孙丽1, 王丹丹1, 殷志秋1, 油勇强2, 刘润进3, 解志红1
1. 山东农业大学资源与环境学院, 山东 泰安 271000;
2. 中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003;
3. 青岛农业大学植物医学学院, 山东 青岛 266000
收稿日期：2021-03-12；修回日期：2021-04-30；网络出版日期：2021-09-29
基金项目：国家自然科学基金(31870020)；NSFC-山东省联合基金重点支持项目(U1806206)
*通信作者：解志红, E-mail: zhihongxie211@163.com.
摘要：[目的] MotA是细菌的鞭毛马达蛋白，是跨膜质子通道的重要组成结构之一，在调控鞭毛运动中具有至关重要的作用。本研究探究了Azorhizobium caulinodans ORS571中鞭毛马达基因motA对菌株表型和植物互作的影响。[方法] 通过同源重组原理和三亲接合转移方法构建突变菌株?motA，测定野生型与突变体在菌体生长、运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力的差异。[结果] 与野生型相比，突变体菌体生长没有明显差异，但其运动能力完全丧失，固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力减弱。[结论] MotA鞭毛马达蛋白对A.caulinodans ORS571的运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成及根系定殖能力均有调控作用。
关键词：茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛马达蛋白motA
Functional analysis of motA gene in Azorhizobium caulinodans ORS571
Li Sun1, Dandan Wang1, Zhiqiu Yin1, Yongqiang You2, Runjin Liu3, Zhihong Xie1
1. College of Resourses and Environment, Shandong Agricultural University, Tai'an 271000, Shandong Province, China;
2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, Shandong Province, China;
3. College of Plant Health&Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Received: 12 March 2021; Revised: 30 April 2021; Published online: 29 September 2021
*Corresponding author: Zhihong Xie, E-mail: zhihongxie211@163.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31870020) and by the NSFC-Shandong Joint Fund Key Projects (U1806206)
Abstract: [Objective] MotA, an important flagellar motor protein regulating flagellar motility, is one of components of transmembrane proton channel. In this study, we explored the role of motA in Azorhizobium caulinodans ORS571 in the free-living and symbiotic states. [Methods] ?motA mutant was constructed by homologous recombination and tri-parental conjugation. We tested the characterizations of the growth state, swimming motility, nitrogen fixation, exopolysaccharides (EPS) production, biofilm formation, and host colonization between wild-type and ?motA mutant. [Results] ?motA mutant showed defective cell motility ability but the growth property was not impaired, and its nitrogen fixation, EPS production, biofilm formation, and host colonization were lower than that of the wild-type. [Conclusion] In A. caulinodans ORS571, MotA plays role in motility, nitrogen fixation, EPS production, biofilm formation, and root colonization.
