, 薛云1 1. 河南科技大学 医学技术与工程学院, 河南 洛阳 471023;
2. 河南科技大学 第一附属医院检验科, 河南 洛阳 471023;
3. 河南科技大学 动物科技学院, 河南 洛阳 471023
收稿日期：2020-08-07；接收日期：2020-10-19
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31672530, 32072899, U1704117)，河南省科技攻关项目(No. 192102310037)，河南科技大学研究生创新基金(No. CXJJ-2019KJ04) 资助
摘要：文中旨在建立结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的荧光分子标记，为分子药物敏感性试验提供简便、可靠的基因分型检测方法。对比分析利福平耐药菌株rpoB基因531、526、516、511、513等氨基酸位点的基因突变与敏感菌株中等位基因的序列差异，结合PARMS技术(Penta-primer amplification refractory mutation system)，建立rpoB基因的荧光分子标记。利用其对104例结核分枝杆菌临床分离株进行检测，经Sanger测序验证，正确率100%。并采用比例法药敏试验对这104份样本进行了利福平耐药性鉴定，与分子标记结果相符率为94.23%。结果表明，分子标记有较强可靠性，能检出表型药敏无法测出的低浓度耐药样本(511/533单位点突变)。建立的11组荧光分子标记能覆盖92%–96%的利福平耐药菌株rpoB基因突变类型，为快速检测结核分枝杆菌利福平耐药提供新思路。
关键词：结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因PARMS技术比例法药敏
Development of molecular markers of Mycobacterium tuberculosis rifampicin resistance gene rpoB by PARMS technology
Xiaohui Liu1, Xiangyang Zu1, Zhenzhen Wang2, Pengchao Zhao1, Lei Gao1, Zhanqin Zhao3
, Yun Xue1 1. College of Medical Technology and Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China;
2. Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China;
3. College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China
Received: August 7, 2020; Accepted: October 19, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31672530, 32072899, U1704117), Key Research and Development and Promotion Projects in Henan Province, China (No. 192102310037), Graduate Innovation Fund of Henan University of Science and Technology (No. CXJJ-2019KJ04)
Corresponding author: Zhanqin Zhao. Tel: +86-379-64282051; E-mail: zhaozhanqin@163.com;
Yun Xue. Tel: +86-379-64593822; E-mail: xueyun6688@163.com.
Abstract: The purpose of this study is to provide a simple and reliable genetic typing approach for molecular drug susceptibility test of Mycobacterium tuberculosis, through the developing of fluorescence molecular marker of rifampicin resistance gene rpoB. Eleven fluorescent molecular markers of the rpoB gene were established by using the sequence difference between the amino acid positions 531, 526, 516, 511 and 513 of rpoB gene of rifampicin-resistant strains and the alleles of rifampicin-sensitive strains, combined with the PARMS technique (Penta-primer amplification refractory mutation system). We used 104 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis to validate this marker and it was verified by sequencing as 100% correct. These samples were also tested with proportional drug sensitivity test. The coincidence rate was 94.23%. The molecular markers had high reliability for genotyping of rpoB gene. It can also detect low-concentration drug-resistant samples (511/533 unit point mutations) whose phenotypic susceptibility cannot be detected. The eleven sets of fluorescent molecular markers could cover 92%–96% of rpoB gene mutation types of rifampicin-resistant strains, and provide new idea for rapid detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis.
