穆晓清
, 杨琳琰, 徐岩 江南大学酿酒科学与酶技术中心, 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2021-10-13；修回日期：2021-10-30；网络出版日期：2021-11-03
基金项目：国家重点研发项目(2021YFC2100100)；国家自然科学基金(21336009，21176103)；高等学校学科创新引智计划(111-2-06)
*通信作者：穆晓清, Tel: +86-510-85918201;E-mail: xqmu@jiangnan.edu.cn.
摘要：[目的] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)是生物体内一种重要的辅因子，其细胞内含量对于NAD+依赖型氧化还原反应和有关生化合成代谢具有重要意义。为强化辅因子合成，本文通过不同诱导条件下关键酶基因转录水平与产物合成水平的相关性分析，利用增加正向关键酶基因拷贝数策略提高胞内氧化型辅酶NAD+的浓度。[方法] 以实验室前期构建的大肠杆菌NA016为出发菌株，分别从诱导温度、诱导剂浓度、诱导时机三个方面进行了诱导条件的优化，并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对代谢改造中的有关过表达基因进行了转录水平分析，确定了NAD+含量与这些过表达基因转录水平之间的相关性，增加对NAD+合成代谢具有正向作用的基因拷贝数以进一步提高胞内NAD+水平。[结果] 通过诱导条件优化实验确定菌株NA016的最适诱导温度，在诱导时机为OD600达到0.6时加入0.8 mmol/L的IPTG可使胞内NAD+含量提高35.37%；转录水平方面分析发现基因nadE和pncB的表达对NAD+的合成具有正向调节作用。进一步增加菌株NA016中关键酶基因nadE和pncB的拷贝数可使辅酶含量再次提高22.46%，最高可达41.66μmol/g DCW。[结论] 优化诱导条件和增加关键酶基因拷贝数可以提高氧化型辅酶NAD+的含量，这为促进大肠杆菌胞内NAD+合成的研究提供借鉴意义。
关键词：大肠杆菌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸诱导优化转录水平相关性
Effects of transcription levels of key enzyme genes on NAD+ production in recombinant Escherichia coli
Xiaoqing Mu
, Linyan Yang, Yan Xu Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Center for Brewing Science and Enzyme Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received: 13 October 2021; Revised: 30 October 2021; Published online: 3 November 2021
*Corresponding author: Xiaoqing Mu, Tel: +86-510-85918201;E-mail: xqmu@jiangnan.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Key Research and Development Program of China (2021YFC2100100), by the National Natural Science Foundation of China (21336009, 21176103) and by the Overseas Expertise Introduction Project for Discipline Innovation, China (112-2-06)
Abstract: [Objective] Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is an important cofactor in organisms, and its intracellular concentration plays an important role in NAD+-dependent redox reaction and related biochemical synthesis. In order to strengthen the synthesis of cofactors, we optimized the induction conditions and increased the copies of key enzyme genes to elevate the intracellular NAD+ concentration. [Methods] First, the induction temperature, inducer concentration, and induction time were optimized for the starting strain NA016 of Escherichia coli. Meanwhile, the transcriptional levels of overexpressed genes in metabolic modification were determined by real-time fluorescence quantitative PCR. Subsequently, the correlations between NAD+ content and the transcription levels of these overexpressed genes were explored. Finally, the copies of the genes positively regulating NAD+ production were up-regulated to improve the intracellular NAD+ concentration. [Results] At the optimized induction conditions, the NAD+ concentration in NA016 increased by 35.37%. The genes nadE and pncB positively regulated the production of NAD+, and up-regulating the copies of these two genes in NA016 increased the NAD+ concentration by 22.46% to 41.66 μmol/g DCW. [Conclusion] Optimizing the induction conditions and up-regulating the copy number of key enzyme genes can increase the NAD+ concentration. These research findings provide reference for the study of NAD+synthesis.
