1. 武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072;
2. 河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007
收稿日期：2020-10-17；接收日期：2020-12-21；网络出版时间：2020-01-13
基金项目：国家自然科学基金(No. 31771703) 资助
摘要：RNA干扰(RNAi) 是真核生物体内重要的基因表达调控方式之一。RNAi的一种原始的作用是帮助生物体抵抗病毒，早期的研究表明无脊椎动物可以利用RNAi抵抗病毒，但是哺乳动物是否存在这一机制一直存在争议。最新的研究发现了哺乳动物RNAi抗病毒的强有力的证据，并且研究人员认为，这是一种之前被忽视的、全新的免疫途径。值得注意的是，病毒也可以利用RNAi加强其在动物细胞中的感染和免疫逃逸。文中总体介绍了动物细胞抗病毒RNAi免疫的研究历程，综述了这一领域的主要发现，最后提出了关于这一领域尚未解决的疑问，探讨了这一途径与其他天然免疫机制的联系。病毒介导的动物细胞RNAi途径不仅是基础的生物学问题，而且对于抗病毒药物的开发有重要指导意义。
关键词：RNA干扰病毒免疫基因表达调控小RNA抗病毒药物
Pathways and mechanisms of RNA interference mediated by viral siRNA
Dongliang Shen1, Yongfang Li2
1. College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China;
2. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China
Received: October 17, 2020; Accepted: December 21, 2020; Published: January 13, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31771703)
Corresponding author: Yongfang Li. Tel: +86-373-3326340; E-mail: li_yongfang@hotmail.com.
Abstract: RNA interference (RNAi) is one of the important mechanisms to regulate gene expression in eukaryotes. One of the original functions of RNAi is to facilitate the antiviral strategy of host. Early studies reveal that invertebrates can use RNAi to resist viruses. However, if this mechanism exists in mammals is still controversial. The latest studies confirm that mammals do have the RNAi-based immunity, and researchers believe that RNAi-based antiviral immunity is a brand-new immunological mechanism that was neglected in the past. It is worthy to note that virus can also use RNAi to enhance its infectivity and immune escape in host cells. This review introduces the research history of RNAi-based antiviral immunity in animals and summarizes the main findings in this field. Last but not least, we indicate a series of unresolved questions about RNAi-based antiviral immunity, and explore the relationship between RNAi-based antiviral immunity and other innate immunological pathways. The virus-mediated RNAi pathway in animal is not only an interesting basic biology question, but also has important guiding roles in the development of antiviral drugs.
