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高效装载细胞内源蛋白工程化外泌体的构建

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

黄琳1,2*, 王殿冰2*, 顾宁1, 张先恩1,2,3
1. 东南大学 生物科学与医学工程学院,江苏 南京 210096;
2. 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物大分子研究中心 生物大分子国家实验室,北京 100101;
3. 中国科学院大学,北京 100049
收稿日期:2019-04-06;接收日期:2019-05-20;网络出版时间:2019-06-18
基金项目:国家自然科学基金重大项目(No. 21890743),国家重点研发项目(No. 2017YFA0205503)资助

摘要:外泌体作为天然药物运送载体具有诸多优点,但其对细胞内源药物(蛋白、核酸等)的有限装载限制了其应用。文中以红色荧光蛋白mCherry为模拟细胞内源性货物,通过对供体细胞的基因改造及采用膜定位元件融合策略,将mCherry富集于细胞质膜,再经天然发生(Biogenesis)途径,高效分选进入外泌体。结果表明,在CAAX、PB、Palm和CD63四组膜定位元件中,CD63和Palm能有效提高靶蛋白mCherry在外泌体中的装载量。该研究可为工程化外泌体的设计、内源蛋白等货物的高效递送提供参考。
关键词:外泌体药物运送载体内源蛋白膜定位元件装载效率
Construction of engineered exosomes with high loading efficiency of cellular endogenous proteins
Lin Huang1,2*, Dianbing Wang2*, Ning Gu1, Xian-en Zhang1,2,3
1. School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096, Jiangsu, China;
2. National Laboratory of Biomacromolecules, CAS center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received: April 6, 2019; Accepted: May 20, 2019; Published: June 18, 2019
Supported by: the Major Program of National Natural Science Foundation of China (No. 21890743), the National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFA0205503)
Corresponding author: Xian-en Zhang. Tel: +86-10-64888148; E-mail: zhangxe@ibp.ac.cn.
*These authors contributed equally to this study

Abstract: Exosomes have many advantages as natural drug delivery carriers, but their application is limited by the inefficient loading of intracellular drugs (such as proteins and nucleic acids). In this study, mCherry, a red fluorescent protein, was used as the endogenous cargo target. Through gene modification of donor cells and fusion expression of membrane localization elements (PB, CAAX, Palm and CD63), mCherry was specifically sorted into exosomes through biogenesis. Results show that CD63 had the highest sorting efficiency, followed by Palm. PB and CAAX led enrichment of mCherry on the plasma membrane, but not in exosomes. The approach provides an alternative to facilitate packaging of cargo by exosomes and thus to increase the efficient delivery of endogenous protein drugs.
