：NM_204733.1) 设计特异性引物(F-5′-ATGAAT GAAGCCTACAGCCCT-3′；R-5′-CAGCTTGAACA TGCCAAAGTAGGTGTT-3′)，以鸡脾cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增得到的特异性条带回收后连接至pMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落测序并将测序结果与已发表的鸡CD40L基因序列进行比对。
1.2.2 鸡CD40L蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定以测序正确的pMD19-T-chCD40L载体为模板，用含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点的特异性引物(F-5′-CCGGAATTCAACATCATCATCATCATC ATATGAATGAAGCCTACAGCCC-3′；R-5′-CGGG GTACCCTAATGATGATGATGATGATGATGCAGCTTGAACATGCCAAAGT-3′) 将鸡CD40L扩增出来，双酶切后连接到酶切过的pFastBac载体上，转化至DH5α，将菌落PCR及双酶切鉴定为阳性的样本测序，测序正确者即载体构建成功。将pFastBac-chCD40L重组质粒转化至DH10Bac，通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒，将质粒转入sf9昆虫细胞，产生可表达目的蛋白的重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染sf9细胞表达目的蛋白，并通过Western blotting分析蛋白表达情况。
1.2.3 鸡CD40L蛋白在HEK 293T细胞中的表达及鉴定用含有pQM01同源臂的特异性引物(F-5′- GCAACGGCAGCAGCGGATCCATGAATGAAGCCTACAGCCCT-3′；R-5′-GGGTGGCTCCAGGCGC TGCTCAGCTTGAACATGCCAAAGTAGGTGTT-3′)
扩增鸡CD40L基因，通过同源重组将目的基因连接到pQM01载体上构建pQM01-chCD40L质粒，转染HEK 293T细胞表达目的蛋白，并通过Western blotting分析蛋白表达情况。
1.3 鸡CD40L蛋白纯化与生物活性检测1.3.1 鸡CD40L蛋白的纯化根据纯化试剂盒说明书，分别使用Ni-Agarose Resin及Strep-Tactin填料通过亲和层析的方法对昆虫杆状病毒表达系统表达的His-chCD40L蛋白及HEK 293T细胞中表达的Strep-chCD40L蛋白进行纯化，并使用标准浓度的BSA样品测定目的蛋白的浓度。
1.3.2 鸡CD40L蛋白生物活性的Western blotting检测于无菌条件下从3周龄SPF雏鸡的法氏囊组织分离原代细胞，用于鸡CD40L蛋白活性检测：分别使用添加0.5 μg/mL Strep-chCD40L及没有添加蛋白的IMDM细胞培养液培养原代法氏囊细胞，24 h后收集细胞蛋白，进行Western blotting检测。
1.3.3 鸡CD40L蛋白生物活性的间接免疫荧光试验检测分别使用添加0.5 μg/mL Strep-chCD40L、0.5 μg/mL Strep-VDAC2、0.5 μg/mL BSA及没有添加蛋白的IMDM培养液培养原代法氏囊细胞，相同处理两组细胞分别为实验组与同型对照组。24 h后收集细胞，用PBS洗细胞后将其涂于载玻片上，经干燥、固定、封闭、孵育anti-Strep-tag (IgG2a亚型) 及anti-myc-tag (IgG2a亚型) 一抗、孵育FITC标记的荧光二抗、洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察。
1.3.4 鸡CD40L蛋白生物活性的流式细胞术检测分别使用添加0.5 μg/mL Strep-chCD40L、0.5 μg/mL Strep-VDAC2、0.5 μg/mL BSA及没有添加蛋白的IMDM培养液培养原代法氏囊细胞，相同处理两组细胞分别为实验组与同型对照组，24 h后收取细胞到流式管中，用anti-Strep-tag (IgG2a亚型) 及anti-myc-tag (IgG2a亚型) 一抗、FITC标记的荧光二抗于室温条件下孵育，洗涤后用PBS重悬细胞，用流式细胞仪对处理好的样品进行分析，通过以上3种方式检测体外表达纯化的chCD40L蛋白是否具有生物活性。
2 结果与分析2.1 鸡CD40L基因的获取以鸡脾脏cDNA为模板进行PCR扩增获取chCD40L基因，结果显示产物大小为819 bp，与预期一致(图 1)，将回收的PCR扩增产物连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌液测序比对，结果显示NCBI上发表的鸡CD40L基因序列(GenBank登录号：NM_204733.1) 相同。

图 1 鸡CD40L基因的PCR扩增 Fig. 1 Amplification of chicken CD40L gene by PCR. M: DNA marker Ⅱ; 1: gene of chicken CD40L; 2: negative control.