Keywords: RNA interferencevirusimmunitygene expression regulationsmall RNAantiviral drug
RNA干扰(RNA interference，RNAi) 现象最早发现于矮牵牛(Petunia) 中。研究者向细胞内注入某种色素基因片段，就会引发该基因的失活，然而当时并不明晰其机制，推测与mRNA下调有关[1]。之后Fire等[2]的研究证实这是一种基于小RNA (Small RNA，sRNA) 的基因表达调控方式，并且在真核生物(如拟南芥、线虫、果蝇、小鼠等) 中广泛存在。RNAi及其应用研究方兴未艾，基于RNAi原理的基因沉默技术逐渐成熟，现有的研究表明RNAi效应不仅涉及转录后水平mRNA的降解调控，还与染色质调节、肿瘤的发生和转移、代谢类疾病、病原与宿主间的相互作用等领域密切相关。本文旨在介绍由病毒介导的动物细胞的RNAi的研究进展，主要分为宿主细胞通过RNAi行使抗病毒免疫功能和病毒利用RNAi强化感染效率两个方面。
1 小RNA介导的基因沉默小RNA是生物体内一类广泛存在的重要的非编码小分子调控RNA。依据其结构特征、来源和产生方式，动物中的sRNA可分为microRNA (miRNA)、small interfering RNA (siRNA) 和PIWI-interacting RNA (piRNA)。miRNA和siRNA均为21-24 nt的单链小RNA，siRNA是由完全互补的长的双链RNA经Dicer剪切加工而来，RNA可以是内源的也可以是外源的，而miRNA是由内源的能形成发卡结构的单链RNA经一系列加工产生。染色体上的miRNA基因(如最早发现的lin-4[3]，let-7[4]) 由RNA聚合酶Ⅱ (PolymeraseⅡ，PolⅡ) 转录成原初前体(Primary miRNA，pri-miRNA)，在核内经Drosha等剪切形成pre-miRNA后出核，在细胞质内经Dicer酶切割产生miRNA (图 1)。piRNA的长度为29-30 nt，由基因组序列转录加工而来，但不是由Dicer剪切产生。
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| 图 1 动物细胞经典miRNA的产生和沉默途径 Fig. 1 Typical miRNA biogenesis and silencing pathway in animal cells. |
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尽管miRNA、siRNA和piRNA的产生方式不同，但它们的作用方式相似，均通过与不同的AGO (Argonaute) 蛋白结合装配成RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，才可以起到靶向目标RNA的切割作用。AGO是一个很大的蛋白家族，这一类蛋白具有两个典型的结构域：PIWI (P-element induced wimpy testis) 结构域和PAZ (PIWI，AGO and Zwille) 结构域。其中PIWI结构域具有RNA酶的活性以执行切割功能[5]。RSIC复合体中的sRNA通过碱基互补配对方式结合目标RNA，通过RNA的降解、切割或翻译抑制等不同的方式实现基因沉默。
经典的RNAi主要指由siRNA诱发的目标基因RNA沉默，一般认为，AGO2在RNAi途径中起主要作用[6]。广义的基因沉默则涵盖了由miRNA、siRNA和piRNA介导的通过AGO进行的沉默机制。
2 无脊椎动物通过RNAi对病毒的免疫RNAi介导的抗病毒免疫的研究始于21世纪初，早期的奠基性工作主要以无脊椎动物为模式生物，逐步探明了无脊椎动物通过RNAi对病毒的免疫机制。华人****丁守伟实验室首先以果蝇为研究对象，发现禽兽棚病毒(Flock house virus, FHV) 的基因组RNA可被宿主细胞降解为siRNA[7]，这种机制在当时被认为是一种新的抗病毒免疫机制，进而拉开了相关研究的序幕。