Keywords: exosomedrug delivery carrierendogenous proteinmembrane localization elementloading efficiency
外泌体是一种由细胞分泌到胞外的脂质双层纳米囊泡,尺寸介于30–150 nm[1]。研究表明,外泌体在自然发生过程中,能够包裹细胞中的生物活性成分(如蛋白质、脂质和核酸等),并将其携带到相邻或远端的细胞中发挥功能[2],因而被认为是细胞间通信的一类介质[3]。此外,外泌体中的成分还能调节细胞的生理病理过程,反映细胞状态变化[4-5]。这些性质使外泌体成为疾病诊断标志物[6]和天然药物运送载体[7]的研究热点。其主要优点包括[8-10]:1)外泌体来自身体各个组织,在体液中稳定存在,作为疾病标志物,易于检测,并能反映疾病异质性及发生发展;2)外泌体起源于自身细胞,作为药物载体,免疫原性低、稳定,甚至能穿过血脑屏障;3)在体外,由于蛋白活性及RNA稳定性都会受到外界因素影响,因此,外泌体能装载细胞内源药物的特点,使得其作为药物运送载体还具有保护药物活性及稳定性的优势。目前,外泌体已被用于多种药物的递送载体,包括小分子、蛋白质和核酸[11-16],显示较好的治疗效果[17-18]。然而,在自然发生(Biogenesis)条件下,外泌体对胞内药物的装载量有限,尚难以推广应用[19]
外泌体对药物的装载方式主要包括两种,即外源货物装载和内源货物装载[8]。其中,外源货物装载主要是通过电转、超声、冻融、挤出及转染等方法使外源药物载入外泌体中;内源货物装载主要是通过外泌体的生物起源使细胞内的药物装载到外泌体中。为了提高外泌体对药物的装载量,已有研究通过外泌体的生物起源成功实现了内源药物在外泌体中的有效装载[16, 20]。但更高效的药物装载,需要更清楚地了解外泌体对货物的包装机理,从而调控货物的分选。因此,如何使细胞内的货物能更好地富集到外泌体仍然是一个挑战。
基于外泌体膜起源于细胞质膜,并且会选择性分选含有某些特定物质膜的特点[21],在前期工作中,我们针对长链RNA药物难以高效递送的难题,发展了一种基于外泌体的新型光控纳米递送系统。该系统利用膜定位元件、光控元件以及外泌体的生物起源,通过microRNA-21治疗剂(miR-21海绵)在细胞膜的高效富集、光控释放,实现了miR-21海绵的内源高效装载和对白血病细胞的靶向递送,为肿瘤个体化基因诊疗提供了新的途径[22]。本研究则聚焦于蛋白类货物在外泌体中的高效装载,其研究设想是,以红色荧光蛋白mCherry作为模拟装载货物,通过在外泌体供体细胞中融合表达mCherry与膜定位元件,探讨不同膜定位元件对mCherry在外泌体中装载量的影响,进而为外泌体高效递送蛋白类药物提供参考。
1 材料与方法1.1 主要材料Lipofectamin3000、蛋白预染marker、4 μm乳胶珠及细胞培养瓶购于Invitrogen公司。DMEM、胎牛血清(FBS)及Opti-MEM medium购于GIBCO公司。RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒及ECL显色液购于碧云天生物技术有限公司。限制性内切酶购于NEB公司。感受态购于北京全式金生物技术有限公司。超滤管和聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜均购自Millipore公司。抗体购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。胶回收试剂盒购于美国Omega公司。PCR引物合成及DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2 方法1.2.1 质粒构建及慢病毒包装为了构建相关质粒载体,首先将慢病毒载体PLVX用AfeⅠ和MluⅠ酶进行双酶切,其酶切后的产物用胶回收试剂盒进行回收。Palm、CAAX和PB三个膜定位序列则设计到PCR引物上,通过PCR扩增与mCherry进行连接。CD63与mCherry通过EcoRⅠ的酶切位点进行连接。上述连接后的产物与PLVX载体通过AfeⅠ和MluⅠ位点进行连接。
上述表达质粒构建好后,先将293T细胞接种于6孔板中,待细胞融合度为60%–70%时,参照Lipofectamin 3000转染试剂使用说明书将目的质粒与辅助包装质粒pLP1、pLP2及VSVG以3︰1︰ 1︰1共转染入293T细胞中。转染48 h后,1 000 r/min离心10 min收集富含慢病毒颗粒的细胞上清。收集的病毒液分装至EP管中,?80 ℃保存备用。
1.2.2 慢病毒浸染及稳转细胞系的建立将293T细胞在含10%胎牛血清及双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养,并置于37 ℃、5% CO2条件的培养箱中。待细胞融合度为50%时,加入一定量的病毒液及4 μg/mL的聚凝胺(Polybrene)浸染细胞。24 h后用新鲜培养基替换含病毒的培养基,48 h后用荧光显微镜对细胞进行荧光检测。待观察到细胞有荧光时,加入含有嘌呤霉素(4 μg/mL)抗生素的新鲜培养基对稳转细胞进行抗性筛选。
