程雯1, 蒲桂洪1, 牛国清2, 邹祥1
1. 西南大学药学院, 重庆 400715;
2. 西南大学生物技术中心, 重庆 400715
收稿日期：2021-02-19；修回日期：2021-06-17；网络出版日期：2021-07-07
*通信作者：邹祥, Tel: +86-23-68251225;Fax: +86-23-68251048;E-mail: zhx1030@swu.edu.cn.
摘要：[目的] 分析荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063中A82846B合成的代谢途径和关键基因。[方法] 使用Illumina二代测序和PacBio三代测序技术对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063进行全基因组测序，利用Glimmer预测编码序列，使用HPLC和LCMS鉴定次级代谢产物，使用antiSMASH 5.0软件预测次级代谢产物合成基因簇。利用Geneious软件对A82846B合成相关基因进行分析，对其中的mbtH类基因着重分析。[结果] 本实验菌株鉴定为荒漠拟孢囊菌（Kibdelosporangium aridum），基因组中有一条线性染色体，无质粒，序列全长12475688 bp，GC含量为66.27%，有11900个开放阅读框，共有47个基因簇。该菌株具有合成A82846B的能力，且生物合成相关基因位于Cluster32，包含33个基因，mbtH类基因gene07864的过表达促进A82846的合成，提升了26.42%，卤化酶基因为gene07859，与万古霉素、巴利霉素的卤化酶相似度较高。[结论] 本研究对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063进行了基因组序列分析，获得了A82846B生物合成相关的功能基因信息，为A82846B的代谢途径和工程改造提供了强有力的基础。
关键词：荒漠拟孢囊菌奥利万星A82846B全基因组组装mbtH类基因卤化酶基因
Oritavancin intermediate A82846B-producing strain Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063 whole genome sequence analysis and mbtH-like gene verification
Wen Cheng1, Guihong Pu1, Guoqing Niu2, Xiang Zou1
1. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2. Biotechnology Research Center, Southwest Univerisity, Chongqing 400715, China
Received: 19 February 2021; Revised: 17 June 2021; Published online: 7 July 2021
*Corresponding author: Xiang Zou, Tel: +86-23-68251225;Fax: +86-23-68251048;E-mail: zhx1030@swu.edu.cn.
Abstract: [Objective] We analyzed the metabolic pathways and key genes of A82846B synthesis of Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063. [Methods] We used the second-generation sequencing technology Illumina and the third-generation sequencing technology PacBio to perform whole-genome sequencing of Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063. We also used Glimmer to predict the coding sequence. To identify the secondary metabolite, high performance liquid chromatography and liquid chromatograph mass spectrometer was applied. To predict the secondary metabolite synthesis gene cluster, AntiSMASH 5.0 software was applied as well. Besides, focusing on the analysis of its mbtH-like gene, geneious software was adopted in this paper to analyze A82846B synthesis-related genes. [Results] Sequence analysis showed that the strain belonged to Kibdelosporangium aridum, containing a plasmid-free linear genome chromosome with the full-length gene sequence of 12475688 bp and the GC content of 66.27%. This linear genome chromosome had 11900 open reading frames and a total of 47 gene clusters. This strain was capable to synthesize A82846B, and the biosynthesis-related genes were located in Cluster32, which contained 33 genes. Overexpression of the mbtH-like gene gene07864 promoted the synthesis of A82846 by 26.42%. The halogenase gene was gene07859, being highly similar to the halogenase of vancomycin and balimycin. [Conclusion] In this study, we carried out the genome sequence analysis of Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063, and we also obtained the information of A82846B biosynthesis-related functional genes, which provided a strong basis for the metabolic pathway and engineering modification of A82846B.
