1. 新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046;
2. 新疆畜牧科学院生物技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830026
收稿日期：2020-08-30；接收日期：2020-11-19；网络出版时间：2021-03-25
基金项目：转基因生物新品种培育重大专项(No. 2014ZX08010-004) 资助
摘要：CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑，但依赖于细胞内的同源重组(Homology directed recombination，HDR) 修复途径，且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing) 通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合，构建了两套碱基编辑系统(Base editors，BE)：胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor，CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor，ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成C > T (G > A) 或A > G (T > C) 的替换，最终实现精准的碱基编辑。目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域，为基础和应用研究提供了强大的技术工具。文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略，以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考。
关键词：CRISPR/Cas9碱基编辑胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器
Recent advances and applications of base editing systems
Xin Xu1, Mingjun Liu2
1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang, China;
2. Institute of Animal Biotechnology, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830026, Xinjiang, China
Received: August 30, 2020; Accepted: November 19, 2020; Published: March 25, 2021
Supported by: National Major Development Program of Transgenic Breeding, China (No. 2014ZX08010-004)
Corresponding author: Mingjun Liu. Tel: +86-991-3075280; Fax: +86-991-3075270; E-mail: xjlmj2006@126.com.
Abstract: The CRISPR system is able to accomplish precise base editing in genomic DNA, but relies on the cellular homology-directed recombination repair pathway and is therefore extremely inefficient. Base editing is a new genome editing technique developed based on the CRISPR/Cas9 system. Two base editors (cytosine base editor and adenine base editor) were developed by fusing catalytically disabled nucleases with different necleobase deaminases. These two base editors are able to perform C > T (G > A) or A > G (T > C) transition without generating DNA double-stranded breaks. The base editing technique has been widely used in gene therapy, animal models construction, precision animal breeding and gene function analysis, providing a powerful tool for basic and applied research. This review summarized the development process, technical advantages, current applications, challenges and perspectives for base editing technique, aiming to help the readers better understand and use the base editing technique.
Keywords: CRISPR/Cas9base editingcytosine base editor (CBE)adenine base editor (ABE)
目前已知的人类致病性突变中，最大的一类是点突变，也称为单核苷酸变异(Single-nucleotide variant，SNV)[1-2]，约2/3人类疾病的发生与此有关[3]。同时，SNV也是影响家畜性状(如生长发育、繁殖力等) 的主要遗传变异[4-5]。因此开发一种精准、高效实现碱基突变的技术对人类健康和动物遗传育种以及遗传基础研究十分重要。
基因编辑是一项功能强大的遗传工程技术，可以在生物体内和体外完成基因组DNA的插入、删除、替换等遗传修饰[6-8]。CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) 系统自2012年发现以来由于其高效、方便和应用广泛等特点，已经成为强大的基因编辑工具[9-11]。Cas9可以通过引导RNA (Single guide RNA，sgRNA) 在目标基因位点产生DNA双链断裂(Double strand break，DSB)，激活细胞内的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ) 或同源重组(Homology directed recombination，HDR) 修复[12]，实现对基因的各种修饰。HDR是一种更为精确的修复方式，可以通过加入修复模板DNA实现单碱基突变，但受细胞周期限制，只发生在细胞的G2期和S期，因此HDR主要在分裂的细胞中发挥作用，甚至在体外培养的细胞系中HDR效率也很低[13-15]。此外，通常情况下NHEJ和HDR两种修复途径同时存在且相互竞争，而且NHEJ效率比HDR高。因此，大多数编辑结果通常会同时发生插入或删除(Insertions or deletions，Indels) 编辑[15-16]。碱基编辑(Base editing) 是自2016年发展起来的基因编辑技术，已成功应用于多种生物，能够高效、精准地诱导DNA和RNA中碱基的替换。通过将不同的碱基修饰酶(脱氨基酶) 与CRISPR-Cas系统结合[17-18]，构建的胞嘧啶碱基编辑器(CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，分别实现了嘧啶碱基(C > T)[19]和嘌呤碱基(A > G) 的转化[20]。
碱基编辑的原理是将失去核酸酶切割活性的Cas9蛋白(Deactivated Cas9，dCas9) 或仅能切割单链产生缺口的Cas9蛋白(Nickase Cas9，nCas9)和作用于单链DNA (Single-stranded DNA，ssDNA)碱基的脱氨酶融合，依靠sgRNA将碱基编辑酶锚定到靶位点。碱基编辑系统结合DNA靶位点后，sgRNA和靶位点DNA通过碱基序列互补配对形成“R环”，产生局部单链DNA (ssDNA)，脱氨酶将“R环”内ssDNA上一定范围内的胞嘧啶(C) 或腺嘌呤(A) 进行脱氨基作用(图 1A和图 2)[21]，经DNA修复或复制，实现精准的C > T或A > G的替换。
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| 图 1 胞嘧啶碱基编辑 Fig. 1 Cytosine base editing. (A) Cytosine base-editing strategy. Cytosine deamination generates uracil, which has the same base pairing preferences as a thymine in the active site of a polymerase. (B) The cellular response to cytosine base editing. AP lyase, DNA (apyrimidinic site) lyase; indel, small insertion or deletion; Mu-GAM, bacteriophage Mu derived Gam protein; NHEJ, non-homologous end joining; UGN, Uracil DNA N-glycosylase; UGI, uracil DNA glycosylase inhibitor. |