1.2.3 细胞培养及外泌体的分离筛选得到上述稳转细胞后,对其进行扩大培养,待细胞长到60%–70%的汇度后,把培养基换成含有10%外泌体去除FBS的培养基进行培养。48 h后,收集细胞培养上清,并于4 ℃、500×g离心5 min,以去除其中残存的细胞。然后,4 ℃、2 000×g离心10 min,以去除上清中残存的细胞碎片,10 000×g再次离心30 min可得到微囊泡体。最后,将上清于100 000×g下离心120 min,即可得到外泌体沉淀。弃去上清,用PBS清洗沉淀后再次离心,即可得到较为纯净的外泌体。
1.2.4 外泌体的形态观察首先,把10 μL一定浓度的外泌体滴加到300目铜网上,室温吸附5 min,滤纸吸除多余的液体。然后,滴加10 μL 4%的醋酸双氧铀,室温染色1 min,晾干。最后,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)对其进行成像分析。
1.2.5 外泌体的荧光分析首先,把10 μL外泌体(或微囊泡体)分别加入5 μL的乳胶珠(4 μm)中,室温旋转孵育15 min。然后,用PBS稀释至500 μL,室温旋转孵育30 min。随后,通过加入500 μL含100 mmol/L甘氨酸和2% BSA的PBS终止反应,并用1%的BSA洗涤结合了外泌体的珠子3次。用400 μL PBS重悬后,即可用流式细胞分析仪对其进行荧光检测。
1.2.6 外泌体的蛋白免疫印迹分析(Western blotting,WB)通过离心收集外泌体(或微囊泡体)沉淀后,加入一定量的RIPA裂解液提取总蛋白,并根据BCA试剂盒说明书对提取的总蛋白进行定量检测。随后,向样品中加入上样缓冲液,开水煮沸5 min使蛋白充分变性。蛋白变性后,将其加到12%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离(200 V)。待电泳分离后,使用电转仪将蛋白转到PVDF膜上。然后,将PVDF膜放在5%的脱脂奶粉中室温封闭2 h,并依次加入特异性的一抗及酶标二抗进行孵育。最后,加入ECL发光液,并用凝胶成像分析系统对蛋白进行成像分析。
1.2.7 胞内体及外泌体的成像分析构建好表达不同mCherry融合蛋白的稳转细胞系后,将其培养到玻底小皿中。待其长到一定密度后,即可通过结构光照明显微镜(Structure light illumination microscope, SIM)对细胞中的mCherry进行成像分析。外泌体则直接滴加到载玻片上,将其进行封片后,即可用SIM显微镜进行成像分析。
2 结果与分析2.1 膜定位融合蛋白mCherry的设计与表征为了使mCherry固定到细胞质膜上,3种膜定位肽和1种跨膜蛋白被用来与其融合表达,分别为PB、CAAX、Palm及CD63蛋白。四种膜结合元件与膜的相互作用原理如图 1所示。其中,PB和CAAX融合在了mCherry的C端,Palm和CD63融合在了mCherry的N端,具体构建如图 2A所示。表达融合蛋白的各基因片段构建好后,将其连接到慢病毒载体PLVX上。然后,通过慢病毒浸染的方法构建相应的稳转细胞系。虽然,融合膜定位元件后的mCherry可以固定到细胞膜上,但4种融合蛋白与膜的结合原理都不相同。因此,不同的mCherry融合蛋白在细胞中的分布也会不同,其成像结果如图 2B所示。从图中的结果可以看到,没有融合膜定位元件的mCherry分布于整个细胞质中,融合PB和CAAX后的mCherry主要被固定到了细胞质膜上,而与CD63和Palm序列融合后的mCherry在细胞质膜和细胞内都有定位。
图 1 四种膜定位元件与细胞膜相互作用原理[23-26] Fig. 1 Diagrams of the interaction of four membrane localization elements with plasma membrane[23-26]
图选项




图 2 mCherry与不同膜定位元件融合表达设计与实验结果(A:用于表达融合蛋白mCherry的质粒示意图;B:表达不同mCherry融合蛋白稳转细胞系的荧光成像) Fig. 2 Design and experimental results of mCherry fused with different membrane localization elements. (A) Schematics of plasmids used for producing fused mCherry protein. (B) Fluorescence imaging of stable cell lines expressing different mCherry fusion proteins