Keywords: Mycobacterium tuberculosisrifampicin resistancerpoB genePARMS technologyproportional drug sensitivity test
结核病是一种古老的严重慢性消耗性传染病，由结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis (MTB) 复合群引起，一直以来高居传染病死因之首。世界卫生组织(World Health Organization，WHO) 2019年全球结核病报告显示，2018年全球新发结核病患者约1 000万例，死亡124万例；全球估算利福平耐药结核病患者约为48.4万例，其中78%为耐多药结核病人；有23万例利福平耐药以及耐多药结核病病人致死，耐药导致的结核病死亡比例远大于普通结核病的平均死亡比例[1]。全球结核病防治工作任重道远，已成为困扰公共卫生的最大问题。利福平(Rifampicin，RFP) 耐药MTB受到格外重视，结核病患者对其耐药绝大多数(约95%–98%) 同RFP作用的靶分子RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB突变有关，且这些突变均集中在81 bp的利福平耐药决定区(Rifampicin resistance determining region，RRDR)，对应编码氨基酸507–533[2]。几乎所有RFP耐药菌株也对其他药物，特别是另一种一线药物异烟肼(INH) 具有抗性，因此普遍将RFP耐药视为耐多药菌株的标志性特征[3]。
目前耐药性检测的“金标准”是表型药物敏感性检测，通过观察对比MTB在含药和不含药培养基中的生长情况来判断其耐药性，但最少需耗时2–4周，不能及时获知检测结果[4]。Xpert MTB/RIF和MTB DRplus是WHO批准的两种标准分子诊断方法。Xpert以多重荧光定量PCR为基础，设计引物探针选择性覆盖RRDR，能同时检测MTB和RFP耐药基因rpoB是否存在突变，判断MTB耐药性[5]。样本RRDR序列上某个位点存在突变，就会引起探针结合失败，仪器判定结果为利福平耐药，但无法检出具体突变位点及性质。DRplus应用核酸线性探针杂交技术，采用8个野生型(Wild type，WT) 探针和4种特异性突变型(Mutant type，MUT) 探针检测RFP和INH的部分耐药基因来判断MTB耐药性[6]。优于Xpert只覆盖区域的检测，DRplus可以根据MUT探针染色阳性判断4个RFP耐药最普遍的特异性点突变(S531L、H526Y、H526D和D516V)。但除这4种突变类型外，DRplus同Xpert一样，只能根据WT探针的缺失报告存在其他突变，无法鉴定rpoB基因的具体突变性质，对于不影响耐药表型的同义突变存在报告假阳性的情况[7-8]。基因芯片技术固定寡核苷酸探针与荧光物质标记的DNA杂交，将多个位点集成到一张芯片上通过信号强度判断样本信息。但过程烦琐，PCR扩增后杂交、洗涤干燥、扫描，对实验仪器及人员要求较高[9-10]。
新型的五引物扩增受阻突变体系PARMS (Penta-primer amplification refractory mutation system) 是一种结合突变扩增系统ARMS (Amplification refractory mutation system) 的基因分型技术，在ARMS-PCR基础上增加了两条由6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM) 和六氯-6-甲基荧光素(Hexachloroflurescein，HEX) 标记的引物，通过不同的荧光信号来检测基因的多态性。卿冬进等利用该技术成功实现了抗稻瘟病基因Pigm序列与其等位基因的区分，并开发了水稻粒宽调控基因GW8的荧光分子标记[11-12]。律文堂等利用该技术对水稻CRISPR/Cas9基因编辑植株进行了基因分型，鉴定结果与聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)检测和Sanger测序法一致[13]。PARMS技术在不降低综合检测准确性的前提下，变特异性荧光标记探针为通用荧光标记探针，大幅降低了探针合成与标记成本，十分适合高通量基因分型检测。且目前尚未见其在多位点联合检测及耐药基因检测上的应用。
因此，本文期望将PARMS技术应用于RFP相关基因突变的检测中，为MTB分子耐药性检测提供新思路。本文通过MTB-RFP耐药菌株rpoB突变基因与其等位基因的对比，结合PARMS技术开发rpoB基因的荧光分子标记，分析待检位点基因分型结果，以准确判断RFP耐药性。
1 材料与方法1.1 供试菌株供试结核菌株来源于河南科技大学第一附属医院提供的104例抗酸染色为阳性的肺结核患者痰标本，所有菌株经改良罗氏培养基培养，用含对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼培养基初步菌型鉴定为结核分枝杆菌。菌株培养和DNA提取实验在河南科技大学第一附属医院检验科的BSL-2生物安全实验室进行操作。标准株H37Rv (ATCC27294) 由中国疾病预防控制中心传染病预防控制研究所结核病实验室提供。
1.2 利福平耐药性评价用灭菌的接种环刮取培养基上一满环的菌落放于磨菌瓶底部，加入灭菌5% Tween 80水溶液，充分振荡研磨后制成菌液，与标准麦氏瓶比浊，滴加生理盐水比浊制为1 mg/mL的菌悬液，再稀释至10–2 mg/mL和10–4 mg/mL。使用22SWG标准环分别蘸取，划线法均匀接种到含利福平(40 μg/mL) 的罗氏固体培养基和空白对照培养基，37 ℃培养4周后读菌落数，计算耐药百分比，含药培养基菌落数/对照不含药培养基菌落数≤1%即为敏感，＞1%为耐药。