Keywords: Kibdelosporangium aridumoritavancinA82846Bwhole genome assemblymbtH-like genehalogenase gene
荒漠拟孢囊菌是一种具有工业价值的抗生素产生菌[1]，拟孢囊菌属的基因组中含有大量次级代谢产物生物合成基因簇，具有合成糖肽类抗生素等多种活性代谢产物的潜力[2–3]。目前报道有荒漠拟孢囊菌[4]和东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)[5]两者可产奥利万星(oritavancin)的中间体A82846B。与东方拟无枝酸菌相比，荒漠拟孢囊菌的相关研究甚少，特别是缺乏菌株的相关遗传信息分析。A82846 (chloroeremomycin)的合成需要5种氨基酸，其中β-羟基酪氨酸、对羟基苯甘氨酸和间二羟基苯甘氨酸为胞内合成的非蛋白质氨基酸，在非核糖体肽合成酶CepA、CepB、CepC的作用下按D-亮氨酸、β-羟基酪氨酸、L-天门冬酰胺、对羟基苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸、β-羟基酪氨酸和间二羟基苯甘氨酸的先后顺序组装成线性的七肽骨架，随后在氧化交联酶CepE、CepF、CepG的作用下发生交联反应，成环后形成更稳定的骨架结构，经3个糖基转移酶GtfA、GtfB、GtfC作用下在第4位氨基上连接一个葡萄糖基和一个万古胺基，在第6位氨基上连接一个万古胺基，合成过程中还有其他的修饰酶参与作用，最终合成具有抗菌活性的A82846[6]。A82846B与万古霉素结构相似，但糖基侧链不同，并且万古霉素的卤化酶能催化两个位点均发生卤化反应，合成途径中不会出现单氯化的中间体[7]，而A82846B的合成会产生含一个氯原子取代的A82846A和无氯原子取代的A82846C (见图 1-A中R1、R2位点)，给A82846B的分离纯化造成了的困难。
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| 图 1 A82846 (A)、奥利万星(B)和万古霉素(C)的结构示意图[8] Figure 1 The structure of A82846 (A), oritavancin (B) and vancomycin (C)[8]. |
| 图选项 |
随着万古霉素耐药菌的出现，以及最低抑菌浓度的不断升高，万古霉素正在失去其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染的临床疗效，开发新型的糖肽类抗生素十分紧要[9]。2014年FDA批准了第二代糖肽类抗生素奥利万星上市[10]，作为一种万古霉素类似物，奥利万星是FDA批准用于由敏感革兰阳性菌引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(acute bacterial skin and skin-structure infections，ABSSSIs)治疗的首个和唯一的单剂治疗方案的抗菌药物[11–13]，也被FDA快速批准为急性细菌性皮肤软组织感染(skin and soft tissue infections，SSTI)适应症的合格感染性疾病产品(qualified infectious disease product，QIDP)[14]。目前主要通过对微生物来源的A82846B进行化学修饰合成奥利万星[15]，因此，A82846B的微生物合成研究对奥利万星的产业化十分重要。
本课题组对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063的全基因组进行序列分析，对该菌株的进化关系及A82846B合成相关的mbtH基因和卤化酶有初步的了解。此次基因组研究获得了有关荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063菌株的遗传信息，对后续A82846B的代谢调控具有重要的指导意义，对A82846B的工业化生产有着极大的价值。
1 材料和方法 1.1 菌株、质粒和引物 奥利万星中间体A82846B产生菌荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063保藏于西南大学药学院发酵工程研究室，株号ZH04。其余菌株、质粒和引物见表 1。
表 1. 实验所用菌株、质粒和引物 Table 1. Strains, plasmids and primers used in the study
| Strains/plasmids/ primers | Description | Notes |
| Strains | ||
| ??K. aridum ZH04 | The original strain capable of producing A82846B | Our laboratory |
| ??ZH04-E | K. aridum ZH04 containing pSET-E, Aprr | This study |
| ??ZH04-M | K. aridum ZH04 containing pSET-M, Aprr | This study |
| E. coli | ||
| ??ET12567 (pUZ8002) | Donor strain for intergenetic conjugation between E. coli and Streptomyces, Kanr, Chlr | From Professor Niu Guoqing of Biotechnology Center of Southwest University |
| ??ETZ-E | ET12567 (pUZ8002) containing pSET-E, Kanr, Chlr, Aprr | This study |