目前无脊椎动物中RNAi介导的抗病毒免疫途径已经基本阐明，主要分为3个阶段：双链RNA (dsRNA) 的产生、Dicer切割作用、RISC降解作用。第一阶段是病毒基因组RNA复制产生dsRNA。以FHV为例[7]，病毒进入宿主细胞后，病毒的基因组RNA (Viral genomic RNA) 首先作为mRNA翻译出病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)[8]，然后以病毒的基因组RNA作为模板在RdRP的作用下合成新的基因组RNA。在RdRP对模板进行复制期间，旧链和新链会形成中间体dsRNA，这时dsRNA诱发第二阶段的切割[9]。第二阶段是Dicer (在果蝇中又称DCR) 将dsRNA切割成21nt的病毒来源的siRNA (vsRNA)。首先Dicer的保守dsRNA结合结构域可以识别dsRNA，在Loqs-PD (Loquacious-isoform PD) 的辅助结合作用下，Dicer-Loqs-PD复合物得以紧密结合dsRNA，Dicer的RNaseⅢ活性可以把病毒的dsRNA切割成vsRNA。可见Dicer既是dsRNA感受器，又是dsRNA加工器。果蝇中产生内源siRNA的Dicer称为DCR2，产生miRNA的Dicer称为DCR1，需要注意的是vsRNA的产生依赖于DCR2而不是DCR1。第三阶段是vsRNA与AGO2装配形成RISC，然后靶向降解病毒的基因组RNA。在RISC装配前，甲基化酶HEN1先对vsRNA的3’末端进行甲基化修饰，然后在R2D2-DCR2复合物辅助作用下，vsRNA和AGO2才能装配成有功能的RISC复合体。RISC复合体需要AGO2和vsRNA协调发挥功能，单链的vsRNA作为分子向导，靶向结合与之互补配对的病毒基因组RNA，进而AGO2利用自身PIWI结构域的RNA酶活性将病毒基因组RNA降解为核苷酸碎片。至此，宿主细胞利用自身固有的RNAi相关蛋白，经过一系列分子过程，成功地将病毒的RNA降解，实现了对病毒的清除(图 2)。这样的抗病毒机制不同于抗原抗体的识别机制，而是基于RNA分子的互补配对来实现特异性的病毒免疫，我们可称之为无脊椎动物的“抗病毒RNAi免疫途径”。
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| 图 2 果蝇感染FHV之后表现出的以RNA为基础的抗病毒免疫主要过程 Fig. 2 Main process in RNA-based antiviral immunity induced in Drosophila melanogaster by infection of FHV. |
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在病毒感染后，果蝇、线虫、蚊子、家蚕等无脊椎动物细胞内都可以检测到vsRNA，其涉及的RNAi抗病毒免疫机制基本遵循上述的经典原则，都需要各自的Dicer、AGO蛋白相继发挥功能来降解病毒的RNA[10-11]。显然Dicer和AGO两种关键的蛋白质使得“抗病毒RNAi免疫途径”和“宿主细胞经典RNAi基因表达调控途径”联系起来。vsRNA本质上是一种特殊的siRNA，所以从另一个角度来说，两条途径也因siRNA而联系起来。可以说这两条途径是一套系统(RNAi系统) 的两种功能模式，二者都走向靶向降解RNA的最终效应，前者是靶向降解病毒基因组RNA，后者是靶向降解宿主自身的mRNA。值得注意的是，vsRNA和经典siRNA的分子来源不同，vsRNA的分子来源是病毒基因组复制产生的dsRNA，而宿主细胞经典的siRNA的分子来源是宿主细胞核基因组转录后形成的长dsRNA。
此外值得一提的是，病毒蛋白也可以对宿主RNAi免疫途径进行调控和抑制。FHV编码一种称为B2的病毒蛋白[7]，它是一种RNAi免疫途径的抑制物，可加强病毒的侵染效率。B2可通过两种方式发挥作用(图 2)，一种是B2通过结合病毒的dsRNA或RdRP从而阻止siRNA的产生；另一种是B2通过结合siRNA双链二聚体阻止RISC的装配[9]。B2对于FHV的存活是必要的，如果B2蛋白缺失或者突变，FHV就会引发宿主细胞强烈的RNAi免疫效应，病毒会快速被宿主细胞清除[8]。可见B2是病毒和宿主长期斗争的共进化产物。