Keywords: Escherichia coliNAD+optimization of induction conditionstranscription levelcorrelation
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)是细胞内一种重要的辅酶，存在于所有生物体中[1-2]。其氧化型NAD+作为主要的氢受体在生物体内参与了众多的生理代谢过程，包括糖酵解、三羧酸循环、呼吸链等代谢途径，为胞内的氧化还原反应、能量代谢、基因表达调控等提供了能量和氧化还原力[3]。研究表明，胞内NAD+含量的变化会影响整个代谢网络以及细胞生长特性，这对提高生物催化效率、增加代谢通量、获得目标代谢产物具有重要意义[4]。
为定向改变微生物细胞内辅酶浓度，前期已有研究利用DNA重组技术加强、削弱或者构建新的与NAD+代谢相关途径(图 1)从而实现胞内NAD+含量的调控[5]。例如，Heuser等[6]通过表达Preiss-Handler辅酶合成途径中编码烟酸磷酸核糖转移酶基因pncB和NAD+合成酶基因nadE，实现了大肠杆菌细胞内NAD+含量的大幅提高。Han等[7]删除了NADH焦磷酸酶(由nudC和nudE基因编码)以削弱NAD+的分解代谢途径。周雍进等[8]敲除了由ushA编码降解NAD+的周质酶基因以维持其稳定性。基于对大肠杆菌辅酶代谢途径的认识，我们实验室在前期的研究中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因组上实现了Preiss-Handler途径关键合成酶基因nadE和pncB的过表达以及辅酶分解代谢相关基因的敲除。同时结合磷酸戊糖途径和腺嘌呤补救途径继续过表达强化了3个内源性基因(zwf、gnd、prs)并引入外源基因ado1来增加NAD+合成共底物PRPP的供给以及提供ATP驱动力[9-10]。这四种策略的结合改造最终获得一株超级菌株NA016，研究结果显示其与初始菌株E. coli BL21(DE3)相比NAD+含量提高734%[11]。
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| 图 1 NAD+的从头合成和补救合成路径 Figure 1 De novo and Salvage pathways of NAD+ synthesis route. L-Trp: L-tryptophane; Asp: aspartic acid; QA: quinolinic acid; NA: nicotinic acid; NaMN: nicotinic acid mononucleotide; NaAD: nicotinic acid adenine dinucleotide (Deamino-NAD); NAD+: nicotinamide adenine dinucleotide; NAM: nicotinamide; NR: nicotinamide riboside; NMN: nicotinamide mononucleotide. |
| 图选项 |
诱导条件也是影响代谢工程改造菌NA016细胞生长和目标代谢物产量的重要因素[12-13]。诱导条件的差异会导致不同基因在表达水平上存在差异，这种差异使得胞内蛋白表达受到影响进而调节目标代谢物的生成。对于目前代谢途径中有关基因的表达调控，有研究指出基于转录水平上的分析可以从系统生物学的角度集中解读生物代谢与基因表达之间的关系。通过不同诱导条件下对基因转录水平的研究有利于揭示不同基因对目的产物合成贡献上的差异，从而实现对目标产物产量的直接调控[14]。
因此，本研究针对诱导条件优化对菌株NA016中的胞内NAD+含量的影响机制进行了初步探索。在不同的优化条件下，我们同时采用了荧光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技术在转录水平探究重组菌株过表达nadE、pncB、zwf、gnd、prs和ado1这6个基因对NAD+含量的影响，通过解析上述基因表达与NAD+含量变化的相关性，获得对辅酶合成具有正向作用效应的基因，并通过这些正向作用基因的多拷贝表达验证其功能性，进一步提高NAD+的合成水平。这为阐明目标代谢产物和基因表达之间的联系、提高胞内辅酶浓度提供了借鉴。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒与引物: 本研究所用的相关菌种、质粒详见表 1。
表 1. 本研究所用的菌株、质粒 Table 1. Strains and plasmids in this study
| Strains and plasmids | Characteristics | Resource |
| Strains | ||
| ??E. coli DH5α | The cloning host | Lab stock |
| ??NA016 | E. coli BL21(DE3) △ushA: : nadE-SD-AS-pncB, gene nadE-SD-AS-pncB with PT7, △nudE: : prs, gene prs with PT7, △mazG: : gnd-SD-AS-zwf, gene gnd-SD-AS-zwf with PT7, △amn, △add: : ado1, gene ado1 with PT7 | Lab stock |