Keywords: Azorhizobium caulinodans ORS571flagellar motor proteinmotA
茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)为运动型的革兰氏阴性菌，分离自热带豆科植物毛萼田菁(Sesbania rostrata)的茎瘤中[1]。相较于其他根瘤菌，ORS571具有独特的生理功能：其一，ORS571可以与宿主植物在根部和茎部共生结瘤；其二，ORS571既可以和宿主植物共生固氮，也可以自生固氮，为宿主增加获取氮源的途径，因此，A. caulinodans ORS571成为根瘤菌植物促生方向的研究热点。ORS571需要依赖鞭毛的定向运动到达宿主植物的根部，即鞭毛的趋化运动是根瘤菌定殖结瘤的前提[2-3]。鞭毛是细菌长期进化过程中适应环境的结果，在定向运动、细菌底物吸附、生物膜形成、定殖过程中均具有十分重要的作用[3-5]，由此可见，鞭毛对细菌的生存和发展至关重要。
鞭毛是由嵌在细胞壁与细胞膜中的基体、近端的钩状体和远端的丝状体构成的超大分子运动器官。基体作为双向旋转马达产生跨越细胞质膜的驱动力，接着由钩状体和丝状体分别控制运动的方向和推进[6]。鞭毛的调控机制复杂有序，感觉信号传导器感知外界刺激(如化学物质、温度或者pH变化)，通过胞内趋化信号网络将这些胞外信号传递给马达，使鞭毛马达产生逆时针和顺时针旋转的交替变化[5]，马达的运转由一个转子和多个定子单元高度配合完成，跨膜蛋白MotA和MotB形成的MotA/B定子复合物起到跨膜质子通道的作用，向转子传递质子和动力[7]。MotA作为质子通道的组分之一，在鞭毛运动调控中具有至关重要的作用。MotA蛋白是大肠杆菌鞭毛马达中的质子传递蛋白[8]；并在沙门氏菌中参与扭矩的产生和定子装配，MotA-Arg90-FliG-Asp289相互作用使定子在转子周围正确定位，MotA- Glu98-FliG-Arg281负责控制扭矩的产生[9-10]。motA基因是空肠弯曲菌鞭毛动力和致病性相关趋化和定殖的必需基因[11]。在ORS571菌株基因组中，存在MotA鞭毛蛋白编码基因，但MotA在ORS571中的生物学功能至今未见研究报道。
本研究从ORS571菌株基因组中克隆motA基因，利用同源重组原理和三亲接合转移的方法成功构建了motA基因缺失突变株(?motA)，通过与野生型生理特性比较，分析motA基因缺失对ORS571菌体生长、运动、固氮、胞外多糖合成、生物膜形成以及定殖能力的影响。本研究丰富了对MotA的认识，明确了其作为鞭毛马达蛋白重要的组成成分在ORS571中的具体作用，为今后ORS571趋化信号转导机制分子水平的进一步研究提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 实验材料
1.1.1 实验所用试剂及试剂盒: 限制性内切酶和T4连接酶购自NEB公司，基因组DNA抽提试剂盒购自北京诺贝莱生物科技有限公司，质粒小提试剂盒购自天根生物科技有限公司，切胶回收试剂盒购自全式金生物技术有限公司。引物合成由华大基因完成，测序由北京奥克鼎盛生物科技有限公司完成。
1.1.2 实验所用菌株和质粒: 详见表 1。
表 1. 实验所用菌株和质粒 Table 1. Bacteria strains and plasmids used in this study
| Strains and plasmids | Relevant characteristics | Source and reference |
| Strains | ||
| ??Escherichia coli DH5α | General cloning strain | Transgen |
| ??A. caulinodans ORS571 | Wild-type strain, AmpR and NaIR | [1] |
| ???motA | ORS571 derivative, AmpR, GenR | This study |
| Plasmids | ||
| ??pEASY Blunt Cloning Vector | The vector cloning PCR products, KanR | Transgen |