用于显色药敏最小抑菌浓度(MIC) 检测的利福平含药培养基药物终浓度分别为0.5、1、5、20、30、40、50、60、80 μg/mL。
1.3 DNA提取细菌DNA提取试剂盒购于生工生物工程(上海) 股份有限公司，按照说明书进行样本DNA提取，得到上清液保存备用。
1.4 RRDR测序从GenBank获得rpoB序列(登录号：KY702773.1)，选用上游引物5′-CGACCACTTC GGCAACCG-3′，下游引物5′-TCGATCGGGCAC ATCCGG-3′进行PCR扩增[14]，扩增目的DNA片段长度342 bp，覆盖81 bp的RRDR区域。反应体系共50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix (康为世纪) 25 μL、引物(10 μmol/L) 各1.5 μL，模板5 μL，去离子水17 μL。扩增条件：94 ℃变性8 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；再72 ℃延伸5 min。PCR产物送生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。
1.5 等位基因型检测方法PARMS技术采用5条引物进行PCR反应，其中2条荧光通用引物包含在2× PARMS Master Mix中。其余3条为标记特异引物，需要根据实验目的定制设计合成。其基因型检测包括两个互补的PCR反应，使用同样的DNA模板、一条相同的共有引物和相同的反应条件，区别在于与共有引物配对的PARMS标记引物不同，从而使两个反应选择性扩增相应的模板。
PCR扩增反应体系10 μL，包含5 μL 2× PARMS master mix，0.15 μL 10 mmol/L每个等位基因特异性引物，0.4 μL 10 mmol/L通用特异性引物和1 μL模板DNA (10–100 ng)。使用荧光定量PCR仪设置降落式PCR：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ (–0.8 ℃每个循环) 1 min，10个循环；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，30个循环。导出FAM、HEX、ROX荧光强度数据，上传至http://www.snpway.com/snpdecoder/，结合标记信息，获得分型结果。
2 结果与分析2.1 分子标记引物设计根据结核耐药基因突变数据库(www. tbdreamdb.com)的研究表示，rpoB基因511、513、516、522、526、531、533等7个氨基酸位点被认为是高度确信突变位点。同时结合国内关于rpoB突变位点的研究[14-15]，在利福平耐药菌株中存在最多的是531、526、516位点，总占比80%以上，虽然rpoB 511、513、533占比不高，但也属于常见位点。本文中我们总共选择设计了11组分子标记，位点分别为：511 (CTG/CCG)，513 (CAA/CTA)，516 (GAC/GTC, TAC, GAG)，526 (CAC/TAC, GAC, CGC, AAC)，531 (TCG/TTG)，533 (CTG/CCG)。利用这些位点等位基因的差异性为特异性引物的3′末端，设计共显性的分子标记，引物序列见表 1。
表 1 标记引物序列Table 1 Sequence information of marker primers in this study
| rpoB gene | Marker name | Primer name | Sequence (5′–3′) |
| 511 | T511C | Allele-T Allele-C Common-F | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTGGTCCATGAATTGGCTCA GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTGGTCCATGAATTGGCTCG AGGCGATCACACCGCAGAC |
| 513 | A513C | Allele-A Allele-C Common-F | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGTTGTTCTGGTCCATGAATT GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTTGTTCTGGTCCATGAATG AGGCGATCACACCGCAGAC |
| 516 | G516T | Allele-G Allele-T Common-F | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCGGGTTGTTCTGGTC GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACAGCGGGTTGTTCTGGTA AGGCGATCACACCGCAGAC |
| A516T | Allele-A Allele-T Common-F | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACAGCGGGTTGTTCTGGT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCGGGTTGTTCTGGA AGGCGATCACACCGCAGAC | |