| ??NA006 | E. coli BL21(DE3)△ushA: : nadE-SD-AS-pncB, gene nadE-SD-AS-pncB with PT7 | Lab stock |
| ??E. coli BL-1 | E. coli BL21(DE3) with pET-21a-nadE-SD-AS-pncB, AmpR | Lab stock |
| ??NA006, △nudC | NA006 with nudC deleted | This study |
| ??NA006, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB | NA006 with nadE-SD-AS-pncB integrated into the nudC locus, gene nadE-SD-AS-pncB with PT7 | This study |
| ??NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB | NA016 with nadE-SD-AS-pncB integrated into the nudC locus, gene nadE-SD-AS-pncB with PT7 | This study |
| Plasmids | ||
| ??pET21a-nadE-SD-AS-pncB | T7 promoter, AmpR | Lab stock |
| ??pCas | repA101(Ts)kan Pcas-cas9 ParaB -Red lacIq Ptrc-sgRNA-pMB1, KanR | Lab stock |
| ??pTargetF | pMB1 aadA sgRNA, SpeR | Lab stock |
| ??pTargetF-nudC | pMB1 aadA sgRNA-nudC, SpeR | Lab stock |
表选项
1.1.2 主要试剂及仪器: 氨苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素的使用浓度分别为100、50、50 mg/L，IPTG的初始条件为0.1 mmol/L，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、RT-qPCR实验试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；高保真聚合酶Primer STAR MAX DNA polymerase、RNA提取试剂，购自宝生物工程(大连)有限公司；葡萄糖、酵母膏提取物、胰蛋白胨，购自国药集团化学试剂有限公司；NAD+、烟酸、腺苷、L-阿拉伯糖等分析生化试剂均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
超高液相色谱仪、高效液相色谱柱，美国Waters公司；电转仪，美国Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
1.1.3 培养基及培养条件: 摇瓶种子培养基及发酵培养基均采用LB培养基(氯化钠10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏提取物5 g/L、pH 7.2)；培养条件为37 ℃、200 r/min，培养时间为18 h。初始条件为诱导温度25 ℃，在OD600为0.6左右加入0.1 mmol/L的IPTG。根据重组菌株的代谢途径改造分析，涉及磷酸戊糖途径的改造需补充添加终浓度为25 mmol/L的葡萄糖，涉及Preiss-Handler途径和腺嘌呤补救途径需添加合成路径中的前体物质，即烟酸、腺苷。烟酸终浓度为0.1 mmol/L, 腺苷终浓度为2 mmol/L。
1.1.4 引物设计与合成: 根据NCBI中E. coli BL21(DE3) nudC基因(ID: 948498)的上下游序列设计引物(表 2)；用于RT-qPCR的引物亦列于表 2中，要求用于RT-qPCR的引物特异性好且PCR时无引物二聚体产生。引物由天霖生物科技(上海)有限公司合成。
表 2. 本研究使用的引物序列 Table 2. Primers used in this study
| Primer | Sequence (5′→3′) |
| nudC-u-F (p1) | GGCGGCGTCAAGCACCAGCAGAATCAGCT |
| nudC-u-R (p2) | GTCAGGCGGTCAGTGTATCAAGCTCTTGCACTACCTTTGC |
| nudC-D-F (p3) | GCAAAGGTAGTGCAAGAGCTTGATACACTGACCGCCTGAC |
| nudC-D-R (p4) | GCCGCCTTCCACCATGTAGGTCGCCAGC |
| nudC-u-R/EB (p5) | TATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCAGCTCTTGCACTACCTTTGC |
| nudC-D-F/EB (p6) | CCGCATATTAAAAAAGCCAGTTAATGATACACTGACCGCCTGAC |
| nadE-u (p7) | GCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGG |
| pncB-R (p8) | TTAACTGGCTTTTTTAATATGCGGAAGGTCGAACGCTTTGCG |