| ??pCM351 | The construction of mutant, GenR | [12] |
| ??pRK2013 | Helper plasmid, KanR | [13] |
| AmpR, NaIR, GenR and KanR indicate ampicillin, nalidixic acid, gentamycin and kanamycin resistance, respectively. | ||
表选项
1.1.3 引物: 详见表 2。
表 2. 实验涉及引物 Table 2. PCR primers used in this study
| Primers | Sequences (5′→3′) | Restriction site |
| motA-up-F | GGTACCTCGCGGGTGTAGGCGACG | Kpn I |
| motA-up-R | CATATGGCCCATGGCCATGAAGCC | Nde I |
| motA-down-F | ACCGGTAAGACCATTGCGGAAGGC | Age I |
| motA-down-R | GAGCTCACCGCGAAGTCCATGCGGGT | Sac I |
表选项
1.1.4 菌株所用培养基及培养条件: 茎瘤固氮根瘤菌ORS571接种于含Amp和NaI抗生素的TY或L3培养基，37 ℃培养；大肠杆菌DH5α接种于LB培养基，37 ℃培养[14]。
1.2 基因片段motA的克隆和重组载体的构建 ORS571菌株培养在含Amp (100 μg/mL)和NaI (25 μg/mL)的液体TY培养基中振荡过夜培养。收集菌液(OD600=0.6)，10000 r/min离心1 min，收集菌体，通过DNA提取试剂盒提取细菌的基因组，并检测其浓度和纯度。4 ℃备用。
以ORS571基因组DNA为模板，以motA-up-F/R为引物扩增上游片段motA-up，同样以motA-down-F/R为下游引物扩增motA-down片段。将motA-up和motA-down片段分别与克隆载体pEASY-Blunt Simple连接，并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑和PCR确定转化成功的阳性克隆子。将连有上游片段的pEASY克隆载体与pCM351进行酶切与酶连反应，得到pCM351:: motA-up重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞，PCR和质粒酶切确定转化成功的阳性克隆子。以同样的方法，将连有下游片段的pEASY克隆载体与pCM351:: motA-up质粒进行酶切与酶连反应，得到构建成功的pCM351:: motAup-down重组质粒。
1.3 突变株?motA的构建 通过三亲接合转移的方法构建茎瘤固氮根瘤菌?motA突变株。按照10:3:2的比例混合野生型菌株、含pCM351:: motAup-down重组质粒的大肠杆菌DH5α和含辅助质粒pRK2013的大肠杆菌DH5α，涂布于含Amp、NaI和Gen抗生素的TY平板上，37 ℃恒温静置培养。根据同源重组原理，野生型菌株基因组中的motA基因会与pCM351:: motAup-down重组质粒中的庆大霉素抗性基因发生互换。通过抗生素抗性筛选可能的突变株并通过PCR确定构建成功的?motA突变株。
1.4 生长曲线测定 将野生型和突变菌株分别在含抗生素的液体TY培养基中振荡过夜培养(37 ℃、180 r/min)。分别取1%菌液转接至新的TY培养基培养至指数生长期(OD600=0.6)，吸取适量菌液转接至50 mL TY培养基中，使培养液的初始OD600为0.02，37 ℃、180 r/min振荡培养，每隔2 h取样通过酶标仪测定野生菌和突变菌的OD600吸光值。
1.5 趋化能力测定 离心(5000 r/min)收集过夜培养的野生株和突变株菌体，用不含抗生素的无菌L3培养基清洗并将ORS571和?motA的OD600分别调为1.0。各取5 μL细菌悬浮液分别滴在以乳酸钠为碳源的含氮(10 mmol/L NH4Cl) L3 (L3+N)半固体(0.3%琼脂)培养基上，37 ℃静置培养，观察菌株形成的运动圈的大小。
1.6 固氮能力测定 利用乙炔还原法测定菌株的固氮酶活。方法如下：将野生型和突变株过夜培养并将OD600调至0.8，备用。将3 mL L3半固体培养基加入到5 mL无菌的青霉素小瓶中，培养基凝固后接种10 μL菌液，放入37 ℃培养箱培养8 h。在无菌条件下将体积分数10%的空气抽出并注入10%体积(200 μL)的乙炔气体，用封口膜密封；37 ℃培养24 h。用微量进样器抽取100 μL气体，利用气相色谱测定乙烯含量，并计算固氮酶活性[15]。