| 图选项 |
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| 图 2 腺嘌呤碱基编辑 Fig. 2 Adenine base editing. Adenosine deamination generates inosine, which has the same base pairing preferences as a guanosine in the active site of a polymerase. |
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1 CBE碱基编辑系统APOBEC (Apolipoprotein B mRNA editing enzyme，catalytic polypeptide-like) 家族是目前报道的自然存在可作用于单链DNA的胞嘧啶脱氨酶[22]。2016年，美国哈佛大学David R. Liu实验室率先建立了基于融合大鼠胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1的碱基编辑器(Base editors，BE)[19]。胞嘧啶脱氨酶可以将DNA中的胞嘧啶(C) 脱氨为尿嘧啶(U)，进而通过DNA修复或复制将U转变为胸腺嘧啶(T)，最终实现C > T或G > A的直接替换(图 1A)。第一代碱基编辑器(BE1) 由dCas9和大鼠的APOBEC1组成，BE1 (rAPOBEC1-XTEN-dCas9)可以在体外有效地诱导C > T碱基编辑，脱氨酶的编辑窗口范围约为5 bp，在sgRNA序列的第4–8位(PAM计为第21–23位)。在哺乳动物细胞内使用BE1系统需要解决的最主要问题是如何规避细胞DNA修复系统对已发生脱氨的碱基的修复。BE1在动物细胞内脱氨作用较低(体外脱氨效率为25%–40%，细胞内只有0.8%–7.7%)[19]。脱氨效率大幅度的降低与细胞修复U?G错配碱基对有关[23]，细胞内的尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA N-glycosylase，UNG) 可识别错配U?G碱基对，通过碱基错配修复途径(Base excision repair，BER) 将BE1产生的U?G修复恢复C?G配对[24]。为了抑制UNG功能，Komor等[19]在BE1的C端融合了来源于噬菌体PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)，开发了第二代碱基编辑器BE2 (rAPOBEC1-XTEN- dCas9-UGI)，相较于BE1其编辑效率有所提升。为了提高C > T的转换效率，Komor等又开发了第三代碱基编辑器BE3 (rAPOBEC1-XTEN-nCas9- UGI)，将BE2中的dCas9换成nCas9。由于nCas9能够在非编辑的DNA链上产生缺口，细胞内的错配修复机制(Mismatch repair，MMR) 倾向于以未产生缺口的编辑链为模板进行修复，因此极大地增加了细胞内碱基转换效率[19]。Komor等在BE3的基础上，在C端增加一个拷贝的UGI，同时增加rAPOBEC1和nCas9之间连接短肽的长度(16 aa到32 aa)，开发了第4代碱基编辑器BE4 (rAPOBEC1- XTEN-nCas9-UGI-UGI)，进一步提高了碱基的编辑效率(图 1B)[25]。
2016年Nishida及其同事用胞苷脱氨酶1 (Cytidine deaminase 1，CDA1) 代替APOBEC1，开发了一种与BE系统类似的称为“Target-AID (Activation-induced deaminase)”碱基编辑系统(nCas9-CDA1-UGI)[26]，用于嘧啶碱基替换。Target-AID显示的编辑窗口相对于BE3略有偏移，在sgRNA的第2–4位。哈佛大学George M. Church实验室将锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 的特异性识别单元与人类胞嘧啶脱氨酶hAID (Human activation-induced deaminase) 融合构建了不同于Cas9的碱基编辑系统，这两套系统无PAM结构需求，但C > T转换率很低(大肠杆菌中13%，人类细胞中2.5%)，推测可能是因为ZFN或者TALEN与DNA结合后不能形成ssDNA，脱氨酶结合区域双链DNA (Double-stranded DNA，dsDNA) 严重降低了脱氨酶的催化效率[27]。
美国斯坦福大学Michael C. Bassik实验室开发的基于MS2招募hAID脱氨酶的CRISPR-X系统，可以在基因组有限脱靶情况下产生多个靶位点的突变，通过建立多位点定点突变文库可以同时靶向基因组的多个位点[28]。中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所常兴实验室开发的TAM系统(Targeted AID-mediated mutagenesis)，将dCas9和AID融合在sgRNAs的指导下可完成较大范围(编辑范围宽达100 nt) 的碱基编辑[29]。
2 ABE碱基编辑系统发展人体有6种点突变形式，这6种点突变形式的发生比例是不一样的[2-3]。这种差异主要与体内发生较高频率的自发性胞嘧啶脱氨基(估计每天每细胞大概有100–500次脱氨事件) 有关，如果不进行校正，将有大量的G?C碱基对突变为A?T碱基对[30-31]。因此，能够将A?T碱基对转变为G?C碱基对的分子工具备受关注，因为它能够校正47%的与疾病相关的点突变[2-3]。腺嘌呤(A)与胞嘧啶(C) 一样含有一个环外的氨基，脱氨后会改变其配对形式，腺嘌呤(A) 脱氨后形成肌苷(I) (图 2)，在DNA水平，肌苷会被当作鸟嘌呤(G)进行读码和复制，最终实现A > G的转换[32]。
开发ABE系统时遇到的主要障碍是已知的腺嘌呤脱氨酶都无法作用于ssDNA，尝试过将几种RNA腺嘌呤脱氨酶(大肠杆菌TadA、大鼠ADA、人类ADAR2和人类ADAT2) 直接替换BE3中的APOBEC1构建碱基编辑系统，但均未检测到腺嘌呤(A) 碱基编辑活性[20]，说明天然存在的腺嘌呤脱氨酶需经过改造才能实现对A的编辑。为了克服这个问题，Gaudelli等[20]将大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶TadA改造成了一种能够作用于ssDNA的腺苷脱氨酶。将随机突变的TadA序列与编码dCas蛋白的序列融合构建随机突变文库，通过恢复抗性基因的功能，筛选获得能够作用于ssDNA的突变体TadA*。将野生型的TadA构建到TadA*-dCas9中(TadA-TadA*-nCas9)，与TadA*形成异源二聚体极大地提高了哺乳动物细胞中A > G转换效率。ABE系统经过7轮改造，筛选到了效率较高的ABE版本ABE7.10，其有效编辑窗口在sgRNA的第4–7位。不同版本的ABE，如ABE7.9或ABE6.3，在靠近PAM的位置(第8位或第9位) 会有更高的编辑效率。ABE的应用受到脱氧腺苷脱氨酶与SpCas9以外Cas同系物的有限兼容性限制，Richter等使用噬菌体辅助的非连续和连续进化(Phage-assisted non-continuous and continuous evolution，PANCE和PACE) 继续改进ABE7.10的脱氨酶组分，从而产生了目前编辑效率最高的ABE版本：ABE8e。与ABE7.10相比，ABE8e包含8个额外的突变，可将活性(kapp) 提高590倍，且与各种Cas9或Cas12同源物配对时，可以大大提高编辑效率[33]。Lapinaite等通过冷冻电镜首次解析了ABE结合DNA的3D结构，发现ABE8e比早期版本的ABE编辑效率高是因为ABE8e中的突变使得蛋白能够稳定DNA的构象，加快了A > G转变效率[34]。
3 碱基编辑系统存在的问题及解决办法3.1 编辑产物的纯度CBE的最初几项研究结果显示，在基因组某些位点观察到C > R (G或A) 的转换，C > R的碱基转变降低了碱基编辑产物纯度[35-37]。Komor等通过在缺少UNG基因的细胞中进行胞嘧啶碱基编辑实验，发现UNG缺失的细胞中，12个靶位点胞嘧啶的产物纯度从平均68%提高到 > 98%，这表明UNG是影响编辑产物纯度的重要因素[25]。BE4在BE3的结构上增加了一个拷贝的UGI，可提高含有UNG细胞系的编辑产物纯度。过表达UGI也可以提高BE3编辑的产物纯度[37]，但会导致整个细胞内C > T突变率的增加[38]。
ABE系统的腺嘌呤碱基编辑产物纯度非常高。目前为止，尚无报道显示有A > Y (T或C) 编辑事件发生[39-41]，可能是因为细胞从基因组DNA中去除肌苷(I) 的能力比去除尿嘧啶(U) 的能力弱得多。已知烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(Alkyl adenine DNA glycosylase，AAG；也被称为MPG)可识别并去除DNA中的肌苷[42]，但在AAG缺乏的细胞中使用ABEs，并不能提高其编辑效率[20]。