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2.2 外泌体的表征通过对5种稳转细胞系的扩大培养,采用差速离心法分别提取了相应细胞所分泌的外泌体,即所设计的工程化外泌体。接下来WB、TEM和SIM对提取物进行了外泌体性质表征。WB分析表明,5种细胞中只有过表达CD63的细胞才有相应的条带,而5种细胞所产生的外泌体均含有CD63,说明外泌体具有富集CD63的功能(图 3A);在电镜下,提取物呈现茶托状,大小在150 nm左右(图 3B)。
图 3 外泌体的表征(A:外泌体中CD63和β-actin蛋白的WB分析;B:外泌体的TEM成像;C:外泌体的SIM超分辨显微成像) Fig. 3 Characterization of exosomes. (A) Western blotting analysis of exosomes with antibodies against CD63 and β-actin. (B) TEM imaging of exosomes. (C) SIM imaging of exosomes
图选项




SIM成像进一步对所收集的外泌体进行了分析,以验证其中的确有mCherry的红色荧光,结果如图 3C所示,没有表达mCherry细胞来源的外泌体中几乎没有红色荧光,而表达CD63-mCherry细胞来源的外泌体中有大量的红色荧光,说明mCherry被外泌体成功包装。
2.3 外泌体中mCherry装载量的分析由于所选4种膜定位元件的细胞膜结合原理各不相同,它们分别与mCherry融合后可能导致不同的分选效率,因此,提取4种稳转细胞系所分泌的外泌体后,对其中的mCherry含量进行了WB分析比较。如图 4A所示,除了无膜定位元件的mCherry对照组外,其余4种都含有mCherry,其中CD63组含量最高,Palm组次之,CAAX和PB组中mCherry的量很少。图 4A中mCherry融合物具有不同的迁移率,这是因为融合了不同分子量的膜定位蛋白所致。流式细胞分析表明(图 4B),CAAX、PB、Palm和CD63对应外泌体中mCherry的阳性率分别为8.9%、7.3%、23.2%和56.7%,而无膜定位元件的对照组中mCherry阳性率只有4%。上述结果表明,4种膜定位序列都具有将靶蛋白定位在细胞膜并分选入外泌体的能力,以CD63的效果最为明显。
图 4 外泌体中mCherry的定量分析 Fig. 4 Quantification of mCherry in exosomes. (A) Western blotting analysis. The lanes 1–5 were exosomes derived from cells with stable expression of mCherry, mCherry-CAAX, CD63-mCherry, Palm-mCherry, mCherry-PB protein, respectively. β-actin is the internal reference protein. (B) The flow cytometry analysis. The lanes 1–5 were exosomes derived from cells with stable expression of mCherry, mCherry-CAAX, mCherry-PB protein, CD63-mCherry, Palm-mCherry, respectively
图选项




2.4 微囊泡体中mCherry装载量的分析微囊泡体中mCherry的分析结果如图 5所示。其中,Western blotting结果表明,除了无膜定位元件的mCherry外,其余几种都含有mCherry。流式细胞分析结果表明,CAAX、PB、Palm及CD63对应微囊泡体中mCherry的阳性率分别为12.0%、10.8%、17.7%和20.6%。因此,在微囊泡体中,4种mCherry融合蛋白在其中的富集效果差别不大,且都不如外泌体中CD63-mCherry的富集效果好。
图 5 微囊泡体中mCherry的定量分析 Fig. 5 Quantification of mCherry in microvesicles (MVs). (A) Western blotting analysis. The lane 1–5 were microvesicles derived from cells with stable expression of mCherry, mCherry-CAAX, CD63-mCherry, Palm-mCherry, mCherry-PB protein, respectively. β-actin is the internal reference protein. (B) The flow cytometry analysis. The lane 1–5 were microvesicles derived from cells with stable expression of mCherry, mCherry-CAAX, mCherry-PB protein, CD63-mCherry, Palm-mCherry, respectively