| RT-16sRNA-F | TCGGGAACCGTGAGACAGG |
| RT-16sRNA-R | CCGCTGGCAACAAAGGATAAG |
| RT-pncB-F | TGGTTCCAGGCACATCAGCA |
| RT-pncB-R | TGCAATGCCAAGTTGGTCGG |
| RT-nadE-F | ATTGCGGGAAGCAGGCATTG |
| RT-nadE-R | GGCTTCTGCTGCATGATCGG |
| RT-prs-F | GCGCTATCGCTAAGCTGCTG |
| RT-prs-R | AGTCACGACCTGCAACGTCA |
| RT-zwf-F | GGTAACGCAAACAGCCCAGG |
| RT-zwf-R | ACGCCCTACGCCGATAATCC |
| RT-gnd-F | AAAGATCAGCGTGTTGCCGC |
| RT-gnd-R | CGCACGCAGTTGAGAGAAGC |
| RT-ado1-F | GACGTCACGGCTGAATACCT |
| RT-ado1-R | AGCTCGTCAAAAATAGCCAT |
表选项
1.2 nudC基因敲除质粒的构建 提取E. coli BL21(DE3)的基因组DNA，提取方法参照文献[15]。为了构建敲除基因nudC的同源臂，分别以引物p1/p2和p3/p4，扩增nudC基因的上下游片段，然后通过重叠延伸PCR将nudC上下游片段连接起来。为了构建敲除基因nudC同时敲入基因nadE和pncB的同源臂，分别以引物p1/p5和p6/p4、p7/p8扩增nudC基因的上下游片段和基因nadE-SD-AS-pncB，然后继续通过重叠延伸PCR将nudC的上下游和基因nadE-SD-AS-pncB分别连接起来形成同源臂DNA。
1.3 CRISPR/Cas介导的基因敲除 用于构建突变体菌株的感受态细胞制备方法参见文献[16]。首先将pCas转化到改造菌株中，然后挑取含有pCas质粒的单克隆加入到50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，30 ℃、200 r/min培养至OD600为0.2时，向摇瓶中加入终浓度为30 mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas载体上λ-Red蛋白的表达，然后摇至OD600约为0.5-0.6时回收菌体制备电转感受态。电转化时，向100 μL的感受态细胞加入500 ng的pTargetF-nudC质粒和1 μg的同源臂DNA片段，轻柔混合后，加入到预冷的0.1 cm电转杯中，在2.5 kV的条件下放入电转仪(Bio-Rad)中电转，电转完后迅速加入1 mL的LB培养基，30 ℃、200 r/min培养2 h进行复苏，然后接种菌体于50 mg/L卡那霉素和50 mg/L壮观霉素的LB双抗固体培养基上，30 ℃培养过夜，转化后用菌液或菌落PCR进行检测。
1.4 重组菌株的质粒消除 为了消除pTargetF-nudC和pCas质粒，将重组菌(含有pTargetF-nudC和pCas)在LB培养基中(加入50 mg/L的卡那霉素，并补加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导靶向pTargetF-nudC上的pMB1的sgRNA-pMB1表达)过夜培养，并将其涂布于含50 mg/L卡那霉素的平板上用于消除pTargetF-nudC，待平板上长出单克隆，挑取单克隆在含50 mg/L壮观霉素的LB试管中培养过夜，不长即为pTargetF-nudC消除的重组菌，然后挑取该重组菌在42 ℃的环境中培养，用以消除pCas质粒。
1.5 RNA的提取和cDNA第一链合成 参照TaKaRa RNAiso Plus Total RNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌总RNA，对总RNA进行浓度、完整性等质量检验后于-80 ℃保存备用。采用HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)合成cDNA第一链。
1.6 RT-qPCR 以大肠杆菌16S rRNA为内标，按ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix试剂盒说明书进行RT-qPCR实验。反应程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循环40次。每个样品重复3次。RT-qPCR结果采用2t－△△C方法对基因各Ct值进行定量分析[17]。
1.7 重组菌株最终生长状态和NAD+含量的测定 细胞培养结束后，利用分光光度计测定在600 nm波长下的吸光值OD600。胞内NAD+的提取采用超声破碎，具体步骤参照文献[18-19]。NAD+超高液相色谱检测的条件：流动相为10 mmol/L乙酸铵和乙腈梯度洗脱；流速为0.3 mL/min，洗脱时间12 min。在0-5 min，流动相中乙酸铵溶液与乙腈的比例由99.5︰0.5降低到95︰5，接下来1.4 min内，流动相比例由95︰5变化为30︰70，在第9分钟时流动相重新回到初始状态并持续保持3 min。紫外检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量2 μL。NAD+的液相洗脱图谱如图 1-D所示。