抗病毒RNAi免疫途径如何在无脊椎动物细胞内快速扩大影响是一个值得关注的问题。研究表明无脊椎动物的RNAi免疫应答涉及到信号放大的过程，即次级siRNA的产生。对于线虫来说，由dsRNA诱导的RNAi免疫活性很大程度上取决于次级siRNA产生的多少，也就是说，在RdRP的帮助下，病毒来源的siRNA从头合成实现了siRNA丰度的放大，进而显著提高了靶标mRNA被降解的效率[10-11]。在线虫模型中，初级的病毒来源的siRNA和次级siRNA分别结合不同的AGO蛋白，也就是说次级siRNA与特定的AGO蛋白结合也可能是另一个层面的RNA沉默效率的放大机制[12]。
3 哺乳动物细胞RNAi的抗病毒机制尽管早在RNAi抗病毒机制刚刚在果蝇细胞中发现的时候，研究人员就已经预测了哺乳动物(如小鼠、人类) 也应该存在相应的机制，但是其发现和探索过程是曲折且争议不断的。Watanabe等[13]最早在鼠卵母细胞中发现内源性的siRNA，这些siRNA来源于内源的dsRNA，而且具有转录调节功能。利用脑心肌炎病毒(EMCV) 感染鼠胚胎干细胞就会产生大量病毒来源的siRNA，但是这些胚胎干细胞一旦发生分化，它产生病毒来源的siRNA的能力就会丧失[14]。这种在哺乳动物胚胎干细胞中表现出的现象让人怀疑哺乳动物的成体是否具有RNAi的抗病毒免疫机制。
用甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV) 或者小RNA病毒(Picornavirus) 感染一系列的哺乳动物的体细胞，对宿主细胞内的核酸进行深度测序(Deep sequencing) 依然检测不到典型的病毒来源的siRNA或者只能检测到极少的病毒来源的siRNA，并且这些被检测到的siRNA还带有过度的正负链偏好性[15-17]。此外，Dicer或者AGO2基因缺失突变也不能显著增加病毒在哺乳动物细胞中的复制[18]。由此可见，哺乳动物的成体细胞可能不具有RNAi的抗病毒免疫机制。
Ding等[19]利用野田村病毒(NoV) 的B2蛋白缺失突变体感染哺乳期的小鼠，即可在哺乳期小鼠的体细胞内检测到稳定存在的NoV来源的siRNA，这个发现与Ding之前在果蝇和线虫模型中的实验结果是一致的。虽然NoV是一种昆虫病毒，不足以充分证明哺乳动物体细胞存在抗病毒RNAi免疫途径，但是这至少说明寻找病毒编码的RNAi抑制子(Viral suppressors of RNAi，VSR) 是至关重要的。在体外实验方面，甲型流感病毒(IAV) 的NS1蛋白，以及埃博拉病毒(EBOV) 的VP35蛋白都被证实是RNAi的抑制蛋白[20-21]。
中国科学家周溪和秦成峰等的出色工作很大程度上解决了这个争议，他们利用人类肠道病毒EV71 (Enterovirus 71) 进行感染试验，揭示了哺乳动物RNAi抗病毒免疫的机制[22]。研究证实，EV71编码的3A蛋白是一种典型的VSR蛋白，把3A蛋白突变，即可在受EV71感染的体细胞中检测到丰富且稳定存在的EV71来源的siRNA。分子和生化实验证实这些病毒来源的siRNA是来源于EV71复制时的dsRNA，并且这些siRNA的确具有靶向同源序列实现RNA降解的免疫功效。EV71的野生型3A蛋白以二聚体形式结合dsRNA，从而屏蔽了Dicer的切割作用，突变的3A蛋白不能与dsRNA结合，因此可以产生siRNA。siRNA通过经典的RNAi模式，即与AGO蛋白等形成RISC沉默复合体而执行降解EV71病毒基因组的免疫功能。在3A突变体感染试验中，若敲除体细胞中AGO2或者敲除Dicer即可拯救EV71基因组被降解的命运。此外研究人员还将Ⅰ型干扰素(TypeⅠinterferon) 响应的影响排除在外，这进一步证实了哺乳动物基于RNAi的病毒免疫模式是真实可靠的。这项研究正式建立了一条清晰的Dicer、AGO2依赖的，干扰素非依赖的哺乳动物RNAi免疫通路，同时为人类相关抗病毒药物开发提供了潜在的靶点(图 3)。
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| 图 3 EV71病毒小RNA介导的EV71抗病毒免疫机理[22] Fig. 3 Mechanism of antiviral immunity mediated by small RNAs of EV71[22]. |