1.7 胞外多糖的观察与定量测定 离心(5000 r/min)收集过夜培养的野生株和突变株菌体，用不含抗生素的无菌L3培养基清洗并将培养液的OD600调为1.0。各取20 μL细菌悬浮液滴在含40 μg/mL刚果红和不含刚果红的L3+N固体(0.8%琼脂)培养基(以乳酸钠为碳源)上，37 ℃静置培养72 h。刚果红染色平板用于观察菌株产胞外多糖的情况并拍照；不含刚果红平板利用蒽酮-浓硫酸氧化法进行胞外多糖的定量分析[3]。以D-葡萄糖标准液来绘制标准曲线，胞外多糖的产量以每OD600细菌生成多糖的浓度计算。
1.8 生物膜的测定 生物膜的测定参照结晶紫染色法[16]。收集过夜培养的野生菌和突变菌，利用无菌L3液体培养基清洗3次并调整OD600为1.0。取300 μL细菌悬浮液接种于2 mL以乳酸钠为碳源的L3+N培养基中，37 ℃静置培养5 d后，弃细菌培养液，并用无菌水清洗试管3-5次。向清洗后的试管中加入3 mL 0.1%的结晶紫溶液染色20 min，移除染色液，无菌水清洗试管3-5次，观察野生菌和突变菌的生物膜形成情况并拍照。为了定量测定生物膜的形成情况，将同样染色处理的试管清洗并烘干，加入1 mL 30%乙醇溶解与生物膜结合的结晶紫，利用酶标仪检测在590 nm波长下的吸光值。
1.9 菌株根系黏附效果测定 毛萼田菁种子在浓硫酸中浸泡30 min催芽，无菌水洗涤3次后在无菌培养皿中37 ℃浸泡发芽72 h，每12 h换水1次去除种子分泌物。将过夜培养的野生型ORS571细菌培养液和突变株细菌培养液转接至新的TY培养基，37 ℃、180 r/min培养至对数期，清洗并重悬菌液至OD600=0.8，将野生株和突变株菌液分别浸泡田菁根芽1 h，用无菌水充分清洗根芽7次去除未黏附的细菌。无菌条件下捣碎根芽并添加1 mL无菌水混合，将混合液稀释103倍后吸取50 μL涂布在含Amp和NaI抗生素的TY培养基(培养野生株)或者含Amp和Gen抗生素的TY培养基(培养突变株)。将平板放置在37 ℃恒温培养箱静置培养2 d后计数各个平板上生长的菌落数。
1.10 数据分析 每个实验至少重复3次。实验数据利用SPSS中的t检验进行数据分析，P < 0.05表示差异明显。
2 结果和分析 2.1 鞭毛马达蛋白motA基因分析 由图 1可知，鞭毛马达蛋白motA基因位于ORS571基因组中(714856…715746=891 bp)，该基因中含有一个预测的MotA质流通道结构域MotA/TolQ/ExbB proton channel (IPR002898)，负责向转子传递质子和动力。motA基因位于鞭毛基因簇的中部(图 1-A)，左侧为鞭毛运动基因，FliG、FliM和FliN构成作为转子并控制马达旋转方向的C环，MotA、MotB、FliG、FliM和FliN共同负责细菌鞭毛运动的旋转。右侧为鞭毛合成基因，可溶蛋白FliI参与构成鞭毛第三分泌系统；FlgK与FlgL组成连接钩子与鞭毛丝的钩子相关蛋白；FlaE是受σ28控制的极性鞭毛蛋白。
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| 图 1 鞭毛马达蛋白motA基因在ORS571染色体上的排布(A)及其结构域(B) Figure 1 Physical map (A) of motA gene and the domain (B) of the MotA protein. The arrows indicate the direction of transcription. |
| 图选项 |
2.2 突变株?motA的构建 根据同源重组原理(图 2-A)，野生株ORS571基因组的motA基因与pCM351重组质粒的庆大霉素抗性基因发生替换，筛选到能够在含Amp和Gen抗生素的TY培养基中生长的接合子。利用motA-up-F和motA-down-R引物对野生型和接合子进行PCR扩增验证，结果表明(图 2-B)，野生型中扩增出的片段与接合子扩增出的片段大小明显不同，将接合子扩增片段测序，结果显示接合子中motA基因片段被庆大霉素抗性基因代替，结果表明成功构建了突变株?motA。
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| 图 2 突变株?motA敲除原理(A)与PCR验证(B) Figure 2 The strategy for motA knockout (A) and PCR confirmation (B) of the mutant ?motA. M: marker; ?motA: the genomic DNA of ?motA mutant strain; WT: the genomic DNA of wild-type strain. |
| 图选项 |
2.3 motA对菌株生长的影响 为了观察motA基因敲除之后对菌株的生长是否产生影响，将野生型和突变株接种在TY培养基中，37 ℃振荡培养，测定40 h内细菌的OD600值并绘制成图。如图 3所示，突变体与野生型在2 h后进入指数增长期，20 h后进入稳定期，两者生长曲线无明显差异，结果表明motA的缺失不影响菌株的生长。