| C516G | Allele-C Allele-G Common-F | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACAGCGGGTTGTTCTGG GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCGGGTTGTTCTGC AGGCGATCACACCGCAGAC | |
| 526 | C526G | Allele-C Allele-G Common-R | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGTCGGGGTTGACCC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGTCGGGGTTGACCG CCCGGCACGCTCACG |
| C526T | Allele-C Allele-T Common-F | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGACAGTCGGCGCTTGTG GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGACAGTCGGCGCTTGTA AGGCGATCACACCGCAGAC | |
| C526A | Allele-C Allele-A Common-R | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGTCGGGGTTGACCC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGTCGGGGTTGACCA CCCGGCACGCTCACG | |
| A526G | Allele-A Allele-G Common-F | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGACAGTCGGCGCTTGT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGACAGTCGGCGCTTGC AGGCGATCACACCGCAGAC | |
| 531 | C531T | Allele-C Allele-T Common-R | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCACAAGCGCCGACTGTC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCACAAGCGCCGACTGTT CCCGGCACGCTCACG |
| 533 | T533C | Allele-T Allele-C Common-F | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGACCGCCGGGCCCCA GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGACCGCCGGGCCCCG AGGCGATCACACCGCAGAC |
表选项
Allele引物5′端与FAM荧光匹配的接头序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，与HEX荧光匹配的接头序列为GAAGGTCGGAGTCAAC GGATT，在扩增过程中分别与PARMS master Mix中的FAM/HEX荧光引物结合。如表 2所示，根据引物序列对比分析，预测PCR扩增后，对于分子标记T511C、A513C、G516T，利福平敏感菌株一定可以检测到HEX荧光信号，其他耐药菌株可以检测到FAM荧光信号；对于分子标记A516T、C516G、C526G、C526T、C526A、A526G、C531T、T533C，敏感菌株基因扩增后一定可以检测到FAM荧光信号，其他耐药菌株可以检测到HEX荧光信号。通过检测两种荧光信号将耐药菌株与敏感菌株的基因型区分开。
表 2 等位基因与荧光标记对应表Table 2 Corresponding relation table of alleles and fluorescence marker
| Fluorescence of alleles | Genotype of alleles | ||||||||||
| T511C | A513C | G516T | A516T | C516G | C526G | C526T | C526A | A526G | C531T | T533C | |
| FAM | CC | CC | TT | AA | CC | CC | CC | CC | AA | CC | TT |
| HEX | TT | AA | GG | TT | GG | GG | TT | AA | GG | TT | CC |
表选项
2.2 分子标记检测等位基因在结核样本中的分布利用设计的11组荧光分子标记检测104例结核样本DNA的基因型，PCR扩增后经荧光扫描、数据分析，结果显示FAM和HEX荧光信号的散点图见图 1。结合PARMS引物设计原理分析，有64例样本为单位点突变(92.75%)，其中rpoB 531 (52.17%) 最多，其次为rpoB 526 (21.74%)、rpoB 516 (13.04%)，这3个位点占总突变的86.95%。另外还存在5株联合突变样本(7.25%)，rpoB 526+533、rpoB 511+516、rpoB 513+531各1例，rpoB 511+526有2例，见表 3。
 |