3.2 产生IndelsCBE碱基编辑会产生低频率的Indels，是因为细胞内的UNG能够将U切除，形成一个无嘧啶位点(Apyrimidinic site，AP)，AP位点会在AP裂解酶的作用下在编辑链产生一个缺口[43]，进而与nCas9在非编辑链产生的切口刚好形成一个DSB，之后进入易产生Indels的NHEJ修复途径。Komor等发现，UNG敲除的细胞除了编辑产物纯度提高外，Indels的发生率也减少了。Komor等将噬菌体Mu衍生的Gam蛋白(Mu-GAM)与BE4融合以生成BE4-Gam。BE4-Gam相对于BE4可以进一步减少HEK293T细胞中的Indels发生率，因为Gam蛋白可以结合在DSB的末端防止其降解，进而阻止NHEJ的发生[25]。在兔子胚胎实验中，BE4-Gam相较于BE3可以显著降低Indels发生率并提高编辑产物纯度[44]。
在细胞系[45-46]、小鼠[41]和植物[47]的实验中，ABE系统Indels的发生率很低，普遍低于1%，有些实验中甚至未检测到Indels。ABE产生较少的Indels是因为缺少DNA修复所需的糖苷酶，因此不会将I切除并在DNA编辑链产生切口[20]。由于细胞内I被切除的效率要远远低于U，所以在编辑链产生的切口也更少，因此ABE比CBE具有更低的Indels发生率。
3.3 编辑窗口及邻近位点编辑BE3系统中脱氨酶的有效编辑窗口在第4–8位[19]，但位于编辑窗口外部ssDNA R环区域内的其他碱基仍有可能以较低的频率发生编辑。编辑窗口内存在多个可编辑的C或A时，会导致除了目标碱基外其他碱基发生编辑。用“邻近碱基编辑(Bystander editing)”一词来描述那些在sgRNA区域内除靶位点外发生的碱基编辑事件。当碱基编辑的目的是破坏启动子、mRNA剪接位点或其他调控序列，或者是引入提前终止密码子时，非CDS区域邻近碱基编辑的发生可能是无关紧要的。但当编辑功能蛋白基因CDS区时，编辑窗口内非靶标碱基的编辑，会导致靶蛋白结构和功能改变，尤其对基因治疗产生风险。
David R. Liu和他的同事对CBE进行改造，在rAPOBEC1的功能域中引入突变，减弱了rAPOBEC1的脱氨活性，导致编辑器的编辑效率降低和编辑窗口变窄(YE1-BE3，YE2-BE3和YEE-BE3)。rAPOBEC1的编辑窗口由原来的5 nt缩小至1–2 nt[48]，这些编辑窗口变窄的CBE编辑器可以在编辑窗口内选择靶位点的C进行编辑而不会编辑邻近的C。Tan等通过缩短BE3中脱氨酶与nCas9之间的连接短肽开发的BE3-PAPAPAP，以及通过截短PmCDA1脱氨酶羧基端序列而建立的一系列nCDA1-BE3版本，在保证对靶标C编辑效率依然高效的同时，可有效将编辑窗口缩小到1–2 nt[49]。
但是，有些研究需要用到编辑窗口范围较宽的碱基编辑器，如筛选功能基因、定位蛋白结构域关键氨基酸位点等。ABE7.10编辑窗口大约位于sgRNA的第4–7位，而ABE7.9或ABE6.3可在第4–9位进行编辑。Jiang等[50]开发了BE-PLUS系统，将BE3的编辑窗口由5 nt (4–8) 拓宽至13 nt (4–16)。基于融合hA3A胞嘧啶脱氨酶的碱基编辑器在人类细胞及植物中脱氨化的窗口可分别宽达14 nt (2–13) 和17 nt (1–17)[51-52]。而CP1020-CBEmax和CP1028-CBEmax的编辑窗口可覆盖sgRNA的8–9 nt[53]。
3.4 PAM序列限制来自酿脓链球菌Streptococcus pyogenes的Cas9 (SpCas9) 是目前应用广泛的核酸酶，它识别的PAM序列为NGG，只有约26%的致病性SNP可以被SpCas9及其衍生的碱基编辑器编辑。使用来源于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Cas9 (SaCas9) 以及SpCas9和SaCas9的突变体构建的一系列编辑器，如SaBE3、Sa (KKH)-BE3、VQR-BE3、VRER-BE3和EQR BE3，能够识别非NGG的PAM序列[48]。Chen实验室使用Cas12a (即Cpf1) 开发了一套CBE系统，识别的PAM序列为TTTV (V可以是A、C或G)，这一系统适用于富含T的基因组DNA[54]。Liu实验室改造的xCas9 (3.7) 替换BE3中的SpCas9构建xBE3系统，使其能够在PAM序列为NGN、GAA和GAT目标位点发生编辑[55]。Nureki实验室开发的SpCas9-NG能够识别PAM序列为NGN的位点[56]。最近，Russell及其同事开发出了几乎没有PAM序列限制的SpRY，实验发现融合SpRY的碱基编辑器几乎能够识别所有的PAM位点，并且在PAM序列为NRN (R为A或G) 的靶位点编辑活性要高于PAM序列为NYN (Y为C或T) 的靶位点[57]。SpRY的出现使消除PAM序列限制成为可能。
另外，识别不同PAM的Cas9及突变体(SaCas9[48]、Sa(KKH)Cas9、Sp(VQR)Cas9和Sp(VRER)Cas9[58-59]) 也被开发出来用于不同的ABE碱基编辑器。这些编辑器的产生极大地增加了ABE的编辑范围。
3.5 编辑序列背景依赖性在某些包含GC序列的位点，rAPOBEC1的脱氨效率不高[19, 25]。CpG处的DNA甲基化可降低rAPOBEC1介导的碱基编辑效率，但人APOBEC3A (hA3A) 可以更有效编辑CpG中的C，且编辑效率比rAPOBEC1高[53]。Joung实验室利用不同胞嘧啶脱氨酶的序列偏好性，设计了基于突变体hA3A的CBE。该CBE对TC中的C具有偏好性[60]，并且可减少邻近碱基编辑事件发生。进一步对hA3A脱氨酶的突变体进行筛选和结构改造，产生了含有单个突变(N57G) 的加强版的突变体(eA3A)，能够编辑TC中的C，极大地降低了其他序列背景下C的编辑活性。
目前为止，哺乳动物细胞ABE7.10编辑的结果显示，在人细胞中ABE7.10发生编辑时没有序列背景依赖性[20]，但是Kim和他同事的研究结果显示，在拟南芥中ABE7.10表现出了一定的编辑偏好性，相较于GA、CA或AA序列，ABE7.10会优先选择编辑TA中的A[47]。
3.6 碱基编辑脱靶效应与CRISPR/Cas9系统一样，BE系统也会产生脱靶效应[19-20]。BE系统产生的脱靶分为可预测脱靶和不可预测脱靶，可预测脱靶一般与以下几个原因有关：第一，sgRNA具有一定的容错性，允许sgRNA与ssDNA之间存在个别碱基的错配，脱靶效应的高低与sgRNA和ssDNA之间错配碱基数目有关。利用缩短的sgRNA (gX18或gX17)或延长的sgRNA (gX20或ggX20) 均可在保持BE系统编辑效率的前提下降低其脱靶效应[34, 61]。第二，Cas9核酸酶的非特异性，BE的DNA靶向功能是由Cas9蛋白决定的，因此在研究BE的脱靶编辑时利用深度测序法重点检测了那些Cas9能够编辑的基因位点[19-20, 48]。结果显示，Cas9的脱靶位点如果含有C且在脱氨酶活性窗口内，就会在CBE的作用下发生较低效率的编辑。因为并不是所有Cas9的脱靶位点都含有可编辑的C，所以使用相同的sgRNA，CBE的脱靶效应要比相对应的Cas9低。为了降低CBE的脱靶效应，Kleinstiver等通过在Cas9中引入能够提高其保真度的突变，构建了具有高保真度的CBE系统(HF-BE3)[62]。与原始的CBE相比，HF-BE3即使与容错率很高的sgRNA配对也能够显著降低脱靶效率。Lee等通过引入不同的突变建立具有高保真度的Sniper- BE3能够明显改善CBE系统的脱靶效应[63]。Liang等使用噬菌体来源的anti-CRISPR蛋白AcrIIA5也可以降低BE3和ABE7.10的脱靶效率[64]。第三，脱氨酶和Cas9融合蛋白在细胞内高浓度、长时间的表达也容易造成脱靶效应。可以利用碱基编辑器与sgRNA形成的核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP) 取代其DNA表达形式直接转化细胞，减少BE作用时间，从而降低脱靶效应[61]。使用相同的sgRNA，ABE脱靶效应远远低于Cas9，甚至比BE3都少[19-20]。
BE系统不可预测脱靶效应与脱氨酶和UGI的过表达有关。脱氨酶作用于ssDNA，在DNA转录、复制的过程中会形成大量的ssDNA区域，这些区域会成为潜在的脱靶位点。另外，细胞内存在大量天然的C > U突变，UGI的过表达阻断了U?G错配修复机制，增加了C > T转化率。有研究表明，在酵母及人类细胞系过表达不同胞嘧啶脱氨酶或UGI，会导致基因组内C > T SNVs的增加[65-66]。因此传统的脱靶预测软件(Digenome-seq、EndoⅧ或Endo Ⅴ-seq) 并不能真实有效地评估细胞内碱基脱靶水平，全基因组测序(WGS) 是检测细胞基因组中所有类型碱基脱靶编辑的最佳手段。杨辉实验室利用GOTI (Genome-wide off-target analysis by two-cell injection) 技术结合WGS比较突变位点，发现BE3在小鼠体内引发了比自发突变高20倍的C > T单核苷酸变异。相反，ABE系统几乎没有脱靶的A > G单核苷酸变异，说明ABE相较于CBE具有很高的特异性[67]。同一时期，高彩霞课题组发现BE3和HF1-BE3能够引起水稻全基因组水平C > T SNVs的增加[68]。并且以上两项研究均显示，C > T SNVs均匀分布在染色体间，但明显富集在转录活跃区。该现象是否会出现在融合了其他脱氨酶的CBE系统中还有待进一步的研究。近期，高彩霞课题组改造的BE3突变体A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，经验证不仅可以提高靶位点编辑的特异性，还可以在水稻全基因组水平上消除sgRNA非依赖的脱靶效应[69]。以上研究提示WGS应用到碱基脱靶检测中具有很大的优势，能够更加准确地评估碱基脱靶效应。出现的这些问题同时提醒现阶段将碱基编辑系统应用于疾病治疗等精准改造方面仍具有一定的风险，需要科研工作者开发出更加精准安全的BE系统。