图选项

2.2 鸡CD40L蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定通过KpnⅠ、EcoRⅠ两个酶切位点双酶切pFastbac质粒及含有酶切位点的鸡CD40L基因，并将酶切后的目的基因与pFastbac载体连接，经PCR及双酶切验证成功构建出pFastbac-chCD40L重组质粒(图 2A–B)。将pFastbac-chCD40L质粒转化DH10Bac，选择菌落较大且颜色均匀的白色单克隆进行PCR鉴定，结果显示获得了重组杆状病毒Bacmid-chCD40L (图 3)。将重组杆状病毒Bacmid-chCD40L及野生型杆状病毒Bacmid-WT分别感染sf9昆虫细胞，于显微镜下观察到，与对照组相比，感染了杆状病毒的实验组出现了明显病变(图 4A)，收取PⅠ病毒，在sf9细胞上进行病毒扩繁，获得PII、PIII病毒，分别取含有PI、PII、PIII病毒的sf9细胞培养上清及正常sf9细胞培养上清，加入5×SDS上样缓冲液煮沸并冷却，用anti-His-tag特异性抗体做Western blotting鉴定，结果表明含有PI、PII、PIII重组杆状病毒的sf9细胞培养上清中均有His-chCD40L蛋白的表达(图 4B)。

图 2 重组供体质粒pFastbac-chCD40L的鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant donor plasmids by PCR (A) (M: DNA marker Ⅱ; 1–6: samples of pFastBac- chCD40L; 7: negative control) and double enzyme digestion (B) (M: DNA marker Ⅱ; 1–2: samples of pFastBac-chCD40L; 3: negative control).

图选项

图 3 重组Bacmid-chCD40L的PCR鉴定 Fig. 3 Identification of recombinant Bacmid-chCD40L by PCR. M: DNA marker Ⅲ; 1: sample of Bacmid-chCD40L; 2: sample of Bacmid-WT; 3: negative control.

图选项

图 4 His-chCD40L重组蛋白表达的鉴定 Fig. 4 Identification of His-chCD40L recombinant protein expression by Sf9 cells infected with baculovirus (A) (1: normal sf9 cells; 2: sf9 cells infected with Bacmid-WT; 3: sf9 cells infected with Bacmid-chCD40L) and Western blotting (B) (1: samples of normal sf9 cells culture supernatant; 2: samples of sf9 cells culture supernatant containing PI, PII, PIII wild-type baculovirus; 3: samples of sf9 cells culture supernatant containing PI, PII, PIII recombinant baculovirus).

图选项

2.3 Strep-chCD40L重组蛋白的表达鉴定使用特异性引物通过PCR扩增获得带有pQM01载体同源臂的chCD40L基因，通过同源重组将其连接到pQM01线性化载体上，转化DH5α，选择阳性克隆提取质粒进行PCR鉴定，结果显示获得与目的基因大小相同的条带(图 5A)，将重组pQM01-chCD40L质粒与空载体pQM01-mcherry质粒分别转染HEK 293T细胞，24 h后收取细胞蛋白，加入5×SDS上样缓冲液煮沸并冷却，用anti-Strep-tag特异性抗体进行Western blotting鉴定，结果表明，重组pQM01-chCD40L质粒转染的HEK 293T细胞样品中检测出的目的蛋白条带与预期大小一致(图 5B)。

图 5 Strep-chCD40L重组蛋白表达鉴定 Fig. 5 Identification of Strep-chCD40L recombinant protein expression. (A) Identification of recombinant pQM01-chCD40L by PCR. M: DNA marker Ⅱ; 1: sample of normal HEK 293T cells; 2: sample of HEK 293T cells transfected with pQM01-mcherry plasmid; 3: sample of HEK 293T cells transfected with pQM01-chCD40L plasmid. (B) Identification of recombinant Strep-chCD40L Protein by Western blotting. M: marker; 1: sample of normal HEK 293T cells; 2: sample of HEK 293T cells transfected with pQM01-mcherry plasmid; 3: sample of HEK 293T cells transfected with pQM01-chCD40L plasmid.