| 图 1 十一组分子标记的基因分型检测结果 Fig. 1 Genotyping result of 11 molecular markers. Tag (A–K) genotyping with marker primers T511C, A513C, G516T, A516T, C516G, C526A, C526G, C526T, A526G, C531T, T533C, respectively. |
| 图选项 |
表 3 结核分枝杆菌临床分离株rpoB分子标记检测结果Table 3 Test results with Mycobacterium tuberculosis clinical isolates rpoB molecular markers
| Number | Codon | Marker name | Change of base | Change of amino acid | Amount | Total (proportion) | ||
| 1 | 511 | T511C | CTG | CCG | Leu | Pro | 2 | 2 (2.82%) |
| 2 | 513 | A513C | CAA | CCA | Gln | Pro | 1 | 1 (1.41%) |
| 3 | 516 | G516T | GAC | TAC | Asp | Tyr | 6 | 11 (15.49%) |
| 516 | A516T | GAC | GTC | Asp | Val | 3 | ||
| 516 | C516G | GAC | GAG | Asp | Glu | 2 | ||
| 4 | 526 | C526G | CAC | GAC | His | Asp | 5 | 15 (21.13%) |
| 526 | C526T | CAC | TAC | His | Tyr | 6 | ||
| 526 | C526A | CAC | AAC | His | Asn | 1 | ||
| 526 | A526G | CAC | CGC | His | Arg | 3 | ||
| 5 | 531 | C531T | TCG | TTG | Ser | Trp | 36 | 36 (50.70%) |
| 6 | 533 | T533C | CTG | CCG | Leu | Pro | 1 | 1 (1.41%) |
| 7 | 526+533 | C526G | CAC | GAC | His | Asp | 1 | 1 (1.41%) |
| T533C | CTG | CCG | Leu | Pro | ||||
| 8 | 511+516 | T511C | CTG | CCG | Leu | Pro | 1 | 1 (1.41%) |
| A516T | GAC | GTC | Asp | Val | ||||
| 9 | 513+531 | A513C | CAA | CCA | Gln | Pro | 1 | 1 (1.41%) |
| C531T | TCG | TTG | Ser | Trp | ||||
| 10 | 511+526 | T511C | CTG | CCG | Leu | Pro | 2 | 2 (2.82%) |
| C526T | CAC | TAC | His | Tyr | ||||
表选项
2.3 结核菌株RFP耐药性评价分析RFP耐药界限定在≥40 μg/mL，经比例法药物敏感性实验后，结果显示104例临床菌株中RFP耐药菌株74例，敏感菌株30例，分析结果见表 4。将存在突变视为利福平耐药，两种方法相符率为94.23% (98/104)。3例(2.88%) 样本没有检测到rpoB基因突变，却表现为利福平耐药，可能是存在细胞壁通透性障碍，导致药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢；或者是MTB外排泵将药物泵出，导致菌内药物浓度降低，杀菌作用减弱从而导致耐药[16-17]。69例突变样本中3例表现为利福平敏感，分别是rpoB 511单位点突变2例、rpoB 533单位点突变1例。对这3株样本和包含511/533位点突变的4株样本进行利福平MIC测定，结果显示单位点突变样本MIC为10–20 μg/mL，联合突变样本MIC为50–60 μg/mL，具体见表 5。
表 4 分子标记结果与比例法药敏结果的比较Table 4 Comparison of molecular markers results and drug sensitivity by proportional method results
| Markers detect rpoB gene | RFP proportional method | Total | |
| Sensitive | Resistance | ||
| Mutation | 3 | 68 | 71 |
| No mutation | 30 | 3 | 33 |
| Total | 30 | 74 | 104 |
表选项
表 5 rpoB基因511和533位点突变样本RFP MIC结果Table 5 RFP MIC results of rpoB gene 511 and 533 mutation samples
| Number | rpoB gene mutation | RFP MIC (μg/mL) | Strain number |
| 1 (H37Rv) | Without | 1 | 1 |
| 2 | 511 CTG→CCG | 10 | 1 |
| 3 | 511 CTG→CCG | 20 | 1 |
| 4 | 533 CTG→CCG | 20 | 1 |
| 5 | 526 CAC→GAC | 60 | 1 |
| 533 CTG→CCG | |||
| 6 | 511 CTG→CCG | 50 | 1 |