早期研究报道，无论是胞嘧啶脱氨酶还是嘌呤嘧啶脱氨酶都可作用于RNA，因此BE系统有可能在RNA水平产生脱靶效应。2019年，Grünewald等率先证明了BE3和ABE系统在人类细胞系转录组水平存在严重的脱靶效应[70]。其中，BE3可在大部分表达基因的RNA中诱导C > U编辑，某些RNA中突变频率甚至可达100%；而ABEmax在RNA水平对碱基A的脱靶编辑效率也可高达100%[70]。同一时期，杨辉实验室定量检测了CBEs和ABEs在RNA水平诱导的单核苷酸变异，结果发现BE3和ABE7.10都能产生数以万计非靶向的RNA突变[71]。对于碱基编辑系统在RNA水平的严重脱靶现象，目前主要的解决方案是通过改造脱氨酶产生突变体，即控制脱氨酶与RNA的活性结合位点从而降低对RNA的编辑效率。基于此，Keith Joung实验室开发的BE3-R33A和BE3-R33A/K34A突变体可将BE3对RNA的编辑分别降低390倍和3 800倍[70]。杨辉实验室开发的BE3 (W90Y+R126E)、hA3A (R128A) 和hA3A (Y130F) 可直接将BE脱靶率降至本底水平；针对ABE系统也开发了两种ABE突变体ABE7.10 (D53E) 和ABE7.10 (F148A)，其中ABE7.10 (F148A) 甚至可直接消除ABE系统在转录组水平的脱靶效应[71]。David R. Liu实验室开发的ABEmaxAW (TadA E59A，TadA* V106W) 和ABEmaxQW (TadA E59Q，TadA* V106W) 可在保证一定的DNA编辑效率的同时，降低在RNA水平的脱靶效应[72]。
4 碱基编辑器应用4.1 碱基编辑用于人类基因治疗目前已知的人类遗传病大部分都是由点突变引起的，而CBE和ABE系统可以纠正约60%的致病性点突变[2-3]。Komor等将BE3以质粒的形式转染小鼠星形胶质细胞，可以将与阿尔茨海默病相关的等位基因APOE4转化为APOE3r，并可以纠正乳腺癌细胞中与癌症相关的p53基因突变(Y163C)[19]。将密码子优化的CBE以质粒形式递送至患者来源的成纤维细胞中，可以纠正引起1f型先天性糖基化障碍的MPDU1基因中L119P突变[46]。Gaudelli等发现ABE7.10可以纠正永生化患者来源的LCL细胞中遗传性血色病引起的突变(C282Y)，并且可以在成人细胞中制造增加胎儿血红蛋白(HBG) 表达的突变[20]。Kim等使用ABE7.10纠正肌营养不良小鼠模型中肌营养不良蛋白基因(Dmd) 的提前终止密码子，尽管在所有测序细胞中校正率仅为3.3%，但肌营养不良蛋白在17%的肌纤维中恢复表达[37]，表明低水平的编辑通常也会产生治疗上相关的表型改变。另外，Chadwick等利用BE3在鼠Pcsk9基因中产生W159X终止密码子突变，发现肝细胞编辑效率约25%，并观察到4周后血浆PCSK9蛋白水平和血浆胆固醇明显降低[73]。除了基因治疗，碱基编辑还可用于制造动物疾病模型。Lapinaite等利用FNLS-BE3在Ctnnb1中产生与癌症相关的突变(S45F)，发现在肝细胞中碱基编辑效率接近100%，并且与对照相比，FNLS-BE3编辑的小鼠生长了大量可见肿瘤结节[34]。Zhang等利用BE3在斑马鱼tyr基因中产生P302S突变，模拟人类常见的眼白化病，这种方法可以研究P302S突变对眼部色素沉淀的影响[74]。这些研究提示我们碱基编辑器有望成为潜在的点突变疾病治疗方法，并且是研究细胞和体内精准遗传突变表型效应的有效方法。
4.2 CBE引入提前终止密码子CBE可以通过精确的碱基编辑在需要的位置制造终止密码，在不产生DSB的情况下达到敲除基因的目的。Kim等率先使用BE3在小鼠胚胎的Dmd基因引入提前终止密码子建立肌营养不良小鼠疾病模型，证明了此方法的可行性[37]。最近建立的CRISPR-Stop[75]和iSTOP[76]方法，实现了BE3介导的基因失活。Billon等建立了一个sgRNA数据库，与BE3结合使用，理论上能够在人类基因组大于98.6%的开放阅读框中产生提前终止密码子(参考基因组为GRCh38)；他们公布了一个可免费访问的在线数据库，使研究人员能够找到合适的sgRNA，在包括人类、小鼠和拟南芥等8个物种中使用iSTOP方法[76]。Kuscu等发现，与Cas9敲除基因相比，此策略可显著降低细胞凋亡[75]，这可能是由于DSB可诱导较低的细胞毒性[77-79]。尽管NHEJ介导的基因敲除法被广泛利用，但此方法会产生许多其他编辑类型的细胞，包括DNA易位和重排[80]，甚至会导致细胞死亡[77-79]，原则上通过使用碱基编辑器产生终止密码子可避免这些问题。
4.3 调节mRNA可变剪接mRNA可变剪接是转录后基因重要的调控过程，外显子剪接过程中的重要步骤是通过剪接体机制识别外显子和内含子的高度保守的序列。几乎每个内含子都以G结束，基于此，Gapinske等利用CBE将互补链的C转变为T，从而导致内含子上的G转变为A，破坏高度保守的剪接受体序列(5′-AG-3′)，导致外显子“跨越”[81]，此方法被称为CRISPR-SKIP。常兴实验室利用TAM系统在人类细胞中实现了目前存在的4种mRNA剪接形式的改变，并且通过编辑Dmd基因的剪接位点，实现了目标外显子的完全跨越，在所有表达TAM的细胞中修复了心肌细胞的缺陷[82]。中山大学李剑峰实验室利用BE3在拟南芥和水稻中建立了有效的mRNA可变剪接体系[83]。高彩霞实验室利用BE3在拟南芥中对AtAct2基因5′ UTR区的内含子剪接位点处进行突变，发现利用该方法可高效地改变mRNA剪接形式[84]。
4.4 胚胎碱基编辑构建动物模型在单细胞胚胎阶段进行基因组编辑的主要目标是产生模型生物。由于核酸酶介导的编辑策略通常无法在F0代中产生纯合子后代[85-86]，因此高效的碱基编辑为解决此问题提供了一种有吸引力的选择。Kim等利用BE3在单细胞阶段小鼠胚胎编辑基因Tyr的Q68X和Dmd的Q871X，建立了白化病和肌营养不良小鼠模型[37]。Wang等使用BE4max构建了早衰症(Hutchinson-gilford progeria syndrome，HGPS) 猴子模型[87]。Liu等通过将BE3、BE4-Gam或ABE7.10的mRNA注入囊胚中建立了哈钦森-吉尔福德早衰综合征的兔子模型[44]。Huang及其同事通过在单细胞小鼠胚胎中共同注射ABE7.10和SaBE3 mRNA以及sgRNAs进行多重碱基编辑，囊胚中同时观察到A > G和C > T的编辑[88]。Zhang等在小鼠胚胎共同注射两个不同的sgRNA，可在F0代中同时产生两个可遗传的A > G点突变[89]。Yang等利用ABE7.10建立了因Fah突变引起的Ⅰ型酪氨酸血症小鼠模型，并且该研究也证实SaKKH-ABE和VQR-ABE两种编辑器同样可在小鼠中产生有效的A > G突变[59]。这些数据表明碱基编辑是构建动物模型的有效手段，为进行临床疾病治疗奠定了坚实的基础。
4.5 家畜碱基编辑家畜中许多遗传性状都是SNP造成的，生物医学中许多遗传疾病也是由点突变引起的，因此碱基编辑在获得家畜优良性状以及建立人类疾病的动物模型方面有巨大优势。Li等在猪胚胎成纤维细胞中利用BE3编辑Twist2基因和TYR基因，然后通过体细胞核移植的方法建立了无脸巨口综合征和皮肤白化病的疾病模型[90]；赖良学实验室在猪中首次实现了多个基因靶点的同时C > T突变，并建立了相应的疾病模型[91]。Zhou等和Li等利用BE3编辑SOCS2和FGF5基因，成功获得了体重、体尺和毛长等生长指标增加的突变体羊[92-93]；笔者实验室利用xBE4和xABE系统在体外胚胎中成功编辑了与绵羊繁殖性状相关的FecB (A746G)、BMP15 (C950T) 和GDF9 (C1184T) 基因的SNP位点，以及FGF5基因提前终止的位点(C232T，CAG > TAG)，并获得了相应靶位点突变的囊胚。以上实验表明，碱基编辑技术可用于家畜遗传性状的改良及大动物遗传疾病模型的建立。
4.6 植物碱基编辑植物碱基编辑可以高效、快速产生新的植物突变体[94]。精确的功能获得性点突变可以改良许多农艺性状，例如植物ALS基因中的点突变能够产生对磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物除草剂的抗性[95]。利用CBE和ABE已在多种具有农学意义的植物中完成了碱基编辑。Gao和他的同事证明，BE3可以在玉米、水稻和小麦中产生有效的点突变[96]。在另一项研究中，Kondo及其同事发现，Target-AID编辑器能够有效地编辑水稻和番茄[97]。Zhou和Zhu实验室的两项独立研究报告表明，ABE在水稻中能够产生高效的碱基编辑[39-40]。Kim和他的同事通过农杆菌介导将ABE7.10转染到拟南芥和甘蓝型油菜中而产生两个表型变化[47]；他们使用植物优化的表达系统，在拟南芥FT蛋白中产生Y85H突变，从而导致迟花表型；破坏PDS3中的剪接受体位点，产生矮表型植株。转化后，超过85%的T1植物显示出 > 50%的编辑效率，并且从T1植物中分离的T2幼苗也显示出相同的表型，表明该编辑是可遗传的[47]。高彩霞实验室利用基于rAPOBEC1的PBE系统在水稻、小麦和玉米原生质体中实现了多个基因的编辑，并获得了突变效率高达45.8%的相应突变体植株[97]；并利用PBE系统编辑小麦TaALS和TaACCase基因，创制了一系列抗除草剂小麦新种质[98]。
以上研究表明，碱基编辑是快速改造多倍体植物基因组的有效方法。从监管和消费者的角度出发，将碱基编辑器以RNP的形式转入农作物将有重要意义，因为BE若以质粒的形式转染存在转基因整合问题，会给农作物贴上GMO的标签。碱基编辑器以RNP的形式转染农作物，提供的将是无外源DNA的精确编辑，从而可以避免GMO产生的生物安全问题[95]。
