南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047
收稿日期：2018-11-17；接收日期：2019-01-16；网络出版时间：2019-02-19
基金项目：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室研究基金（No. SKLF-ZZB-201720）资助
摘要：滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)是一种快速、灵敏且恒温的单链DNA (Single-stranded DNA，ssDNA)扩增技术，与染色或探针联用可实现检测信号的放大，在生物检测等方面得到广泛的应用。文中对RCA的构建方法进行了简介，综述了近几年其在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒等检测中的研究进展，并对其未来的发展趋势进行了展望。
关键词：滚环扩增恒温生物检测
Progress in rolling circle amplification in biological detection
Zhongxu Zhan, Ju Liu, Bolu Chen, Yizhou Tang, Guanhu Chen, Hengyi Xu
State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, Jiangxi, China
Received: November 17, 2018; Accepted: January 16, 2019; Published: February 19, 2019
Supported by: Research Foundation from State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, China (No. SKLF-ZZB-201720)
Corresponding author: Hengyi Xu. Tel: +86-791-88304447/99520; Fax: +86-791-88304400; E-mail: kidyxu@163.com, HengyiXu@ncu.edu.cn.
Abstract: Rolling circle amplification is a rapid, sensitive and isothermal single-stranded DNA amplification technique that can be used with staining or probes to amplify the detection signal. This technology has been widely used in biological detection and other aspects. The present paper introduces how to design rolling circle amplification, summarize its application in the detection of pathogens, nucleic acid tumor markers, proteins, biological small biomolecules, and viruses in recent years and prospects for future development.
Keywords: rolling circle amplificationisothermalbiological detection
滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)是建立于20世纪90年代中期的DNA扩增技术，该技术是借鉴自然界中环状病原生物体DNA分子滚环式复制方式发展的一种恒温扩增技术，在研究初期就得到科研人员的高度关注[1-2]。RCA反应发生的关键在于构建一个完整的单链DNA环用于后续扩增，RCA成环方式包括粘性末端成环和平末端成环。RCA主要有线性RCA (Linear RCA，LRCA)、超分支RCA (Hyper branched RCA，HRCA)和多引物RCA (Multiple primer RCA)等[3]。文中总结了常见的RCA构建方法，综述了其在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测中的应用，并对其未来的发展趋势进行了展望。
1 RCA构建成环分类1.1 锁式DNA成环锁式DNA成环方式指运用一条线状的DNA为引物将锁式DNA的5′端和3′端拉近，从而形成带有缺口的环状DNA (图 1A)。在T4 DNA连接酶的作用下将带缺口DNA连接成完整的环状模板，加入核酸外切酶将引物裂解从而生成一个完整的环状模板用于后期扩增[4-5]。
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| 图 1 RCA构建成环分类 Fig. 1 The classification of RCA loop. (A) Padlock DNA loop. (B) Dumbbell DNA loop. (C) Blunt-end loop. |