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2019年周溪实验室、秦成峰实验室和胡宝洋实验室进一步合作研究了寨卡病毒(Zika virus，ZIKV) 引发的人类神经前体细胞(Human neural progenitor cells，hNPCs) 的RNAi机制。先前的EV71只能在3A基因突变的情况下才能在体细胞中检测到病毒来源的siRNA[22]，而现有的证据表明，被野生型ZIKV自然侵染的hNPCs的细胞质内可以检测到ZIKV来源的siRNA，这并不涉及到病毒基因组的突变，但是在进一步分化的神经细胞中就很难检测到ZIKV相关的siRNA[23]，该研究给我们一个启示，激活分化的神经细胞中的RNAi机制是防止ZIKV感染的有效途径。感染ZIKV会引起婴儿神经系统发育疾病即小头症，事实上hNPCs是ZIKV的主要侵染对象，hNPCs的大量坏死导致的发育异常是婴儿小头症的主要病理原因之一[24-25]。研究表明，ZIKV全球化蔓延过程中，其嗜hNPCs性显著增强，使得ZIKV的致病能力和婴儿小头症的发病率显著上升[26-27]。研究者利用类器官模型证实了药物依诺沙星(Enoxacin) 可以防止ZIKV的感染和婴儿小头症的发病[23]，这是因为在药理层面上依诺沙星是RNAi途径的增强剂，靶向增强RNA的沉默[28-29]，从而强化了神经细胞的RNAi免疫通路，最终达到抗病毒的效果。考虑到先前hNPCs的抗病毒免疫的相关研究非常缺乏，这一发现揭示了hNPCs的RNAi免疫机制，对ZIKV感染的防治有重要的指导意义。另一方面，在人类神经细胞中发现典型的病毒来源的siRNA，并且阐明了人类神经细胞的RNAi免疫机制，这无疑是相关领域基础研究中的重要突破。
值得注意的是，宿主细胞来源的miRNA可能也有RNAi抗病毒免疫的功能。Chen等[30]发现乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) 的前基因组RNA (pgRNA) 以及病毒mRNA可以被人类肝脏细胞自身产生的特异性miRNA——miR-122所抑制。miR-122在正常肝脏细胞中表达水平非常高，占总miRNA表达的70%以上[31-32]，但是在肝癌情况下miR-122含量会明显下调[33]。miR-122在正常肝脏细胞中发挥重要调控作用，比如调控肝细胞的生长、脂肪酸代谢、胆固醇代谢等[34-36]。尽管miR-122与靶基因3’端非编码区的配对结合效应对丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV) 的复制是至关重要的[37]，但是对于HBV，miR-122显然是可以起到抗病毒的抑制作用，因为miR-122可直接互补配对pgRNA，或者互补配对HBV聚合酶的mRNA的5’端非编码区保守序列，从而下调了病毒的基因复制和病毒蛋白表达。显然miR-122的表达量和HBV的病毒载量呈负相关[30]，这说明宿主的miRNA可以通过经典RNAi途径抑制病毒复制，也许刺激miR-122的表达是一种潜在的治疗乙肝疾病的新疗法。
4 病毒利用RNAi加强对宿主的感染效率在漫长的病毒-宿主共同进化过程中，二者之间的“军备竞赛”从来没有停息，可谓是“道高一尺，魔高一丈”。实际上，不仅是动物细胞可以利用RNAi途径来对抗病毒，病毒也可以利用RNAi途径来加强自身对于宿主细胞的感染效率。早期关于疱疹病毒科的EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) 的研究就发现EBV的基因组编码一些与宿主同源的miRNA，EBV利用这些病毒基因组携带的miRNA可以干扰宿主细胞的凋亡从而达到自身潜伏、繁殖的目的[38]。EBV病毒基因组中至少携带了两类有功能的miRNA，一类是miR-BHRF1 (miRNA-BamHI fragment H rightward open reading frame 1)，另一类是miR-BART (miRNA-BamHI-A region rightward transcript)[39]。miR-BHRF1具有和凋亡相关基因Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) 同源序列，进而利用RNAi途径干扰宿主细胞、操纵宿主细胞。Pfeffer等认为，EBV编码的miRNA可能干预了宿主细胞的分裂、凋亡、细胞因子和趋化因子的释放、信号转导等过程，间接增强了病毒的繁殖性和适应性[38]。人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV) 编码的miRNA——miR-UL148D可以以类似的机制靶向抑制IER5基因(Immediate early response gene 5)[40]。因为IER5是p53的一种靶基因，有抑制细胞分裂的功能，HCMV即可利用RNAi途径干涉宿主细胞的细胞周期调控轴，从而实现病毒的潜伏并延长其生命周期。