5 总结与展望以往在生物体单个碱基水平上高效地完成遗传信息改变似乎是不可能的，碱基编辑器的出现使这一想法成为现实。目前为止，已报道有两类DNA碱基编辑器可有效地在各种细胞和生物体的基因组中进行精准的点突变，但CBE和ABE目前仅能够完成碱基对6种改变中的两种改变(C > T，A > G)。Sakata等将胞嘧啶脱氨酶PmCDA1和腺嘌呤脱氨酶TadA同时与nCas9融合，构建了Target-ACE系统，能够同时在靶位点完成C > T和A > G的改变[99]。Kurt等最近构建两套的C > G碱基编辑器(C > G base editors，CGBE)：CGBE1和miniCGBE1能够在人类细胞系中完成C > G编辑[100]，CGBE的出现进一步扩大了BE系统的应用范围。除了BE系统，最新建立的PE基因编辑系统(Prime editing) 能够完成全部类型的碱基转换[101]，虽然在传统的编辑窗口内(第4–8位) PE系统的编辑效率低于BE系统，但在编辑窗口外PE系统的编辑效率要高于BE系统；而且，PE系统碱基编辑的精准性要高于BE，编辑窗口内不会出现非靶碱基的编辑。BE系统和PE系统互有所长，当靶位点编辑窗口内只有一个可编辑位点时(A或C)，选择BE系统；当编辑窗口内有多个可编辑位点(A或C) 或需要完成碱基颠换时，选择PE系统。目前而言，PE系统还无法完全替代BE系统完成碱基编辑，还需要大量的实验检验PE系统的可靠性。
从目前BE系统应用于绵羊的碱基编辑工作来看，若编辑窗口内存在多个A或C，临近位点发生脱靶编辑似乎不可避免，且CBE系统还会在靶位点附近造成大量的Indels[92-93]。笔者实验室前期绵羊体外胚胎实验发现，xCas9 (3.7)-ABE (7.10) 系统可以将FecB基因sgRNA第2–7位A转变为G，且A743G的编辑效率远高于靶位点A746G；xCas9 (3.7)-BE4系统有机会将BMP15靶位点临近的C都转变为T，每次发生的都是多个C的编辑事件，且Indels发生率高；在GDF9的C1184T位点比较了xCas9 (3.7)-BE4系统和SpCas9介导的HDR方法完成精准编辑的情况，发现SpCas9介导的HDR虽然会发生一定概率的Indels，但其精准编辑效率远高于xCas9 (3.7)-BE4系统。综上所述，笔者认为想要完成精准碱基编辑需要关注两点：一是BE系统的选择，要选择编辑效率高、编辑窗口相对较窄、Indels发生率低的BE系统；二是不要单纯依赖BE系统，针对不同的靶位点可以通过比较选择合适的编辑方式：BE系统、Cas9介导的HDR或是PE系统。笔者实验室的研究着重应用于生产与实践，所以今后能够完成特异性和精准性的碱基编辑方式是实验室的关注重点。
碱基编辑技术发展的目标是在尽可能提高碱基编辑效率和靶向范围的同时，最大程度地减少脱靶，使其能够应用到更复杂的研究中。对于绝大多数碱基编辑而言，目标序列都是固定的，碱基编辑未来的发展着眼于如何提高碱基编辑的特异性和精确性。针对CBE全基因组的脱靶效应，需要开发更多的新的CBE系统，在不影响靶位点编辑效率的同时，尽可能降低全基因组脱靶编辑效率，提高BE系统的安全性。
总之，碱基编辑技术在生命科学基础研究、人类疾病治疗和生物育种等领域具有广阔的应用前景，该技术的不断革新将会推动各领域的快速发展。
参考文献
| [1] | Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet, 2016, 17(6): 333-351. |
| [2] | Landrum MJ, Lee JM, Benson M, et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res, 2016, 44(D1): D862-D868. DOI:10.1093/nar/gkv1222 |
| [3] | Landrum MJ, Lee JM, Riley GR, et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Res, 2014, 42(D1): D980-D985. DOI:10.1093/nar/gkt1113 |
| [4] | 田志龙, 王玉琴, 储明星. 绵羊多羔候选基因的研究及应用进展. 中国草食动物科学, 2018, 38(3): 43-48, 57. Tian ZL, Wang YQ, Chu MX. Review on prolific candidate genes in sheep (Ovis aries). China Herbivore Science, 2018, 38(3): 43-48, 57 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2018.03.010 |
| [5] | 宋志芳, 石岗. 利用GWAS研究母猪繁殖性状的进展. 猪业科学, 2019, 36(3): 104-106. Song ZF, Shi G. Progress on reproductive traits of sows by using GWAS. Swine Industry Science, 2019, 36(3): 104-106 (in Chinese). |
| [6] | Kim JS. Genome editing comes of age. Nat Protocols, 2016, 11(9): 1573-1578. DOI:10.1038/nprot.2016.104 |
| [7] | Bak RO, Natalia GO, Porteus MH. Gene editing on center stage. Trends Genet, 2018, 34(8): 600-611. DOI:10.1016/j.tig.2018.05.004 |
| [8] | Urnov FD, Genome Editing B.C.. (Before CRISPR): Lasting LESSONS from the "Old Testament". CRISPR J, 2018, 1(1): 34-46. DOI:10.1089/crispr.2018.29007.fyu |
| [9] | Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262-1278. DOI:10.1016/j.cell.2014.05.010 |
| [10] | Komor AC, Badran AH, Liu DR. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell, 2017, 168(1/2): 20-36. |
| [11] | Knott GJ, Doudna JA. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science, 2018, 361(6405): 866-869. DOI:10.1126/science.aat5011 |
| [12] | Ceccaldi R, Rondinelli B, D'Andrea AD. Repair pathway choices and consequences at the double-strand break. Trends Cell Biol, 2016, 26(1): 52-64. DOI:10.1016/j.tcb.2015.07.009 |
| [13] | Chapman JR, Taylor MRG, Boulton SJ. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell, 2012, 47(4): 497-510. DOI:10.1016/j.molcel.2012.07.029 |
| [14] | Cox DBT, Platt RJ, Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nat Med, 2015, 21(2): 121-131. DOI:10.1038/nm.3793 |
| [15] | Paquet D, Kwart D, Chen A, et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature, 2016, 533(7601): 125-129. DOI:10.1038/nature17664 |
| [16] | Steven L, Staahl BT, Alla RK, et al. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife, 2014, 3: e04776. |
| [17] | Harris RS, Liddament MT. Retroviral restriction by APOBEC proteins. Nat Rev Immunol, 2004, 4(11): 868-877. DOI:10.1038/nri1489 |
| [18] | Yang B, Li XS, Lei LQ, et al. APOBEC: from mutator to editor. J Genet Genom, 2017, 44(9): 423-437. DOI:10.1016/j.jgg.2017.04.009 |
| [19] | Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420-424. DOI:10.1038/nature17946 |
| [20] | Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551(7681): 464-471. DOI:10.1038/nature24644 |
| [21] | Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014, 156(5): 935-949. DOI:10.1016/j.cell.2014.02.001 |
| [22] | Harris RS, Petersen-Mahrt SK, Neuberger MS. RNA editing enzyme APOBEC1 and some of its homologs can act as DNA mutators. Mol Cell, 2002, 10(5): 1247-1253. DOI:10.1016/S1097-2765(02)00742-6 |