| 图选项 |
1.2 哑铃DNA成环相比锁式DNA成环，哑铃状DNA成环方式不需要额外添加引物，如图 1B所示，通过对DNA进行设计使其自身杂交成哑铃状模板，从而将5′端和3′端拉近，进而用T4 DNA连接酶直接连接成环状模板。哑铃状DNA环虽然设计相对复杂，但避免了用外切酶将DNA裂解的步骤[6-7]。
1.3 平末端成环前两者都是将DNA的5′端和3′端拉近，形成粘性末端成环。平末端成环方式异于粘性末端成环，如图 1C所示，将DNA设计成含有平末端的发卡结构，发卡结构的5′与另外一个发卡的3′在T4 DNA连接酶的作用下连接成完整的哑铃状的环状DNA[8]。平末端成环方式相对哑铃DNA成环方式在DNA设计上更简单，但其成环效率不如粘性末端成环方式高。
2 滚环扩增信号放大技术的分类2.1 线性RCA线性RCA也被称为单引物RCA，如图 2A所示，单链引物与环状模板进行结合，在DNA聚合酶的作用下，引发链沿着环状模板从5′–3′方向进行延伸，催化dNTPs合成单链DNA分子。当完成一圈复制后，在DNA聚合酶的催化以及核酸链间位移活动的作用下，新合成的核酸链取代之前的旧链进一步循环延伸。因此，可在短时间内快速产生大量的与环状模板链完全互补的DNA[9]。
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| 图 2 RCA的分类 Fig. 2 The classification of RCA. (A) Single primer RCA. (B) Hyper branched RCA. (C) Multiple primer RCA. |
| 图选项 |
2.2 超分支RCA超分支RCA也被称为指数RCA或双引物RCA，其原理和线性RCA相似，只是在扩增体系中加入第二条新的引物(与环状模板序列完全一致)。如图 2B所示，当发生线性RCA时第二条引物与其扩增产物结合并酶促延伸，置换掉下游杂交到扩增产物上的引物延伸链，之后置换掉的延伸产物又可以作为第一条引物的模板进行扩增，经过不断的延伸和置换，在短时间内扩增产物呈指数递增，最终扩增出不同长度的双链DNA，其扩增效率大于109[10]。
2.3 多引物RCA多引物RCA，即在RCA反应体系中引入多条引物参与扩增。如图 2C所示，在原理上其与线性RCA一样，多条引物与环状模板结合后在聚合酶的作用下进行延伸，上游引物延伸到下游引物的结合点并置换下游引物，可在短时间内得到大量的DNA[11]。
3 滚环扩增技术的应用RCA具有高扩增效率并且能在恒温条件下进行扩增，研究者们基于此建立了一系列生物检测方法，表 1概括了近年来RCA技术在生物检测中的应用。
表 1 RCA信号放大技术在生物检测物中的应用Table 1 Application of RCA signal amplification technology in biological detection
| Detector | Detection technology | Detection limit | References |
| Staphylococcus aureus | RCA-Chemiluminescence energy resonance transfer | 15 CFU/mL | [12] |
| Vibrio parahaemolyticus | RCA-Surface Enhanced Raman Scattering Technology | 2 CFU/mL | [13] |
| MiR-155 | RCA-Surface Enhanced Raman Scattering Technology | 70.2 amol/L | [14] |
| Let-7a | HRCA-G-quadruplex fluorescence method | 0.3 fmol/L | [4] |
| Fetoprotein | RCA-AuNPs colorimetric method | 33.45 pg/mL | [15] |
| Thrombin | RCA-Colorimetric sensor | 0.01 fmol/L | [16] |
| Prostate-specific antigen | RCA-Electrochemical sensors | 1.8 pg/mL | [17] |
| Ochratoxin A | RCA-Electrochemical sensors | 0.065 pg/mL | [18] |
| Influenza virus | PCR-RCA | 4.9 amol/L | [19] |
| Ebola virus | RCA-GO | 1.4 pmol/L | [20] |
表选项