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| 图 3 野生型(WT)和突变株?motA的生长曲线 Figure 3 The growth curves of wild-type (WT) and ?motA mutant. |
| 图选项 |
2.4 motA对运动能力的影响 MotA属于鞭毛蛋白，在鞭毛运动调控中具有至关重要的作用，缺失motA基因的空肠弯曲菌在半固体平板上的迁移能力明显下降[11]。为了探究?motA突变株的运动能力，对野生型和突变株进行了运动能力测定，并以丧失趋化能力的?fliM突变株作为阴性对照。由图 4可知，?motA突变株在L3+N半固体平板(以乳酸钠为碳源)上无法形成运动圈。说明motA的缺失使得ORS571的运动能力丧失，motA基因在菌株的运动方面起着关键性的作用。
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| 图 4 野生型(WT)和突变株?motA的运动能力 Figure 4 The motility abilities of wild-type (WT) and ?motA mutant to sodium lactate. ?fliM[17]: fliM deletion mutant without motility ability, indicates negative control. |
| 图选项 |
2.5 motA对菌体固氮能力的影响 茎瘤固氮根瘤菌ORS571具有共生固氮和自生固氮的双重功能，利用乙炔还原法测定菌株的固氮酶活，用气相色谱测定乙烯转化为乙炔的转化率表示固氮能力。由图 5可知，野生型固氮酶活性是0.450 nmol/h，突变体的固氮酶活性为0.035 nmol/h，仅为野生型的7.8%，突变体几乎失去固氮能力，结果表明motA在茎瘤固氮根瘤菌的固氮体系中起着关键性作用。
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| 图 5 野生型(WT)和突变株?motA的固氮酶活性 Figure 5 The nitrogenase activity of wild-type (WT) and ?motA mutant.*: statistically significant difference P < 0.05. |
| 图选项 |
2.6 motA对胞外多糖合成的影响 胞外多糖(EPS)在细菌的定殖、宿主识别、宿主侵染过程中具有非常重要的作用，同时还可以作为结构成分或信号分子保护根瘤菌免受植物分泌物的侵害[18-20]。为了探究motA对ORS571分泌EPS的影响，定量测定了野生型和突变株EPS的产生能力。如图 6所示，野生ORS571合成胞外多糖0.075 mg/OD600，菌落表面湿润，?motA突变株胞外多糖的合成量相比于野生型ORS57减少26.7%，结果表明motA缺失会明显减少菌体胞外多糖的合成。
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| 图 6 野生型(WT)和突变株?motA产胞外多糖的表型(A)和定量(B)测定 Figure 6 The colony morphology of wild-type (WT) and ?motA mutant grown on L3 plates containing Congoo red (A) and quantitative analysis of EPS produced by wild-type (WT) and ?motA mutant (B). *: statistically significant difference P < 0.05. |
| 图选项 |
2.7 motA对生物膜形成的影响 生物膜是指细菌依附于生命体或非生命体表面形成的被细菌胞外聚合物包裹的群落，包含多糖、蛋白质、核酸和脂质。生物膜的形成有利于细菌在恶劣的环境中生存或与宿主建立共生关系[21]。为了探究突变株?motA生物膜的形成能力是否受到影响，通过结晶紫染色法观察突变株和野生型的生物膜形成情况。结晶紫染色后观察发现(图 7)，野生型比突变株形成的生物膜颜色更深，边际线也更粗；相比于野生型，?motA突变株形成生物膜的量减少34.2%。结果说明motA的缺失抑制了生物膜的形成，motA在茎瘤固氮根瘤菌的生物膜形成中起着重要的作用。
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| 图 7 野生型(WT)和突变株?motA产生物膜的表型(A)与定量(B)测定 Figure 7 The biofilm morphology (A) and quantification (B) of crystal violet staining between wild-type (WT) and ?motA mutant. *: statistically significant difference P < 0.05. |