| [23] | Kunz C, Saito Y, Sch?r P. DNA repair in mammalian cells — mismatched repair: variations on a theme. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(6): 1021-1038. DOI:10.1007/s00018-009-8739-9 |
| [24] | Pearl LH. Structure and function in the uracil-DNA glycosylase superfamily. Mutat Res, 2000, 460(3/4): 165-181. |
| [25] | Komor AC, Zhao KT, Packer MS, et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C: G-to-T: A base editors with higher efficiency and product purity. Sci Adv, 2017, 3(8): eaao4774. DOI:10.1126/sciadv.aao4774 |
| [26] | Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353(6305): aaf8729. DOI:10.1126/science.aaf8729 |
| [27] | Yang LH, Briggs AW, Chew WL, et al. Engineering and optimising deaminase fusions for genome editing. Nat Commun, 2016, 7: 13330. DOI:10.1038/ncomms13330 |
| [28] | Hess GT, Frésard L, Han K, et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1036-1042. DOI:10.1038/nmeth.4038 |
| [29] | Ma YQ, Zhang JY, Yin WJ, et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1029-1035. DOI:10.1038/nmeth.4027 |
| [30] | Krokan HE, Drabl?s F, Slupphaug G. Uracil in DNA — occurrence, consequences and repair. Oncogene, 2002, 21(58): 8935-8948. DOI:10.1038/sj.onc.1205996 |
| [31] | Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 1993, 362(6422): 709-715. DOI:10.1038/362709a0 |
| [32] | Yasui M, Suenaga E, Koyama N, et al. Miscoding properties of 2'-deoxyinosine, a nitric oxide-derived DNA adduct, during translesion synthesis catalyzed by human DNA polymerases. J Mol Biol, 2008, 377(4): 1015-1023. DOI:10.1016/j.jmb.2008.01.033 |
| [33] | Richter MF, Zhao KT, Eton E, et al. Author correction: phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nat Biotechnol, 2020, 38(7): 901. |
| [34] | Lapinaite A, Knott GJ, Palumbo CM, et al. DNA capture by a CRISPR-Cas9-guided adenine base editor. Science, 2020, 369(6503): 566-571. DOI:10.1126/science.abb1390 |
| [35] | Zhang H, Pan H, Zhou CY, et al. Simultaneous zygotic inactivation of multiple genes in mouse through CRISPR/Cas9-mediated base editing. Development, 2018, 145(20): dev168906. |
| [36] | Yang H, Wang HY, Shivalila CS, et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 154(6): 1370-1379. DOI:10.1016/j.cell.2013.08.022 |
| [37] | Kim K, Ryu SM, Kim ST, et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 435-437. DOI:10.1038/nbt.3816 |
| [38] | Wang LJ, Xue W, Yan L, et al. Enhanced base editing by co-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor. Cell Res, 2017, 27(10): 1289-1292. DOI:10.1038/cr.2017.111 |
| [39] | Hua K, Tao XP, Yuan FT, et al. Precise A·T to G·C base editing in the rice genome. Mol Plant, 2018, 11(4): 627-630. DOI:10.1016/j.molp.2018.02.007 |
| [40] | Yan F, Kuang YJ, Ren B, et al. Highly efficient A·T to G·C base editing by Cas9n-guided tRNA adenosine deaminase in rice. Mol Plant, 2018, 11(4): 631-634. DOI:10.1016/j.molp.2018.02.008 |
| [41] | Ryu SM, Koo T, Kim K, et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol, 2018, 36(6): 536-539. DOI:10.1038/nbt.4148 |
| [42] | Lau AY, Wyatt MD, Glassner BJ, et al. Molecular basis for discriminating between normal and damaged bases by the human alkyladenine glycosylase, AAG. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(25): 13573-13578. DOI:10.1073/pnas.97.25.13573 |
| [43] | Kouzminova EA, Kuzminov A. Patterns of chromosomal fragmentation due to uracil-DNA incorporation reveal a novel mechanism of replication-dependent double-stranded breaks. Mol Microbiol, 2008, 68(1): 202-215. DOI:10.1111/j.1365-2958.2008.06149.x |
| [44] | Liu ZQ, Chen M, Chen SY, et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nat Commun, 2018, 9: 2717. DOI:10.1038/s41467-018-05232-2 |
| [45] | Yeh WH, Chiang H, Rees HA, et al. In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nat Commun, 2018, 9: 2184. DOI:10.1038/s41467-018-04580-3 |
| [46] | Koblan LW, Doman JL, Wilson C, et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol, 2018, 36(9): 843-846. DOI:10.1038/nbt.4172 |
| [47] | Kang BC, Yun JY, Kim ST, et al. Precision genome engineering through adenine base editing in plants. Nat Plants, 2018, 4(7): 427-431. DOI:10.1038/s41477-018-0178-x |