图选项




2.5 mCherry在细胞中的定位分析不同mCherry融合蛋白在外泌体中存在装载量差异,这可能与外泌体的生物起源有关。如图 6A所示,外泌体是通过细胞质膜的内吞、多囊泡体形成以及多囊泡体与细胞质膜融合释放所形成。为了分析分选量差异的原因,SIM超分辨成像技术对4种细胞中mCherry的定位进行了分析。结果表明,不同的膜定位元件会使mCherry被定位到细胞的不同膜结构(图 6B)。其中,CAAX和PB序列能使mCherry定位到细胞质膜上,但几乎不定位在内囊泡膜上,而Palm和CD63会使mCherry同时靶向到细胞质膜和内囊泡膜(后者为细胞中红色聚集亮斑),CD63的这种功能最为明显。
图 6 mCherry在细胞中的定位分析(A:外泌体的生物发生起源示意图;B:mCherry融合不同的膜定位元件后在细胞中的SIM成像) Fig. 6 The localization analysis of mCherry in cells. (A) The biogenesis of extracellular vesicles (EVs). (B) SIM imaging of mCherry with different membrane located elements in cells
图选项




3 讨论针对外泌体载药效率低的缺点,通过在蛋白一端融合表达膜定位元件使其富集到细胞质膜上的方法已有不少研究,例如,通过CD9[27]、CD63[28]、Lamp2a[29]和Palm[25]等的膜定位作用,已实现了细胞内源RNA和蛋白在外泌体中的富集。但由于外泌体中蛋白的分选机理也还未完全被了解,哪一种膜定位序列能更好提高蛋白在外泌体的装载效率也未见研究报道,因此,本文选择了几种具有不同细胞膜结合原理的元件对其进行分析,包括CAAX、PB和Palm三个膜定位肽,以及CD63跨膜蛋白。
Western blotting和流式细胞技术对5种稳转细胞系来源外泌体中mCherry的半定量分析表明,4种膜定位元件都能提高mCherry在外泌体中的装载量,但效率各不相同。如图 1所示,PB携带正电荷,与细胞质膜上带负电的磷脂酰肌醇静电作用而固定到膜上[23]。CAAX是通过异戊二烯基团法尼基与细胞质膜上磷脂双分子层的相互作用而与膜结合[24]。Palm则通过半胱氨酸与脂肪酸棕榈酸之间的硫酯键作用与细胞质膜结合[25]。CD63是一个富集在外泌体中的四跨膜蛋白[26]。所以,上述4种膜定位元件可以使mCherry结合在细胞质膜的不同成分上,而外泌体对细胞质膜上不同成分的选择性分选富集,就会导致融合有不同膜定位元件的mCherry随与之相互作用的成分以不同的量分选到外泌体中。对此,细胞中mCherry的SIM成像分析也证明了4种膜定位元件使mCherry以不同量定位在了外泌体起源的内囊泡上。此外,微囊泡体中4种mCherry融合蛋白的装载量分析结果显示,4种融合蛋白在微囊泡体中的富集效果相似。其中,CAAX和PB与外泌体中的几乎相同,但CD63和Palm都没有外泌体中的效果好。虽然微囊泡体的膜是直接起源于细胞质膜,但mCherry在细胞质膜上的富集并没有使其在微囊泡体中产生大的富集量。该结果也可以说明外泌体会对细胞质膜上的成分进行选择性富集。而且,通过在细胞膜上富集的方法,外泌体比微囊泡体能更好地分选细胞内源蛋白。
以mCherry作为模拟蛋白,虽然CD63蛋白和Palm都很好地提高了mCherry在外泌体中的装载量,但本研究只选择了部分膜定位元件进行分析,而更好地提高蛋白在外泌体中的分选量,还需基于外泌体对蛋白的分选机理,对更多的膜定位元件进行分析。而且,装载药物时该装载效率能否使之在细胞中达到治疗效果,以及该工程化外泌体所装载的药物是否具有活性都需验证。此外,由于外泌体对蛋白的分选具有复杂的机理,而不只是单一因素决定,因此不同膜定位元件是否对所有蛋白都具有相似的效果也需要进一步验证。
综上,本研究不仅证明了不同的膜定位元件可以使mCherry在外泌体中产生装载量的差异,还初步分析了其产生差异的可能原因,确定了CD63是其中能使靶蛋白更好分选入外泌体中的膜定位元件。
致谢:感谢生物成像中心(IBP-CAS),特别是李硕果,张龙龙等人对SIM、TEM工作的技术支持

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    本站小编 Free壹佰分学习网 2022-09-19
  • 细胞穿膜肽研究应用的新进展
    谢洋洋1,3,王邵娟2,3,袁权2,3,夏宁邵2,31.厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;2.厦门大学公共卫生学院,福建厦门361102;3.国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,福建厦门361102收稿日期:2019-01-15;接收日期:2019-03-25基金项目:国家自然科学基 ...