2 结果和分析 2.1 诱导条件优化对重组菌株NAD+合成的影响 研究表明，包括诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时机在内的诱导条件对目的蛋白的表达具有重要影响。为了探究不同诱导条件对重组菌株胞内NAD+合成的影响，首先考察了菌株NA016
在不同诱导温度下胞内NAD+含量的变化以及发酵培养结束时的菌体生长状态。由图 2-A可以看出，菌体OD600随着诱导温度的升高而升高，表明诱导温度的变化影响了菌体繁殖和代谢。研究表明在较低的诱导温度下，虽然微生物细胞生长速度慢，但低温有利于菌株NA016多个异源蛋白的表达和正确折叠，从而促进胞内辅酶的积累。当诱导温度为17 ℃时，胞内NAD+浓度最高达27.33 μmol/g DCW，比初始条件25 ℃诱导提高8.75%。
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| 图 2 诱导温度(A)、诱导剂浓度(B)和诱导时间(C)等对NAD+合成的影响及NAD+液相色谱图(D) Figure 2 Effect of inducing conditions optimization on the content of NAD+ and UPLC map of intracellular NAD+ detection. A: Effect of inducing temperature optimization on the content of NAD+; B: Effect of IPTG concentration optimization on the content of NAD+; C: Effect of inducing time optimization on the content of NAD+; D: UPLC map of intracellular NAD+ detection. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A, B and C are the mean±S.D. of triplicate samples. |
| 图选项 |
其次考察诱导剂浓度优化对胞内NAD+合成的影响。不同诱导剂浓度对基因的表达会产生影响，较低的诱导浓度不利于外源蛋白的高效表达，过高的诱导剂浓度则会抑制微生物的生长，从而间接影响NAD+合成。图 2-B实验结果表明，随着IPTG添加量增加，NAD+含量变化趋势呈现先增后降，当IPTG浓度达0.8 mmol/L时，NAD+含量达到最大值33.95 μmol/g DCW，相比于原有17 ℃、0.1 mmol/L诱导剂诱导，NAD+含量提高24.22%。
不同诱导时机也会改变胞内NAD+含量以及菌体生长状态。图 2-C考察了在大肠杆菌对数生长期的不同诱导时间对胞内NAD+含量的影响。结果表明在OD600达0.6时添加诱导剂，胞内NAD+的积累能达最大。而当OD600超过0.6时，NAD+的浓度会随着诱导时机的推移而下降。根据细胞生长特点，诱导时机过于提前可能会增加菌体代谢负担而使生长受到影响，诱导时机太晚则不利于胞内蛋白表达从而导致NAD+含量下降。
总结上述实验结果可知，不同诱导条件下的胞内NAD+含量存在明显差异。根据研究分析，这些诱导条件的改变是通过影响基因的表达水平从而实现对辅酶合成代谢途径的调控，因此对相关基因转录规律的研究对于进一步提高胞内NAD+浓度具有重要意义。
2.2 诱导条件优化过程重组菌株代谢途径关键基因的相关性分析 为探究不同诱导条件下基因表达调控的影响，对菌株NA016中6个过表达基因进行相对转录水平分析。在诱导温度优化时，以最适诱导温度17 ℃的转录水平作为对照，分析图 3-A可知辅酶Preiss-Handler合成途径中的关键合成酶基因nadE和pncB的相对转录水平都是随着温度的升高而降低。这与图 2-A中NAD+含量随温度变化具有相同规律。基因prs、zwf、gnd整体呈现高于对照组的转录水平，推测这是由于诱导温度升高促进菌体的生长以及细胞对葡萄糖的利用，从而使得磷酸戊糖途径中的有关基因表达得到加强。腺嘌呤补救合成途径中的基因ado1也大致呈现类似规律，随着诱导温度的升高，转录水平上调。
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| 图 3 温度(A)、诱导剂浓度(B)和诱导时间(C)对NAD+合成关键基因转录水平的影响 Figure 3 The effect of induction conditions on the transcription level of key genes involved NAD+ synthesis. A: Effect of inducing temperature optimization on the transcriptional level of key genes involved NAD+ synthesis; B: Effect of IPTG concentration on the transcriptional level of key genes involved NAD+ synthesis; C: Effect of inducing time on the transcriptional level of key genes involved NAD+ synthesis. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A, B and C are the mean±S.D. of triplicate samples. |