| ??ETZ-M | ET12567 (pUZ8002) containing pSET-M, Kanr, Chlr, Aprr | This study |
| Plasmids | ||
| ??pSET152 | E. coli-Streptomyces shuttle vector, Aprr | From Professor Niu Guoqing of Biotechnology Center of Southwest University |
| ??pSET-E | pSET152 derivative vector containing ermE* promoter and fd terminator | This study |
| ??pSET-M | gene07864 inserted into NdeⅠ/EcoRⅠ sites of pSET-E | This study |
| Primers | ||
| ??M-pSET152-F | TCCACAGGAGGACCCATATGTCGGTCGAAGATTTCGATGTTG | Amplification of mbtH gene for construction of pSET-M |
| ??M-pSET152-R | CGGCCGCGGTACCGGAATTCTCAGGCCGGGTGGTGCGG | |
| ??PSET-YZ-F | GGATCTGTGCACGCGGTC | Verification of recombinant |
| ??PSET-YZ-R | GGGTCGGAACAGGAGAGCG |
表选项
1.2 培养基及基因组DNA的提取 ZH04斜面和平板培养基(g/L)：大豆蛋白胨10、可溶性淀粉20、酵母浸粉10、pH 6.80；TSA培养基(g/L)：胰蛋白胨15、大豆蛋白胨5、NaCl 5、pH 7.0±0.2；种子培养基(g/L)：葡萄糖10、麦芽糊精15、黄豆粉10、碳酸钙2、pH 7.2±0.2；发酵培养基(g/L)：葡萄糖20、麦芽糊精25、黄豆粉10、碳酸钙4、糖蜜1、pH 7.2±0.2，培养温度28 ℃；大肠杆菌使用LB培养基培养(g/L)：蛋白胨10、酵母浸粉5、NaCl 5。
提取ZH04基因组DNA：在平板上刮取ZH04菌体接种至TSA液体培养基中，220 r/min下培养48 h，用于基因组DNA的制备。使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，使用TBS-380荧光计(Turner BioSystems Inc.，Sunnyvale，CA)测定DNA浓度，采用高质量的DNA样品(OD260/280=1.8–2.0，DNA总量≥15 μg，浓度≥50 ng/μL)构建片段文库。
1.3 基因组测序、组装及基因预测 利用PacBio RS II和Illumina平台生成的数据进行生物信息学分析。所有分析均在上海美吉生物的I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)上进行。
1.3.1 基因组测序: 基因组测序使用PacBio RS II单分子实时测序(SMRT)和Illumina测序平台组合，Illumina的数据被用来评估基因组重复度，评估基因组大小、是否存在质粒及污染，同时保证更完整更精确的组装。
1.3.2 基因组组装: 最初的raw data是以fastq格式储存起来的，为了使后续的组装更加准确，对原始数据进行质量剪切，得到高质量的clean data。利用canu及HGAP软件进行PacBio数据组装，将reads组装成contigs，得到完整的染色体和质粒基因组。最后利用illumina测序数据对组装结果进行校正。
1.3.3 基因预测: 利用Glimmer对基因组中的编码序列进行预测，质粒基因采用GeneMarkS软件预测，tRNAscan-SE进行tRNA预测，Barrnap进行rRNA预测。
1.4 次级代谢合成分析及A82846B代谢途径分析 通过antiSMASH 5.0软件对样本的次级代谢产物合成基因簇进行预测，使用Geneious软件对合成A82846B的相关基因进行比对，定位A82846B合成基因的位置，使用软件DNAMAN 8和NCBI在线蛋白比对功能，对基因组中的卤化酶进行同源性分析。
1.5 mbtH类基因的过表达
1.5.1 质粒pSET-M的构建: 使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerse在ZH04的基因组DNA上扩增gene07864基因片段，将质粒pSET-E从NdeⅠ和EcoRⅠ两个限制性酶切位点处切开得到线性载体，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒将gene07864基因片段和pSET-E线性载体回收，将扩增的目的片段和双酶切后的线性化载体进行重组得到含有gene07864基因的质粒pSET-M。
1.5.2 改造菌株的构建及发酵: 将质粒pSET-E、pSET-M分别转入ET12567 (pUZ8002)感受态中，得到ETZ-E、ETZ-M，按链霉菌-大肠杆菌结合转移的操作步骤，与ZH04进行结合转移实验，筛选出正确的结合子，分别命名为ZH04-E、ZH04-M。将ZH04、ZH04-E、ZH04-M三株菌在平板培养基上培养6 d，接种至种子培养基，220 r/min下振荡培养48 h。以10%的接种量转接种子液至发酵培养基中，振荡培养6 d结束发酵，检测发酵液。
1.6 A82846的测定
1.6.1 对照品溶液的配制: 精密称取A82846B对照品适量，加入ddH2O溶解，配置成2 g/L的溶液，再逐步稀释得到1500 mg/L、1000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L、200 mg/L、20 mg/L的溶液，使用0.22 μm的滤膜过滤，方可进行高效液相色谱分析。将A82846B对照品溶液浓度(x)与出峰面积(f(x))作图，得到标准曲线f(x)=13068.4122x+ 25656.9474，R2=0.9999。