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  • 微生物微培养系统研究现状与展望
    陈政霖1,2,马春玄1,2,邢新会1,2,3,张翀1,2,31.清华大学化学工程系生物化工研究所,北京100084;2.工业生物催化教育部重点实验室,北京100084;3.清华大学合成与系统生物学中心,北京100084收稿日期:2019-03-13;接收日期:2019-05-14基金项目:国家重大科 ...
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  • 微生物法合成红景天苷
    薛飞燕,杨明峰,马兰青北京农学院生物与资源环境学院农业部华北都市农业重点实验室,北京102206收稿日期:2018-11-01;接收日期:2019-02-27基金项目:国家自然科学基金(Nos.21606020,31370674)资助摘要:红景天苷是红景天属植物的主要有效成分之一,具有耐缺氧、抗辐射 ...
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  • 双特异性抗体在抗病毒方面的研究进展
    翟贯星1,陆璐2,路慧丽3,陈代杰31.上海师范大学生命科学学院,上海200234;2.华东理工大学生物工程学院,上海200237;3.上海交通大学药学院,上海200240收稿日期:2019-01-21;接收日期:2019-05-28;网络出版时间:2019-06-10摘要:随着基因工程抗体的快速发 ...
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  • 滚环扩增信号放大技术在生物检测中应用的研究进展
    占忠旭,刘巨,陈博璐,汤奕舟,陈官华,许恒毅南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌330047收稿日期:2018-11-17;接收日期:2019-01-16;网络出版时间:2019-02-19基金项目:南昌大学食品科学与技术国家重点实验室研究基金(No.SKLF-ZZB-201720)资助摘 ...
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  • 啤酒酵母细胞壁环境压力应答机制研究进展
    张明芳1,2,王金晶1,2,钮成拓1,2,李永仙1,2,郑飞云1,2,刘春凤1,2,李崎1,21.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学酿酒科学与工程研究室,江苏无锡214122收稿日期:2018-12-11;接收日期:2019-02-18;网络出版时间 ...
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  • 微生物1, 3-1, 4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展
    钮成拓1,2,李昕玥2,许鑫1,2,包敏1,2,李永仙1,2,刘春凤1,2,郑飞云1,2,王金晶1,2,李崎1,2,31.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;3.江南大学食品安全与营养协同创新中心,江苏无锡21412 ...
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  • 中试制备临床级别第三代慢病毒
    段德明,季永飘,周梦洁,高基民温州医科大学检验医学院生命科学学院,浙江温州325035收稿日期:2019-04-07;接收日期:2019-06-14;网络出版时间:2019-06-24基金项目:国家自然科学基金(Nos.81573110,91729101)资助摘要:基因治疗是一个快速发展的领域,其中 ...
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  • 基于TCGA数据预测肿瘤代表性新抗原的一种生物信息学新方案
    黄传玺1,3,马洁2,3,吴琛1,朱云平2,31.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,北京102206;3.蛋白质组学国家重点实验室国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质药物国家工程研究中心,北京102206收稿日期:2019-01- ...
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  • 天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化
    吴傲,张显,徐美娟,杨套伟,李华钟,饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122收稿日期:2019-01-19;接收日期:2019-03-13;网络出版时间:2019-06-10基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金(No.JUSRP51708A),江苏高校优势学科 ...
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