动物病毒不仅可以利用RNAi来潜伏，还可以利用RNAi来逃逸动物体的免疫系统监视。Bauman等[41]利用多瘤病毒(Human polyoma virus) 感染模型发现，人类多瘤病毒JCV和BKV所编码的miRNA可以靶向抑制应激配体基因ULBP3 (UL16-binding protein 3)。因为ULBP3蛋白的受体是自然杀伤(Nature killer，NK) 细胞表面的NKG2D (Natural killer group 2，member D)[42]，所以ULBP3的下调就会导致NK细胞的免疫杀伤作用降低，从而出现了病毒的免疫逃逸现象。
5 总结与展望综上所述，病毒诱导的动物细胞RNAi途径至少包括3类(表 1)。第一类[9, 22]：病毒基因组RNA被宿主动物细胞所识别，然后切割产生siRNA，最后进入靶向降解途径从而起到抗病毒免疫的作用，这一机制从低等无脊椎动物到高等哺乳动物保守存在，是一种长久以来未受到足够关注的内在免疫机制，这一类型也是本文论述的重点。第二类[30]：宿主细胞编码的、固有的胞内miRNA直接结合病毒RNA，利用经典RNAi途径(Dicer-miRNA-AGO) 切割病毒的遗传物质。第三类[38, 42]：病毒基因组编码了宿主miRNA相关基因的序列，这些miRNA从病毒的遗传物质中转录出来，进而干扰了宿主细胞的细胞凋亡、分裂分化、免疫调控等通路，以此加强病毒侵染效率和存活机会。可见三类途径的区别主要是小RNA的性质和来源不同，引发的生物学效应不同。三类途径在同一条轴线上(Dicer-AGO-RNAi)，却展现出两种力量(病毒和宿主) 的斗争角力。这启示我们对于经典的生物学途径需要进一步发掘其独特的内涵，既要从正向的思路去阐释机制，又要探索截然相反的拮抗效应。众所周知，目前特异的、可靠的、高效的抗病毒药物少之又少，解析病毒介导的动物细胞RNAi途径与机制，有助于寻找新的靶点开发抗病毒药物，推动生物医药和人类健康事业的发展。基于上述分析，我们认为该领域还有以下生物学问题需要解决，这些展望可能成为未来探索的方向。
表 1 病毒介导的三类RNAi途径比较Table 1 Comparison of 3 types of RNAi pathways mediated by viruses
| Classification | Type 1 | Type 2 | Type 3 |
| Function | Enhance host immunity | Enhance host immunity | Facilitate virus survival |
| sRNA | siRNA | miRNA | miRNA |
| Source of sRNA | Viral genomic RNA | Transcripts from host miRNA genes | Transcripts from viral genome |
| Protein effector | RdRP, HEN1, Loqs-PD, Dicer, AGO2 | Drosha, Loqs-PB, Dicer, AGO1 | Dicer, AGO1 |
| Virus | FHV, EV71, Zika virus | HBV | EBV, JCV, BKV |
| Reference | [7-11, 22-23] | [30] | [38-42] |
表选项
5.1 动物病毒介导RNAi的广泛性动物病毒介导RNAi是否具有广泛性和保守性是一个值得探讨的问题。实际上目前的研究只确认了非常有限的几种病毒可以诱导宿主细胞的RNAi应答，然而是否所有的动物病毒都会引发宿主细胞RNAi抗病毒响应？如果不是，造成这种差异的原因是什么？动物病毒的种类繁多，DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒等不同病毒分类单元之间没有明显的进化关系，而且各自的生活周期、复制模式都有着极大的差异性。之前关于病毒RNAi途径的研究对象多是RNA病毒，那么DNA病毒和逆转录病毒是否会引发宿主细胞的RNAi抗病毒机制还需要进一步的研究确认[43-44]。理论上来说DNA病毒和逆转录病毒的侵染和繁殖都要涉及到相应的RNA分子，那么可以推测RNAi对DNA病毒和逆转录病毒很可能也起作用。