1.6.2 供试品溶液的制备: 用氢氧化钠溶液将发酵液pH调至10.5–10.7，放置1 h，12000 r/min离心10 min去除菌体，再加入稀盐酸调pH至7.2–7.5，经多次离心及0.22 μm滤膜过滤即可进行高效液相色谱分析。
1.6.3 高效液相色谱条件: 色谱柱：Agilent SB-C8 4.6 mm×150 mm，3.5 μm；柱温：40 ℃；流动相：以0.1%三氟乙酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：20 μL；洗脱程序：0→22 min，A: B=95:5→85:15；22→24 min，A: B=85:15→95:5；24→30 min，A: B=95:5→95:5。
1.6.4 液相色谱质谱联用条件: 色谱柱：Agilent SB-C8 4.6 mm×150 mm，3.5 μm；柱温：40 ℃；流动相：以0.3%甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：30 μL；洗脱程序：0→22 min，A: B=98:2→90:10；22→25 min，A: B=90:10→98:2；25→40 min，A: B=98:2→98:2。离子源：ESI；DL温度：250 ℃；雾化气体流量：2.50 L/min。
2 结果和分析 2.1 菌株的基因组组装和进化分析
2.1.1 菌株的基因组组成特征: Illumina Hiseq二代测序质控数据显示，插入序列长399 bp，原始reads读长150 bp，经过一系列的质量剪切之后得到的高质量reads，质控后的reads用来进行基因组组装。PacBio三代测序结果显示，总的Reads数量为85036，平均reads读长6212.23 bp，总碱基长528262860 bp。
完整基因组信息显示，该菌株为荒漠拟孢囊菌，其基因组中不存在质粒，有一条线性染色体，全长12475688 bp，所有碱基的平均GC含量66.27%。预测有11900个编码基因，基因总长度11324571 bp，编码基因占基因组百分比为90.77%，平均长度951.64 bp，其中有35.29%的基因长度在1000 bp以上。基因组中有68个tRNA，共23种类型。rRNA共有9个，其中16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA各3个。使用Tandem Repeats Finder软件进行串联重复序列预测，有355个重复序列，总长58370 bp，占基因组的0.47%。Circos基因组圈图见图 2。
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| 图 2 荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063基因组Circos图 Figure 2 Circos map of Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063 genome. The outermost circle of the graph is the identification of the genome size; the second circle and the third circle are the CDS on the positive and negative strands; the fourth circle is rRNA and tRNA; the fifth circle is the GC content; the innermost circle is the GC-Skew value. |
| 图选项 |
2.1.2 菌株的进化分析: 通过自动化检索，在数据库中搜索与样本亲缘关系较近的基因组，利用基因组单拷贝同源基因构建系统进化树，基于16S rRNA基因和31个看家基因(dnaG、frr、infC、nusA、pgk、pyrG、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplK、rplL、rplM、rplN、rplP、rplS、rplT、rpmA、rpoB、rpsB、rpsC、rpsE、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsM、rpsS、smpB、tsf)的样本进化分析，显示与本菌株的近源物种为Kibdelosporangium phytohabitans KLBMP1111 (图 3，4)。
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| 图 3 基于16S rRNA基因序列的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of 16S rRNA genes. The sequence number in brackets is the NCBI reference sequence number. The number on the branch point represents the reliability of the data, the larger the value, the more reliable it is. Branch length indicates evolutionary distance. The shorter the horizontal line, the higher the homology. |