| [48] | Kim YB, Komor AC, Levy JM, et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat Biotechnol, 2017, 35(4): 371-376. DOI:10.1038/nbt.3803 |
| [49] | Tan JJ, Zhang F, Karcher D, et al. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun, 2019, 10: 439. DOI:10.1038/s41467-018-08034-8 |
| [50] | Jiang W, Feng SJ, Huang SS, et al. BE-PLUS: a new base editing tool with broadened editing window and enhanced fidelity. Cell Res, 2018, 28(8): 855-861. DOI:10.1038/s41422-018-0052-4 |
| [51] | Zong Y, Song QN, Li C, et al. Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 950-953. DOI:10.1038/nbt.4261 |
| [52] | Wang X, Li JN, Wang Y, et al. Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 946-949. DOI:10.1038/nbt.4198 |
| [53] | Huang TP, Zhao KT, Miller SM, et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nat Biotechnol, 2019, 37(6): 626-631. DOI:10.1038/s41587-019-0134-y |
| [54] | Li XS, Wang Y, Liu YJ, et al. Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2018, 36(4): 324-327. DOI:10.1038/nbt.4102 |
| [55] | Hu JH, Miller SM, Geurts MH, et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018, 556(7699): 57-63. DOI:10.1038/nature26155 |
| [56] | Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 2018, 361(6408): 1259-1262. DOI:10.1126/science.aas9129 |
| [57] | Walton RT, Christie KA, Whittaker MN, et al. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science, 2020, 368(6488): 290-296. DOI:10.1126/science.aba8853 |
| [58] | Hua K, Tao XP, Zhu JK. Expanding the base editing scope in rice by using Cas9 variants. Plant Biotechnol J, 2019, 17(2): 499-504. DOI:10.1111/pbi.12993 |
| [59] | Yang L, Zhang XH, Wang LR, et al. Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants. Protein Cell, 2018, 9(9): 814-819. DOI:10.1007/s13238-018-0568-x |
| [60] | Gehrke JM, Cervantes O, Clement MK, et al. An APOBEC3A-Cas9 base editor with minimized bystander and off-target activities. Nat Biotechnol, 2018, 36(10): 977-982. DOI:10.1038/nbt.4199 |
| [61] | Kim D, Kim DE, Lee G, et al. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nat Biotechnol, 2019, 37(4): 430-435. DOI:10.1038/s41587-019-0050-1 |
| [62] | Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 2016, 529(7598): 490-495. |
| [63] | Lee JK, Jeong E, Lee J, et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nat Commun, 2018, 9: 3048. DOI:10.1038/s41467-018-05477-x |
| [64] | Liang MM, Sui TT, Liu ZQ, et al. AcrⅡA5 suppresses base editors and reduces their off-target effects. Cells, 2020, 9(8): 1786. DOI:10.3390/cells9081786 |
| [65] | Rogozin IB, Iyer LM, Liang LZ, et al. Evolution and diversification of lamprey antigen receptors: evidence for involvement of an AID-APOBEC family cytosine deaminase. Nat Immunol, 2007, 8(6): 647-656. DOI:10.1038/ni1463 |
| [66] | Burns MB, Lackey L, Carpenter MA, et al. APOBEC3B is an enzymatic source of mutation in breast cancer. Nature, 2013, 494(7437): 366-370. DOI:10.1038/nature11881 |
| [67] | Zuo EW, Sun YD, Wei W, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single- nucleotide variants in mouse embryos. Science, 2019, 364(6437): 289-292. |
| [68] | Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science, 2019, 364(6437): 292-295. |
| [69] | Jin S, Fei HY, Zhu ZX, et al. Rationally designed APOBEC3B cytosine base editors with improved specificity. Mol Cell, 2020, 79(5): 728-740. DOI:10.1016/j.molcel.2020.07.005 |
| [70] | Grünewald J, Zhou RH, Garcia SP, et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 2019, 569(7756): 433-437. DOI:10.1038/s41586-019-1161-z |
| [71] | Zhou CY, Sun YD, Yan R, et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature, 2019, 571(7764): 275-278. DOI:10.1038/s41586-019-1314-0 |
| [72] | Rees HA, Wilson C, Doman JL, et al. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv, 2019, 5(5): eaax5717. DOI:10.1126/sciadv.aax5717 |
| [73] | Chadwick AC, Wang X, Musunuru K. In vivo base editing of PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) as a therapeutic alternative to genome editing. Arterioscl Thrombo Vascul Biol, 2017, 37(9): 1741-1747. DOI:10.1161/ATVBAHA.117.309881 |
| [74] | Zhang YH, Qin W, Lu XC, et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nat Commun, 2017, 8: 118. DOI:10.1038/s41467-017-00175-6 |