动物病毒的基因组和宿主细胞的基因组之间有着重要的联系[45]，宿主细胞基因组的miRNA原始基因也有迁移到病毒基因组当中的可能性。那么病毒基因和宿主基因之间的RNAi途径就像是一种桥梁，它在进化当中起到了中介作用，RNAi在病毒和宿主之间的双向调节是很有意思的科学问题。
5.2 动物RNAi抗病毒通路与其他免疫机制的关系早期的研究证明了一些宿主的miRNA分子能够激活Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs) 从而开启TLR介导的抗病毒天然免疫途径。人类免疫缺陷病毒(HIV) 的ssRNA40和哺乳动物的miRNA let-7b有一定的同源性，TLR7可以特异性识别miRNA let-7b的GU富集的结构域[46-48]，由此，我们可以大胆推测病毒来源的siRNA也可能会激活TLR免疫途径从而抑制病毒的复制。此外维甲酸诱导基因Ⅰ (Retinoic acid-inducible gene 1，RIG-Ⅰ) 样受体(RIG-Ⅰ-like receptors) 介导的RLH (RIG-Ⅰ-like helicase) 信号通路也可以识别双链RNA而触发抗病毒免疫反应[49-53]，cGAS- STING通路也有类似的功能[54-56]。RNAi抗病毒通路源自古老的机制，但它绝对不是孤立的机制。我们知道，抗病毒免疫也是一个极其复杂的多组分参与的过程，所以RNAi抗病毒通路与RLH通路、cGAS-STING通路的关系也值得探讨。
5.3 病毒siRNA是否具有血液循环性和胞间扩散性实际上，RNAi途径不是仅仅局限在细胞内，Chen等[57]首先在血清中发现了循环miRNA，循环miRNA一般通过细胞破裂、外泌体释放、RNA结合蛋白释放等途径进入动物体的体液内环境，血浆的循环miRNA可以通过血液循环被远距离的体细胞再摄取，从而远距离调控靶细胞[58-59]。进一步研究发现，循环miRNA不仅可以跨细胞传递，还可以跨物种传递，植物的miRNA可以被人类的消化道吸收进入血液进而调控人类的体细胞的基因表达[60]。例如中草药忍冬，俗名金银花Lonicera japonica的miR2911就可以被人体吸收进入血液循环系统，而miR2911则可以靶向抑制多种病毒的mRNA翻译[61-63]。2020年的最新研究表明miR2911可抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2的复制，加快感染病人转阴进程[64]。近年来的研究表明循环系统中的RNA不仅可以作为病毒性疾病的诊断标志物，而且也是潜在的治疗靶点[65-69]。这一系列研究具有独特的启示，这暗示病毒来源的siRNA很可能可以在胞间扩散传输，病毒入侵的信号可以通过siRNA传输到其他组织或器官，并实现动物体系统性的RNAi免疫应答，我们认为，这是一个非常有价值的假说，可能是未来研究的热点问题。
5.4 piRNA与抗病毒机制piRNA在早期被误认为是miRNA，后来证实，piRNA与miRNA有完全不同的基因来源，但是二者最终都会与具有PIWI结构域的蛋白(AGO家族蛋白) 装配形成复合体以降解与之互补配对的RNA，目前认为，piRNA在动物的生殖系细胞中比较丰富，并且抑制转座子活性[70]。最新的研究发现piRNA的功能不局限于抑制基因转座[71-75]，宿主细胞的piRNA也可以发挥抵御病毒的作用。2017年Sun等[76]首次发现，鸡精巢细胞中piRNA可以与禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV) 的RNA互补以抵抗病毒的入侵。2019年Yu等[77]利用考拉(Koala) 模型揭示了哺乳动物细胞利用piRNA抵御逆转录病毒的机制，值得注意的是，这些抗病毒的piRNA并非来源于宿主细胞基因组的PIWI簇，而是来源于病毒的转录本。综上所述，piRNA的抗病毒机理值得探讨，研究piRNA与siRNA抗病毒机制的关联与差异都是非常有价值的科学问题。已知piRNA对于逆转录转座子有抑制作用，而逆转录转座子的转座机制与逆转录病毒入侵宿主基因组的机制是非常类似的，甚至很多转座子序列在进化上来源于逆转录病毒，因此可以推测piRNA可能是对抗逆转录病毒的有效方式。目前抗病毒piRNA的来源存在争议[78]。piRNA抗病毒途径是否独立于其他经典途径尚属未知，动物细胞利用piRNA的抗病毒机理尚需要深入研究。
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