| 图选项 |
除诱导温度之外，诱导剂浓度和诱导时机的变化也会造成基因表达的差异。但由图 3-B和3-C的实验结果可知，无论是以最适诱导剂浓度还是最佳诱导时机条件下的转录水平作为对照，基因nadE和pncB在最适条件下都具有最大的相对转录水平。
为了探究不同基因表达与目的产物合成之间的联系，利用SPASS 24.0软件对6个过表达基因的转录水平和NAD+含量进行了相关性分析，结果如表 3所示。研究发现，来自Preiss-Handler合成途径中的基因nadE和pncB的表达与NAD+合成存在正相关，而来自磷酸戊糖途径中的基因zwf、gnd、prs，只有prs与NAD+合成呈现负相关。对于腺嘌呤补救途径中基因ado1的表达水平，由于其与NAD+含量的相关系数并不具有显著性，根据实验结果不能判断其对NAD+合成的影响。类似结果也存在于对zwf、gnd基因表达的相关性分析。
表 3. NAD+含量与相关基因表达量的相关性分析 Table 3. Pearson's correlation analysis between NAD+ content and expression levels of related genes
| Gene name | nadE | pncB | zwf | gnd | prs | ado1 |
| Correlation coefficient R with NAD+ | 0.609* | 0.558* | -0.464 | -0.048 | -0.637* | -0.352 |
| Significance P | 0.016 | 0.031 | 0.082 | 0.865 | 0.011 | 0.198 |
| *: significant correlation (P < 0.05). | ||||||
表选项
2.3 增加关键合成酶基因nadE和pncB的拷贝数对NAD+合成的影响 在nudC位点再次引入基因nadE-SD-AS- pncB以研究增加关键合成酶基因的拷贝数对NAD+合成的影响，命名新的重组菌株为NA006，△nudC: : nadE-SD-AS-pncB。利用上游同源臂的上游引物p1和下游同源臂的下游引物p4进行菌液PCR验证。根据序列分析可知，基因nudC敲除同时基因nadE-SD-AS-pncB在该位点敲入的阳性克隆菌株经PCR扩增后可获得3263 bp的DNA片段。与此同时，为了排除单敲除基因nudC对NAD+合成的影响，我们也构建了菌株NA006，△nudC。
图 4-B的实验结果比较了重组菌株与对照菌株NA006相应基因的转录水平差异(设定对照菌株NA006基因转录水平为1)。从图中可以看出，重组菌株NA006 △snudC由于只是敲除nudC，所以其基因nadE和pncB的相对转录水平与对照相比没有明显差异，图 4-A中的NAD+含量变化也差异不大。相反，重组菌株NA006, △nudC: : nadE- SD-AS-pncB由于再次增加基因nadE和pncB的拷贝数，其nadE和pncB的相对转录水平分别上调1.89倍和1.43倍，且NAD+含量达到15.90 μmol/g DCW，相比于对照菌株提高16.06%。
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| 图 4 菌株NA006、菌株NA006, △nudC和菌株NA006, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB的NAD+含量(A)及相关基因nadE、pncB的转录水平分析(B) Figure 4 Analysis of NAD+ content and transcription level of related genes in strain NA006, strain NA006, △nudC and strain NA006, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB. A: The determination of NAD+ content of strain NA006, strain NA006, △nudC and strain NA006, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB; B: Analysis of relative transcriptional levels of nadE and pncB of strain NA006, strain NA006, △nudC and strain NA006, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A and B are the mean±S.D. of triplicate samples. |
| 图选项 |
2.4 增加正向调控基因nadE和pncB拷贝数对菌株NA016中NAD+合成的影响 由前述实验结果可知，菌株NA016经诱导条件优化胞内NAD+浓度最高可达34.02 μmol/g DCW。为进一步促进胞内NAD+的合成，重组菌株NA016在其nudC位点实现了正向调控基因基因nadE和pncB拷贝数的增加，命名新的重组菌株为NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB。根据图 5-A所示，菌株NA016，△nudC: : nadE-SD-AS- pncB的NAD+含量相对于菌株NA016，NAD+浓度再次提高22.46%，最高可达41.66 μmol/g DCW。同时，NADH浓度也由5.63 μmol/g DCW提高至8.28 μmol/g DCW，表明正向调控基因能够同时提高细胞内NAD+及NADH的浓度。荧光定量PCR实验结果也表明，基因nadE和pncB的相对转录水平分别较NA016上调了2.58倍和0.51倍，再次验证nadE和pncB的过量表达使NAD+的Preiss-Handler合成途径得到加强从而使得辅酶含量进一步提高。