| 图选项 |
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| 图 4 基于看家基因的样本进化分析图 Figure 4 Phylogenetic tree of house-keeping genes. The sequence number in brackets is the NCBI reference sequence number. The number on the branch point represents the reliability of the data, the larger the value, the more reliable it is. Branch length indicates evolutionary distance. The shorter the horizontal line, the higher the homology. |
| 图选项 |
2.2 A82846B的合成情况分析 与KEGG BRITE数据库(https://www.kegg.jp/kegg/brite.html)比对发现，万古霉素类抗生素(ko01055)合成通路在荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063中较为完整(图 5)，从图中可以看出合成A82846B的通路完整。
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| 图 5 万古霉素类抗生素生物合成通路 Figure 5 Biosynthetic pathway of vancomycin group antibiotics. The red border indicates the presence of the gene in the strain. |
| 图选项 |
如图 6所示，A82846B标准品和荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063发酵液样品中的某一物质在高效液相色谱图中同一时间出峰。ESI-MS给出A82846B标准品和发酵液样品的m/z均为1593.35 [M+H]+，表明二者分子量一致，为同一种物质，从A82846B的分子式(C73H88N10O26Cl2)计算其分子量为1592.43，因此确定荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063的发酵液样品中有A82846B存在，荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063确实具备合成A82846B的能力。
2.3 A82846B合成基因分析 利用antiSMASH 5.0软件(https://antismash.secondarymetabolites.org/)预测出全基因组中共有47个次级代谢产物合成基因簇，根据A82846B合成途径中的关键基因，如非核糖体肽合成酶基因cepA、cepB、cepC[16]，细胞色素P450单加氧酶基因cepE、cepF、cepG，以及3种糖基转移酶基因gtfB、gtfA和gtfC[17–18]等，定位到A82846B生物合成基因位于Cluster32 (129715 bp)，因此Cluster32为A82846B合成基因簇，其中还存在一些全局调控蛋白和未知蛋白的基因。
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| 图 6 A82846B标准品和荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063发酵液样品的HPLC (A)和LCMS (B)检测 Figure 6 The HPLC (A) and LCMS (B) detection of A82846B standard sample and the fermentation sample of Kibdelosporangium aridum CCTCC M2020063. |
| 图选项 |
为了了解荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063基因组中A82846B合成基因的详细信息，对相关基因进行一一比对。东方拟无枝酸菌中有30个基因明确属于Chloroeremomycin合成通路[6]，其中有1个基因其蛋白功能未知(CepD)。根据报道中连续的30个基因，确定本菌株中有连续的33个基因(8163604–8164407)属于ZH04-chloroeremomycin的合成通路，其中有6个基因无注释信息。通过基因的顺序以及Geneious软件比对蛋白序列，确定gene07869、gene07854、gene07849分别对应蛋白CepM、CepI、CepL (表 2)。此外，PD蛋白和TyrA2蛋白相同，CepD蛋白和MbtH蛋白同源性达到98.2%，说明CepD是一种MbtH类蛋白，参与非核糖体肽合成酶的反应。结果表明已报道的Chloroeremomycin合成通路中的30个基因均在Cluster32中找到了相对应的基因，该菌株具有完整的A82846B合成基因，但其中仍有gene07867、gene07870、gene07861的功能未知，这3个基因的序列较短，猜测是菌株自然进化造成的基因片段插入。
表 2. ZH04-chloroeremomycin合成基因簇中基因的蛋白序列比对 Table 2. Protein sequence alignment of ZH04-chloroeremomycin biosynthetic cluster
| Chloroeremomycin biosynthetic cluster | Accession number | Metabolic pathway | ZH04-chloroeremomycin biosynthetic cluster | Identity/% | Note |