| 516 GAC→GTC | |||
| 7 | 511 CTG→CCG | 60 | 2 |
| 526 CAC→TAC |
表选项
2.4 分子标记结果验证为检验PARMS分子标记基因分型是否正确，以H37Rv标准株DNA序列作为参比序列，分析104例结核分枝杆菌临床分离株的测序结果。序列对比发现分子标记的分型结果与相应测序结果的符合率为100%，见表 6。同时也明确了2.3中，11组分子标记没有检测到突变的3例RFP耐药菌株存在其他类型的基因突变，为519 del AAC 1例、522 TCG→TTG 2例。
表 6 分子标记和测序法检测MTB临床分离株rpoB突变类型的比较Table 6 Comparison of rpoB mutation types of MTB clinical isolates from molecular markers and sequencing
| rpoB gene mutation | Strain number | |
| Molecular marker | Sequencing | |
| 511 CTG→CCG | 4 | 4 |
| 513 CAA→CCA | 2 | 2 |
| 516 GAC→TAC | 6 | 6 |
| 516 GAC→GTC | 4 | 4 |
| 516 GAC→GAG | 2 | 2 |
| 526 CAC→GAC | 6 | 6 |
| 526 CAC→TAC | 7 | 7 |
| 526 CAC→AAC | 1 | 1 |
| 526 CAC→CGC | 3 | 3 |
| 531 TCG→TTG | 37 | 37 |
| 533 CTG→CCG | 2 | 2 |
| 519 del AAC | 0 | 1 |
| 522 TCG→TTG | 0 | 2 |
表选项
3 讨论作为耐多药菌株的标志性特征，RFP耐药检测在临床诊断工作中不可或缺，由于表型药物敏感性试验耗时长、敏感度低，目前多采用分子诊断方法来检测RFP耐药相关基因rpoB突变情况。本文使用的PARMS技术作为一种新型的分子标记方法，基于荧光检测，通过特异性引物的设计实现基因型区分，具有操作简便、耗时短、成本低的优势，已成功地应用于农作物的选择性育种和半滑舌鳎的性别鉴定中[11-13, 18-19]。
根据RFP耐药菌株存在的绝大多数rpoB基因突变特征，本文利用PARMS技术开发了11组荧光分子标记联合跟踪rpoB基因突变位点，能精准检测出样本中存在的1个碱基突变，以区分鉴定利福平耐药性，避免了Xpert易被同义突变影响的问题，同时采用的分子信标探针也比DRplus或其他类型的杂交探针都具有更高的特异性[2, 20]。且相对于基因芯片及Sanger测序技术，对实验条件、仪器要求不高，通过荧光信号扫描和软件分析直接获得基因型，荧光定量PCR仪即可完成实验，具有不需要进行杂交分析或DNA电泳的简便性[9]。
本文通过设计的11组分子标记对104例MTB临床分离株进行检测分型，使用测序法进行验证，符合率为100%。与比例法药敏结果相比符合率为94.23%。差异原因为：(1) 3株样本比例法药敏结果为RFP耐药，但分子标记未检测到突变, 经测序证实为519 del AAC一株，522 TCG→TTG两株，原因是设计分子标记时忽略了这些通常出现率＜0.09%的突变位点[14-15, 21]；(2) 3株样本rpoB 511/533单位点突变但比例法药敏结果显示为敏感，同时511/533与其他位点联合突变的4株样本显示为耐药。MIC检测的结果表明：单位点突变样本中1株MIC为10 μg/mL，2株MIC为20 μg/mL；4例联合突变菌株显示1株MIC为50 μg/mL，3株MIC为60 μg/mL耐药。也就是说rpoB 511/533位点突变可能会导致低浓度耐药，而联合突变样本中由于存在526或531等相关位点突变，对耐药调控机制造成了影响，导致药敏结果的不同。杨慧娟等和李国利等的研究也提示了这一问题，因此通过分子标记方法聚合MTB中多个相关基因，是精确检测RFP基因型耐药的有效途径[14, 22]。
本文建立了利用PARMS技术联合检测rpoB基因11种碱基突变的荧光分子标记方法，对104例临床结核分离株进行基因型检测，并与菌株利福平药敏试验和DNA测序结果进行了对比验证，证明了该荧光分子标记的有效性，为临床精准快速检测结核RFP耐药提供了一种新方法。不足之处在于，尽管本方法已包含11种利福平耐药基因特异性突变位点，涵盖了临床约92%–96%的常见结核菌株耐药基因突变类型[14-15]，但对于菌株其他罕见突变、插入、缺失等突变类型不能完全检出。由于临床结核菌株耐药机制产生原因的复杂性，基因突变检测结果与耐药表型结果的符合率也并非100%，在临床诊断条件与时间允许的情况下，可以结合菌株药敏结果进行进一步验证。最后，尽管PARMS技术对大批量精准双等位基因检测有着简便、高效、快速、便宜的优越性，但是要实现多基因位点联合检测并将其应用于临床诊断，还需要解决医院实验室硬件条件与操作人员技术培训等问题。我们将进一步将该方法与微流控阵列芯片法相结合，在一张芯片预置试剂，自动控制，使其只需一次样本加入、一次荧光扫描即可实现多位点检测，从而推动分子检测研究工作的发展[21]。
4 结论利用PARMS技术结合利福平耐药相关基因rpoB的等位分析，建立了11组rpoB基因的荧光分子标记。利用该标记检测了104份结核分枝杆菌临床分离株的基因型，结合利福平比例法表型药敏试验与测序验证，证明了建立的11组荧光分子标记能够快速、可靠地对结核菌株rpoB基因分型检测，鉴定利福平耐药性，同时为快速检测结核分枝杆菌利福平耐药提供新思路。
参考文献
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