3.1 致病菌的检测致病菌是能引起疾病的微生物，也被称为病原微生物。Hao等[12]设计了金黄色葡萄球菌与RCA引物竞争适配子序列从而释放出RCA引物的反应，进而引发RCA，产生ssDNA用于捕获游离的cDNA-ABEI-AuNFs复合物，从而较少量的复合物吸附于WS2纳米材料，保持原有化学发光，实现信号放大，结果表明在最优条件下该方法对纯培养的金黄色葡萄球菌的检测限可达15 CFU/mL。Yao等[13]建立了一种基于RCA结合表面增强拉曼散射技术用于检测水样本中的副溶血性弧菌，通过双抗夹心的方式将RCA引物带入反应体系进行RCA反应，从而产生一条很长的含有重复序列的ssDNA来捕获Au@Ag探针，提高反应体系中纳米粒子的富集量从而增强拉曼信号，该方法的检测限达到1 CFU/mL。黄梦琪等[21]将滚环扩增和试纸条显色相结合用于检测单增李斯特菌，将单增李斯特菌的hlyA mRNA作为引发链引发RCA，然后运用酶将扩增的单链产物剪切成短片段的ssDNA用于捕获探针和金标探针的“桥梁”，实现比色检测，在最优条件下检测限达到100 pg/μL。该方法可在几个小时内完成检测，在现场检测中具有较大的应用前景。本实验室前期建立了多个基于分子生物学和核酸信号放大的方法用于致病菌检测[22-24]，并建立了基于LRCA检测单增李斯特菌的方法。
3.2 核酸肿瘤标记物检测微小核糖核酸(MiRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的内源性的非编码单链RNA分子[25]，研究表明MiRNAs的异常表达与一些癌症(肺癌、胃癌、乳腺癌等)的发生具有密切联系，已被当作新型的肿瘤标记物，快速、灵敏和准确地检测MiRNAs，具有很高的应用前景[26]。Xu等[27]将回文DNA的互补序列设计在RCA模板上，通过Let-7a引发RCA反应产生大量的含有回文序列ssDNA，回文序列自身折叠形成含有双链结构的发卡DNA，SYBR Green Ⅰ嵌入双链中产生强荧光信号实现检测，结果表明该方法在最佳条件下检测限达6.4 pmol/L。Jiang等[4]建立了一种基于G-四链体荧光结合HRCA用于检测Let-7a，通过目的片段设计含有G-四链体和酶切位点的锁式探针，加入Let-7a引发RCA反应，产生大量的单链DNA片段并且被限制酶切割成不同的片段进一步引发RCA反应，产生大量富含G-四链体DNA片段。THT嵌入G-四链体序列产生强荧光信号达到检测的目的，结果表明，该方法对Let-7a的检测限为4 amol/L，线性范围为10 amol/L–1 nmol/L。Zhou等[28]建立了一种基于链置换反应与RCA相结合的双信号放大方法用于检测MiR-21，通过链置换反应产生大量的RCA引发链用于引发RCA反应，加入SYBR Green Ⅱ染料与ssDNA结合产生荧光实现检测，检测限达到1.0 fmol/L。
3.3 蛋白质的检测蛋白质作为生命体中重要的生物大分子，既能调控细胞代谢，又能作为目标分子用于监控疾病，因此，对蛋白质进行超灵敏的检测在临床诊断、病理学和遗传学等领域具有重要的作用[29]。Huang等[11]建立了一种基于HRCA结合G-四链体荧光传感器方法用于检测DNA甲基化酶，平末端发卡探针在T4 DNA连接酶作用下连接成哑铃状模板。当体系中不存在DNA甲基化酶时，限制性内切酶将哑铃状模板中的双链切割成不完整的环状DNA进而限制RCA反应，当加入DNA甲基化酶后，哑铃状的环状模板保持原有的结构，因而能引发RCA反应产生大量的G-四链体序列用于后续荧光检测。结果表明该方法的线性范围在0.008–50 U/mL，且检测限达到0.001 1 U/mL。Chen等[15]建立了一种基于RCA结合AuNPs比色的方法来检测甲胎蛋白，通过夹心模式将RCA体系带入酶标孔中，引发RCA反应，吸取上清液中未反应的锁式探针加入到AuNPs溶液中进行金保护，测定吸光度658/520对目标物进行定量。该方法能够特异性地检测甲胎蛋白且检测限为33.45 pg/mL，通过改变不同的抗体，该方法可用于检测不同的蛋白和病毒，具有较好的应用前景。
3.4 生物小分子检测生物小分子的灵敏检测在临床检查、环境监测和食品安全等领域极其重要，开发快速高效的检测方法意义重大。Zhang等[17]建立了一种光电化学传感器方法用于快速、灵敏地检测前列腺抗原(Prostate-specific antigen，PSA)，通过免疫学反应将引发链带入反应体系发生RCA反应，产生大量的富含G-四链体序列的DNA，加入氯化血红素形成过氧化物酶用于催化化学反应，从而使电极板上的电子传递受到阻碍产生电化学信号变化实现检测。在最优条件下该方法对PSA的检测限达到1.8 pg/mL。Lee等[30]将磁分离与RCA相结合用于PSA检测，特异性的PSA适配子作为磁珠和RCA产物的“桥梁”，并且引发RCA反应产生大量的G-四链体序列，加入甲基蓝染料结合G-四链体序列实现检测，该方法在PSA浓度为100 fmol/L–10 nmol/L时呈现很好的线性关系且检测限达到22.3 fmol/L。Huang等[18]建立了一种基于RCA信号放大的新型的电化学传感器用于快速灵敏地检测赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)，该研究通过引入RCA放大体系使得更多的分子信标固定在金电极板用于电化学检测，在最优的条件下，OTA的检测限为0.065 pg/mL，并且该方法能成功应用在酒样本的检测中，通过选用不同的适配子，该方法也能够检测其他的毒素，具有较好的应用前景。