| PD | CAA11792.1 | HPG biosynthesis | TyrA2 (7871) | 100.0 | |
| / | Unknown function | / (7870) | / | ||
| CepM | CAA11793.1 | ABC transporter | CepM (7869) | 100.0 | |
| CepA | CAA11794.1 | NRPS | CepA (7868) | 100.0 | |
| / | Unknown function | / (7867) | / | ||
| CepB | CAA11795.1 | NRPS | CepB (7866) | 100.0 | |
| CepC | CAA11796.1 | NRPS | CepC (7865) | 100.0 | |
| CepD | CAA11799.1 | NRPS | MbtH (7864) | 98.2 | MbtH-like protein |
| CepE | CAA11797.1 | Oxidative cross-linking | CepE (7863) | 100.0 | |
| CepF | CAA11798.1 | Oxidative cross-linking | CepF (7862) | 100.0 | |
| / | Unknown function | / (7861) | / | ||
| CepG | CAA11791.1 | Oxidative cross-linking | CepG (7860) | 100.0 | |
| CepH | CAA11780.1 | Halogenation | CepH (7859) | 100.0 | |
| GtfA | CAA11774.1 | Glucosyl transferase | GtfA (7858) | 99.7 | |
| GtfB | CAA11775.1 | Glucosyl transferase | GtfB (7857) | 100.0 | |
| GtfC | CAA11776.1 | Glucosyl transferase | GtfC (7856) | 100.0 | |
| EvaC | CAA11777.1 | Sugar biosynthesis | EvaC (7855) | 100.0 | |
| CepI | CAA11778.1 | Epimerization | CepI (7854) | 100.0 | |
| MtfA | CAA11779.1 | N-methylation | MtfA (7853) | 100.0 | |
| HpgT | CAA11790.1 | HPG biosynthesis | HpgT (7852) | 100.0 | |
| CepJ | CAA11784.1 | β-OH-tyrosine biosynthesis | CepJ (7851) | 100.0 | |
| CepK | CAA11773.1 | β-OH-tyrosine biosynthesis | CepK (7850) | 100.0 | |
| CepL | CAA11772.1 | β-OH-tyrosine biosynthesis | CepL (7849) | 100.0 | |
| Hmas | CAA11761.1 | HPG biosynthesis | Hmas (7848) | 100.0 | |
| Hmo | CAA11762.1 | HPG biosynthesis | Hmo (7847) | 100.0 | |
| EvaA | CAA11763.1 | Sugar biosynthesis | EvaA (7846) | 100.0 | |
| EvaE | CAA11764.1 | Sugar biosynthesis | EvaE (7845) | 100.0 | |
| EvaB | CAA11782.1 | Sugar biosynthesis | EvaB (7844) | 100.0 | |
| EvaD | CAA11781.1 | Sugar biosynthesis | EvaD (7843) | 100.0 | |
| DpgA | CAA11765.1 | DHPG biosynthesis | DpgA (7842) | 100.0 | |
| DpgB | CAA11766.1 | DHPG biosynthesis | DpgB (7841) | 100.0 | |
| DpgC | CAA11787.1 | DHPG biosynthesis | DpgC (7840) | 100.0 | |
| DpgD | CAA11767.1 | DHPG biosynthesis | DpgD (7839) | 100.0 |
表选项
下载已知的卤化酶蛋白序列[19]，与Cluster32中卤化酶基因gene07859的蛋白序列比对，使用MEGA 6进行绘图分析(图 7)。比对结果表明荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063的卤化酶与卤化酶CepH[5] (CAA11780)完全一致，同源性为100%，与巴利霉素卤化酶BhaA[20] (CAA76550)和万古霉素卤化酶Vhal[21] (AEI58871)高度相似，同源性分别为95.5%和93.7%。