| 图选项 |
2.8 motA对菌体在植物根系定殖的影响 ORS571分离自毛萼田菁的茎瘤中，能跟多种田菁属植物建立共生关系[22]。为了探究motA的缺失对ORS571在宿主植物根部的黏附能力是否有影响，本研究通过黏附筛选实验来计算吸附的突变体菌和野生型菌的比例。结果如图 8，在稀释103倍的平板中分别分离到野生型菌落148个，?motA突变株菌落101个，黏附比例约为1.5。这一结果说明motA的缺失会削弱ORS571菌株对宿主植物根系的黏附能力。
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| 图 8 野生型(WT)和突变株?motA根系定殖能力分析 Figure 8 The analysis of colonization ratio on roots between wild-type (WT) and ?motA mutant. CFUs indicates colony-forming units, *: statistically significant difference P < 0.05. |
| 图选项 |
3 讨论 在细菌的生存和发展过程中，鞭毛扮演者重要的角色。与其他结构一样，鞭毛的形成与表达同样由基因控制，其中，由motA、motB、fliG、fliM、fliN编码的蛋白负责鞭毛马达的驱动，在鞭毛的运动中起关键作用。通过对ORS571基因组中motA基因进行生物学信息分析发现，motA位于鞭毛基因簇中，其编码的蛋白包含MotA质子流通道结构域(MotA/TolQ/ExbB proton channel)。已有研究表明，MotA可以与MotB构成跨膜质子通道；可以与FliG发生静电作用，使转子产生转矩[23-24]；也可以与MotI (motility inhibitor)相互作用抑制鞭毛旋转[25]。本研究通过同源重组原理和三亲接合转移方式成功构建motA缺失突变株?motA，在不影响生长的前提下，?motA缺失突变株的运动能力完全丧失。由此可见鞭毛马达基因motA对ORS571菌株的运动至关重要。这一现象在空肠弯曲菌的motA缺失突变株迁移实验中同样得到证实[11]。
与野生型菌株相比，?motA突变株的固氮、EPS合成、生物膜形成以及根系定殖能力分别下降92.2%、26.7%、34.2%、31.8%。A. caulinodans属需氧微生物，在微好氧的情况下固氮[1]。motA的缺失使ORS571丧失运动能力，我们猜测细菌可能由于无法运动到与空气接触的最适位置而难以维持原有的固氮水平。另一方面，固氮酶催化的生物固氮是一个耗能过程，需要消耗大量ATP。鞭毛Ⅲ型分泌系统中，FliI、FliH和FliJ构成胞质ATP酶复合物，负责水解ATP，释放能量[26-27]；且研究发现MotA参与调控fliI和fliH基因的表达[28]，因此猜测本实验?motA突变株固氮能力减弱还可能是因为motA缺失影响了下游基因fliI和fliH的表达，进而影响了ATP的水解以及能量的产生，具体的调控机制还有待进一步验证。已有研究证明EPS会对细菌的运动产生影响，EPS合成受损的枯草芽孢杆菌其运动能力明显减弱[29]；Liu也发现产EPS少的突变株其泳动能力减弱[30]。旋转的鞭毛驱动细菌的运动，同时消耗大量能量产生粘液层作为表面活性剂或湿润剂降低细菌之间的张力来促进运动[31-33]。推测由于运动能力的丧失，细菌不再需要产生过多的EPS来配合细菌运动。趋化能力受损的cheA缺失突变株和运动能力完全丧失的fliM缺失突变株合成EPS的能力减弱，进一步证实了细菌运动与EPS合成可能存在相互影响[3]。细菌产生生物膜(多糖、蛋白质、核酸和脂质)来抵御外界不良环境的胁迫或者促进定殖[34-35]。EPS作为生物膜的关键成分[36]，同样对细菌在宿主植物表面的定殖和结瘤至关重要[18, 37]。由此推测，motA缺失后，ORS571的生物膜形成能力和定殖能力减弱可能与突变株EPS分泌减少有关。
本文研究了茎瘤固氮根瘤菌鞭毛马达蛋白MotA对细菌生理特性的影响。研究表明，motA缺失突变株在不影响细菌正常生长的前提下，使得细菌趋化能力完全丧失，固氮、EPS分泌和生物膜形成能力减弱，进而导致细菌与植物共生能力即根系定殖能力减弱。定殖是结瘤的前提，ORS571的motA缺失突变株定殖能力减弱，固氮能力几乎完全丧失，因此有可能导致细菌在植物表面结瘤能力减弱，后续还需要进一步验证MotA蛋白对细菌结瘤作用的影响；并从分子水平上探究motA基因缺失时固氮酶活性明显下降的原因。总之，ORS571中motA基因的发现为探究鞭毛马达调控作用增加了新的内容，同时为探究根瘤菌共生固氮机理提供了新的方向。
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