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| 图 5 菌株NA016和菌株NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB的NAD+含量(A)及相关基因nadE、pncB的转录水平分析(B) Figure 5 Analysis of NAD+ content and transcription level of related genes in strain NA016 and strain NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB. A: The determination of NAD+ content of train NA016 and strain NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB; B: Analysis of relative transcriptional levels of nadE and pncB of train NA016 and strain NA016, △nudC: : nadE-SD-AS-pncB. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A and B are the mean±S.D. of triplicate samples. |
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3 讨论 NAD+作为生物体内一种重要的辅因子，对于维持各种生理生化反应具有重要意义。此前，为了提高胞内NAD+含量，利用代谢工程手段已经对NAD+的相关代谢途径进行了大量研究[3]。但是大部分研究仅针对单一代谢途径的改造，为了探究多种代谢途径改造对NAD+合成的影响，我们在之前的实验中构建了重组菌株NA016，分别从NAD+的Preiss-Handler合成途径、磷酸戊糖途径、腺嘌呤补救途径实现了部分基因的过表达。由于这些基因参与了与辅酶合成有关的代谢，它们的过表达对NAD+生成都有一定程度的促进作用。
研究表明，诱导条件优化是改善目标代谢产物含量的重要手段。因此，本研究通过系列诱导优化实验确定了培养的最适诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时机，使重组菌株NA016的NAD+浓度进一步提高35.37%，最高可达34.02 μmol/g DCW。与此同时，测定不同诱导条件下基因转录与NAD+含量之间的关系可知，代谢途径中的基因表达对目的产物合成影响各异。由于微生物代谢是一个复杂过程，涉及多个代谢流的分配与调整，因此有些关键酶基因的表达可能存在正向叠加效应，增加这些正向调控基因的表达能够维持目的产物长久合成。相反，有些基因因为位于代谢流中的关键节点，过量表达虽能一定程度促进目的产物合成，但一旦超过该基因表达调控的最大值，则可能改变产物合成的代谢流从而影响目的产物产量[20]。对于本实验菌株NA016中过表达的6个基因，相关性分析结果显示烟酸磷酸核糖转移酶基因pncB和NAD+合成酶基因nadE的表达水平与NAD+合成存在正相关。此前，nadE和pncB已被证实是辅酶Preiss-Handler合成途径中的关键酶[4]，由此推测对于胞内NAD+的合成代谢，Preiss-Handler途径的过表达相比于其他代谢途径具有更重要的促进意义。对于磷酸戊糖途径中的基因prs，相关系数显示其具有负调控作用，原因可能是基因prs直接参与NAD+合成共底物PRPP的生成，作为众多核苷酸合成的前体，PRPP合成太多可能会影响胞内其他核苷酸的代谢通量进而影响NAD+的合成[10]。而有关基因zwf、gnd和ado1过量表达对辅酶合成的影响作用，由于代谢调控具有复杂性所以还需进一步的实验验证。
基于对基因表达调控的认识，我们在菌株NA006中的nudC位点再次提高基因nadE和pncB的拷贝数，验证正向调控基因拷贝数增加对NAD+合成代谢的影响。与NA006相比，重组菌株NAD+的含量提高16.06%，符合nadE和pncB正向调节NAD+合成的推论。与此同时，为了实现NAD+含量上的突破，在菌株NA016中也采用了类似的改造手段。RT-qPCR结果显示，nadE和pncB的转录水平分别提高了2.58倍和0.51倍，转录水平的上调使得辅酶含量再次提高22.46%，最高可达41.66 μmol/g DCW。根据之前的报道，微生物代谢流的分配在生长过程中并非一成不变，而是随着胞内代谢物水平及环境的变化发生动态调整。在本实验中，我们通过增加代谢途径中正向调节基因的拷贝数，保证了目的产物的高效合成。这种将基因转录水平调节与NAD+合成代谢途径的结合应用可以更加有针对性地对目标途径进行动态调控及机制解析。
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