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| 图 7 黄素依赖型卤化酶的系统进化树分析 Figure 7 Phylogenetic analysis of flavin-dependent halogenase. The sequence number in brackets is the NCBI reference sequence number. The number on the branch point represents the reliability of the data, the larger the value, the more reliable it is. Branch length indicates evolutionary distance. The shorter the horizontal line, the higher the homology. |
| 图选项 |
2.4 mbtH类基因分析 MbtH类蛋白是一种小蛋白(约10 kDa)，主要与一些细菌非核糖体肽合成酶(NRPS)的腺苷化结构域非共价结合，促进NRPS酶的折叠、稳定性和活性[22–23]。MbtH类蛋白对于腺苷化步骤是非常必要的，在东方拟无枝酸菌中，mbtH类基因(vcm11)的缺失突变株完全丧失了产生万古霉素的能力，回补后产量几乎完全恢复到野生型菌株的水平，过表达mbtH类基因(同源基因vcm11或非同源基因cloY)均能提高万古霉素的产量[24]，因此mbtH类基因是一个提高非核糖体肽产量的基因工程靶点。
ZH04-chloroeremomycin合成通路中gene07864为mbtH类基因。为了验证mbtH类基因对A82846B的生物合成的相关性，对gene07864进行过表达，发酵结果见图 8。过表达mbtH类基因(gene07864)对A82846A和A82846C具有明显的增产效果，分别提升了21.66% (1020.55±67.28 mg/L)和94.70% (446.95±30.09 mg/L)，而A82846B的产量降低了20.37% (198.92±28.02 mg/L)，整体而言促进了A82846的生产，总产量提升了26.42%。由于mbtH类基因是在非核糖体肽生物合成步骤中发挥作用的，影响七肽骨架的合成，过表达mbtH类基因(gene07864)能够促进A82846总生产的提高，但其中A82846B产量降低的原因尚不能明确，从该现象可以推测A82846生物合成过程中前期的通量发生变化，会对卤化酶的催化反应有所影响，造成A、B、C三个组分的比例发生波动。
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| 图 8 在ZH04菌株中过表达mbtH类基因 Figure 8 Overexpression of mbtH-like gene in ZH04. A, B: HPLC analysis of A82846 components production (Error bars represent means±standard deviation. Significant differences analysis was carried out, ****: P < 0.0001, ***: P < 0.001, **: P < 0.01); C: comparison of A82846 yield. |
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3 讨论 A82846B作为奥利万星合成的关键中间体，目前微生物发酵是唯一合成途径。若想要借助基因工程的方法来提升产量，改善杂质的产生，深入了解A82846B的产生菌及其生物合成信息是十分必要的。经全基因组测序，鉴定本实验室所藏菌种为荒漠拟孢囊菌，具有丰富的次级代谢产物合成潜力，可以合成天然糖肽类抗生素A82846B，并且该生物合成基因簇位于基因组的Cluster32中。经过比对，了解到在荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063中，参与合成A82846B的基因与东方拟无枝酸菌中公布的基因有少许差异，但不影响产物的合成，可能是菌属的差异或适应环境带来的改变。根据全基因组分析的结果，对A82846B生物合成基因簇中的mbtH类基因gene07864进行过表达，结果表明其对A82846总产量有明显的提升作用。由于MbtH类蛋白参与七肽骨架的组装，然而3个组分在过表达该基因后产量并非一同提升，该结果可能是因为3个组分的合成能力与卤化反应的酶息息相关，并且该反应存在一定瓶颈，即便前期合成步骤的通量增加，也依旧受卤化反应限制。
已知过表达卤化酶基因能够提高A82846B的产量，并且杂质组分的比例大幅度降低[5]，说明现有的菌株中卤化反应的催化能力较低，是造成未氯化或单氯化的杂质(A82846C、A82846A)含量较高的主要原因，A82846B和A82846A、A82846C之间的比例与卤化酶的表达量密切相关，但仅是增加卤化酶基因的拷贝数并不能彻底消除杂质。目前卤化酶的反应机制尚不明确，造成组分结构差异的决定因素是什么，这些需要继续深入研究。要想根除杂质的生成，我们可以从参与卤化反应的多个酶或者从A82846B生物合成的整个级联反应过程去思考问题。目前看来单独对卤化酶基因进行研究是不够的，还需充分了解A82846的合成机制，这对A82846B的工业化生产有重要作用。
全文主要对荒漠拟孢囊菌CCTCC M2020063基因组进行了组装和分析，重点关注了A82846B生物合成相关基因，初步分析了gene07859为A82846B生物合成基因簇中的卤化酶基因。在原始菌株中过表达了可以促进七肽骨架合成的mbtH类基因，A82846的产量得到了提升，表明mbtH类基因可以作为一个较好的基因工程靶点。由于A82846B产生菌的相关研究较少，荒漠拟孢囊菌是一种稀有放线菌，其基因组信息极为缺乏。通过本文的研究，有助于理解荒漠拟孢囊菌相关的生物学信息，为进一步促进A82846B的次级代谢合成奠定基础。
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