| [75] | Kuscu C, Parlak M, Tufan T, et al. CRISPR-STOP: gene silencing through base-editing-induced nonsense mutations. Nat Methods, 2017, 14(7): 710-712. DOI:10.1038/nmeth.4327 |
| [76] | Billon P, Bryant EE, Joseph SA, et al. CRISPR-mediated base editing enables efficient disruption of eukaryotic genes through induction of STOP codons. Mol Cell, 2017, 67(6): 1068-1079. DOI:10.1016/j.molcel.2017.08.008 |
| [77] | Haapaniemi E, Botla S, Persson J, et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, 2018, 24(7): 927-930. DOI:10.1038/s41591-018-0049-z |
| [78] | Ihry RJ, Worringer KA, Salick MR, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med, 2018, 24(7): 939-946. DOI:10.1038/s41591-018-0050-6 |
| [79] | Aguirre AJ, Meyers RM, Weir BA, et al. Genomic copy number dictates a gene-independent cell response to CRISPR/Cas9 targeting. Cancer Discov, 2016, 6(8): 914-929. DOI:10.1158/2159-8290.CD-16-0154 |
| [80] | Roukos V, Misteli T. The biogenesis of chromosome translocations. Nat Cell Biol, 2014, 16(4): 293-300. DOI:10.1038/ncb2941 |
| [81] | Gapinske M, Luu A, Winter J, et al. CRISPR-SKIP: programmable gene splicing with single base editors. Genome Biol, 2018, 19: 107. DOI:10.1186/s13059-018-1482-5 |
| [82] | Yuan JJ, Ma YQ, Huang T, et al. Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase. Mol Cell, 2018, 72(2): 380-394.e7. DOI:10.1016/j.molcel.2018.09.002 |
| [83] | Li ZX, Xiong XY, Wang FZ, et al. Gene disruption through base editing-induced messenger RNA missplicing in plants. New Phytol, 2018, 222(2): 1139-1148. |
| [84] | Xue CX, Zhang HW, Lin QP, et al. Manipulating mRNA splicing by base editing in plants. Sci China Life Sci, 2018, 61(11): 1293-1300. DOI:10.1007/s11427-018-9392-7 |
| [85] | Hur JK, Kim K, Been KW, et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 807-808. DOI:10.1038/nbt.3596 |
| [86] | Sung YH, Baek IJ, Kim DH, et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol, 2013, 31(1): 23-24. DOI:10.1038/nbt.2477 |
| [87] | Wang F, Zhang WQ, Yang QY, et al. Generation of a Hutchinson-Gilford progeria syndrome monkey model by base editing. Prot Cell, 2020. DOI:10.1007/s13238-020-00740-8 |
| [88] | Liu Z, Lu ZY, Yang G, et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nat Commun, 2018, 9: 2338. DOI:10.1038/s41467-018-04768-7 |
| [89] | Ma YW, Yu L, Zhang X, et al. Highly efficient and precise base editing by engineered dCas9-guide tRNA adenosine deaminase in rats. Cell Discov, 2018, 4: 39. |
| [90] | Li ZF, Duan XY, An XM, et al. Efficient RNA-guided base editing for disease modeling in pigs. Cell Discov, 2018, 4: 64. |
| [91] | Xie JK, Ge WK, Li N, et al. Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors. Nat Commun, 2019, 10: 2852. DOI:10.1038/s41467-019-10421-8 |
| [92] | Zhou SW, Cai B, He C, et al. Programmable base editing of the sheep genome revealed no genome-wide off-target mutations. Front Genet, 2019, 10: 215. DOI:10.3389/fgene.2019.00215 |
| [93] | Li GW, Zhou SW, Li C, et al. Base pair editing in goat: nonsense codon introgression into FGF5 results in longer hair. FEBS J, 2019, 286(23): 4675-4692. DOI:10.1111/febs.14983 |
| [94] | Yin KQ, Gao CX, Qiu JL. Progress and prospects in plant genome editing. Nat Plants, 2017, 3: 17107. DOI:10.1038/nplants.2017.107 |
| [95] | Voytas DF, Gao CX. Precision genome engineering and agriculture: opportunities and regulatory challenges. PLoS Biol, 2014, 12(6): e1001877. DOI:10.1371/journal.pbio.1001877 |
| [96] | Zong Y, Wang YP, Li C, et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 438-440. DOI:10.1038/nbt.3811 |
| [97] | Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 441-443. DOI:10.1038/nbt.3833 |
| [98] | Zhang R, Liu JX, Chai ZZ, et al. Generation of herbicide tolerance traits and a new selectable marker in wheat using base editing. Nat Plants, 2019, 5(5): 480-485. DOI:10.1038/s41477-019-0405-0 |
| [99] | Sakata RC, Ishiguro S, Mori H, et al. Base editors for simultaneous introduction of C-to-T and A-to-G mutations. Nat Biotechnol, 2020, 38(7): 865-869. DOI:10.1038/s41587-020-0509-0 |
| [100] | Kurt IC, Zhou RH, Iyer S, et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nat Biotechnol, 2020. DOI:10.1038/s41587-020-0609-x |
| [101] | Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 2019, 576(7785): 149-157. DOI:10.1038/s41586-019-1711-4 |