3.5 病毒的检测病毒一直是人类健康的主要威胁之一，病毒的快速检测对预防和控制病毒具有重大意义。Kim等[19]将聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)与RCA结合用于超灵敏检测流感病毒，通过设计特异性的针对流感病毒的上下游引物引发PCR反应，产生大量的双链DNA，然后用外切酶对双链DNA进行剪切，从而获取ssDNA。再根据获取的ssDNA设计哑铃状探针，引发RCA反应产生大量的G-四链体序列用于荧光检测。结果表明，将这两种方法结合能明显提高检测灵敏度和特异性，其检测限达到4.9 amol/L，线性范围在450 amol/L–450 fmol/L。Huang等[31]建立一种循环链置换反应结合RCA电化学传感器用于检测B型乙肝病毒，将特异性的B型乙肝病毒DNA作为金电极板和RCA引发链的“桥梁”，在DNA聚合酶的作用下引发链延伸将B型乙肝病毒DNA置换下来从而充当下一个“桥梁”。加入锁式探针引发RCA反应产生大量的ssDNA固定在金电极板上用于负载大量的亚甲基蓝，实现电化学的检测。结果表明该方法对B型乙肝病毒的检测限达2.6 amol/L，线性范围为10–700 amol/L。
4 讨论4.1 RCA技术优势与不足随着分子生物学的快速发展，核酸恒温扩增技术已广泛应用于生物检测，例如杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)、催化型发卡结构自组装反应(Catalytic hairpin assembly，CHA)、链置换扩增技术(Strand displacement amplification，SDA)和环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等[32-35]，这些恒温扩增技术各有特点，可根据酶的使用条件分为无酶扩增和耗酶扩增。无酶扩增包括HCR和CHA等，耗酶扩增包括SDA和LAMP等。相比无酶扩增，RCA反应在设计上较前两者简单，且扩增产物ssDNA能与探针直接结合实现信号放大。相比耗酶扩增，SDA产物多样(单链和双链)，电泳检测时有拖尾现象，且SDA产物的两端必须带有核酸内切酶的识别序列。而LAMP反应对引物要求较高，易形成气溶胶造成假阳性结果，且不适合进行长链DNA的扩增。相比之下，LRCA产物为一条长的ssDNA，产物较为单一，且反应不需要过多的引物引发。
然而RCA也存在一些问题，需要不断改进：1) RCA反应发生的关键在于构建完整的单链环用于后续扩增，构建成环反应的关键在于运用DNA连接酶将ssDNA连接成环，然而DNA连接酶对反应体系要求较高，当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200 mmol/L时，可强烈抑制DNA连接酶活性。因此，预先构建一个完整的环状探针能有效预防后续反应体系对连接酶的影响。2) RCA操作繁琐，反应中需要磷酸化的DNA用于构建环，且反应过程中需要消耗价格昂贵的酶，成本较高，难以满足廉价检测的需求。3)均相反应体系中多余的锁式探针和模板DNA会产生较强的背景信号，对检测限产生影响，使用核酸外切酶能够有效去除部分背景信号，但价格昂贵。4) RCA反应需要数个小时，难以满足快速检测的需求。因此，作为一种恒温扩增技术，RCA还应在探针的设计、背景的消除、成本和时间等方面作进一步的探索研究。
4.2 RCA的改进方法经RCA扩增产生的大量ssDNA，与染色剂或探针联用可实现检测信号的放大。另外，在RCA反应体系中采用功能性的dNTPs和DNA纳米花结构，也对检测的灵敏度和检测时间大有改善。
4.2.1 运用功能化的dNTPRCA扩增产物是由多个重复序列的ssDNA组成，每段重复序列可以搭载检测探针并固定一个信号分子。为了进一步提高检测的灵敏度，运用功能化的dNTPs可以增加信号的负载量[36]。如图 3A所示，通过将Cy5标记的dCTP运用到反应体系中，经过RCA反应后，扩增产物中C碱基都带有荧光探针Cy5，大大提高了检测的灵敏度。
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| 图 3 RCA方法的改进 Fig. 3 The improvement of RCA. (A) Functionalized RCA product. (B) Functionalized DNA nanoflower. (C) Protein loaded DNA nanoflower. |
| 图选项 |
4.2.2 构建DNA纳米花RCA必须经过数小时的反应时间才能产生用于搭载信号探针的ssDNA，难以满足快速检测的需求。预先构建一个完整的RCA产物用于后续信号放大可以减少在实际检测中RCA扩增耗费的时间，如图 3B所示，通过将功能化的dNTPs运用到RCA反应体系中产生大量富含功能化的RCA产物，当产物中DNA达到一定浓度时，生成的产物与溶液中不溶的盐离子结合形成结晶，从而得到功能化的DNA纳米花[37]。所形成的纳米花上富含大量的功能性位点，能够直接用于实际检测，摆脱了反应时间的限制。同时，也可以在RCA反应过程中加入蛋白质(图 3C)，从而将蛋白质固定在DNA纳米花中用于后续的检测[38-39]。
5 结论作为一种快速且恒温的DNA扩增技术，RCA扩增得到的大量ssDNA可用于搭载一系列的信号分子实现检测信号的放大，在微生物检测、疾病预防和环境监测等领域都得到了广泛应用。相信随着技术水平的不断提高，RCA定会得到更广泛和实际的应用。
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