图选项

2.4 鸡CD40L蛋白的纯化经SDS-PAGE检测Strep-chCD40L获得较好的纯化效果，蛋白浓度约为0.01 mg/mL (图 6)。

图 6 Strep-chCD40L蛋白浓度的测定 Fig. 6 Determination of Strep-chCD40L protein concentration. M: marker; 1: sample of 0.01 mg/mL BSA; 2: sample of 0.02 mg/mL BSA; 3: sample of 0.025 mg/mL BSA; 4: sample of 0.04 mg/mL BSA; 5: sample of 0.05 mg/mL BSA: 6: sample of 0.1 mg/mL BSA; 7: sample of strep-chCD40L protein.

图选项

2.5 鸡CD40L蛋白的生物活性检测从3周龄SPF鸡的法氏囊组织分离原代细胞，于显微镜下观察到分离的细胞状态良好(图 7)，可用于鸡CD40L蛋白的活性检测。

图 7 鸡法氏囊组织分离的原代细胞 Fig. 7 Primary cells isolated from chicken bursal tissue.

图选项

经Western blotting检测，结果表明，特异性的anti-Strep-tag抗体能够检测到细胞蛋白中的Strep-chCD40L，说明在细胞培养液中添加的Strep-chCD40L蛋白能与原代法氏囊B淋巴细胞的CD40结合(图 8A)。间接免疫荧光试验的结果显示，与Mock组、添加BSA蛋白组及添加Strep-VDAC2蛋白组相比，添加Strep-chCD40L蛋白组可在荧光显微镜下观察到较多的绿色荧光(图 8B)，流式细胞术检测的结果显示，与Mock组、添加BSA蛋白组及添加Strep-VDAC2蛋白组相比，添加Strep-chCD40L蛋白组有更多的细胞表面检测到绿色荧光，说明该蛋白都能与原代法氏囊B淋巴细胞表面的CD40结合，具有生物活性(图 8C–D)。

图 8 鸡CD40L蛋白生物活性的检测 Fig. 8 Determination of biological activity of chicken CD40L. (A) Western blotting. Sample of primary bursal cells cultured in cell culture medium supplemented with 0.5 μg/mL Strep-chCD40L protein (1) or normal cell culture medium (2). (B) Indirect immunofluorescence assay. (C) Flow cytometry. (D) Quantitative analysis of data shown in panel C.

图选项

3 讨论1995年，Graf等发现活化的CD4⁺ T细胞可表达跨膜型及可溶性形式的CD40L^[6]。鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) 主要感染雏鸡的法氏囊B淋巴细胞，但该细胞在体外培养不能连续传递，限制了对IBDV野毒的细胞分离和鉴定。随着对CD40L的深入研究，发现其不仅在调节适应性免疫应答^[7]、抗肿瘤^[8]、作为免疫佐剂^[9]、抗病毒^[10-11]等方面具有重要作用，而且能诱导B淋巴细胞分裂增殖^[2-3]，基于这一特性，可将其应用于B细胞的体外培养，为IBDV野毒的分离和鉴定提供方向。在本研究中我们从鸡的脾脏组织克隆了鸡CD40L基因，通过昆虫杆状病毒表达系统及哺乳动物细胞表达系统表达了His-chCD40L及Strep- chCD40L重组蛋白。
在蛋白的纯化过程中，经检测发现杆状病毒表达系统表达出的His-chCD40L蛋白所带的His标签被折叠进了蛋白内部，因此在非变性情况下无法针对His标签进行纯化，而在HEK 293T细胞中表达的Strep-chCD40L蛋白获得较好的纯化效果，经测定蛋白浓度为0.01 mg/mL。据报道，将CD40L蛋白用于B淋巴细胞体外培养时，浓度为0.5 μg/mL即可发挥促进B淋巴细胞分裂增殖的作用^[3]，因此本研究纯化的蛋白浓度是具有后期应用可行性的。
禽类的法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官, 法氏囊组织中含有大量B淋巴细胞，本研究从3周龄SPF鸡的法氏囊组织分离了原代细胞，由于CD40L是B淋巴细胞上CD40的配体，因此本研究主要通过检测体外表达的CD40L能否与B淋巴细胞上的CD40结合以确定蛋白是否有活性。由于无法使用针对His标签的特异性抗体进行非变性条件下的His-chCD40L蛋白活性检测，因此本研究主要检测了Strep-chCD40L蛋白的活性，即将Strep-chCD40L添加到原代法氏囊细胞培养液中，通过Western blotting试验、间接免疫荧光试验及流式细胞术检测，证明了体外表达的Strep-chCD40L蛋白能够与原代法氏囊细胞中的B淋巴细胞上的CD40结合。具有生物活性的鸡CD40L蛋白的获得为原代B淋巴细胞的体外培养及IBDV野毒的分离与诊断奠定了基础。
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