程济南1, 金辉2,3
, 许忠祥4, 杨晓燕2, 秦波2, 张金林1 1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 草地微生物研究中心, 甘肃 兰州 730000;
2. 中国科学院兰州化学物理研究所, 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室, 甘肃省天然药物重点 实验室, 甘肃 兰州 730000;
3. 烟台中科先进材料与绿色化工产业技术研究院, 山东 烟台 264006;
4. 江苏省南京市海关动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210000
收稿日期：2021-02-18；修回日期：2021-08-22；网络出版日期：2021-09-09
基金项目：国家自然科学基金（31772668）；中国科学院兰州院地合作项目；中国科学院战略性先导科技专项A类（XDA26020201）；烟台中科先进材料与绿色化工产业技术研究院科技创新项目（AMGCE013）
*通信作者：金辉, Tel: +86-931-8913447;Fax: +86-931-8910979;E-mail: comefine@licp.cas.cn;
张金林, E-mail: jlzhang@lzu.edu.cn.
摘要：[目的] 瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属(Stellera)多年生草本植物，是我国草地退化的标志性植物之一。本研究旨在探究甘肃高寒草原主要毒草瑞香狼毒根际微生物群落结构及其与土壤环境因子和酶活性之间关系，为治理因瑞香狼毒入侵引起的草地退化提供理论依据。[方法] 采用Illumina MiSeq高通量测序技术对甘肃不同地区高寒草原的瑞香狼毒根际土壤微生物组成及多样性进行分析，并进一步分析土壤理化性质和酶活性与微生物群落的相关性。[结果] 不同地区瑞香狼毒根际土壤pH随海拔升高呈现上升趋势，土壤中大量和微量营养元素含量以及土壤酶活性的变化各异。在门水平上，子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)和担子菌门(Basidiomycota)在根际土壤真菌中占优势地位；放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)在根际土壤细菌中属于优势类群。海拔2964 m样地的真菌和细菌OTU (operational taxonomic unit)数量和Shannon多样性指数均高于其他4个采样点(海拔2373、2608、2733、3280 m)。RDA (redundancy analysis)分析结果显示，瑞香狼毒根际土壤微生物不同，受土壤环境因子的影响不同；相关系数表明，土壤真菌多样性与土壤钾、磷、铁、钙、钼、海拔、土壤水分、过氧化物酶呈正相关，与土壤温度、多酚氧化酶、脱氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶呈负相关；土壤细菌与土壤pH、钾、磷、镁、钙、土壤水分呈负相关，与多酚氧化酶、过氧化物酶、脲酶、脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶呈正相关。[结论] 甘肃省不同地区高寒草原瑞香狼毒根际微生物群落组成和多样性差异明显，土壤理化性质与土壤真菌具有较强的正相关关系，而土壤酶则更多地影响着土壤细菌群落的组成和多样性。
关键词：瑞香狼毒根际微生物群落结构土壤环境因素高通量测序
Effects of degraded plant Stellera chamaejasme L. on the rhizosphere soil microbial communities in typical alpine grassland, Gansu Province
Jinan Cheng1, Hui Jin2,3
, Zhongxiang Xu4, Xiaoyan Yang2, Bo Qin2, Jinlin Zhang1 1. Center of Grassland Microbiome, State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China;
2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources of Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory for Natural Medicines of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China;
3. Yantai Zhongke Research Institute of Advanced Materials and Green Chemical Engineering, Yantai 264006, Shandong Province, China;
4. Animal, Plant & Food Inspection Center of Nanjing Customs, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
Received: 18 February 2021; Revised: 22 August 2021; Published online: 9 September 2021
*Corresponding author: Hui Jin, Tel: +86-931-8913447;Fax: +86-931-8910979;E-mail: comefine@licp.cas.cn;
Jinlin Zhang, E-mail: jlzhang@lzu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31772668), by the Project of Chinese Academy of Sciences of Lanzhou Academy Local Cooperation, by the Chinese Academy of Sciences Strategic Priority Science and Technology Special Program Class A (XDA26020201) and by the Science and Technology Innovation Project of Yantai Zhongke Advanced Materials and Green Chemical Industry Technology Research Institute (AMGCE013)
Abstract: [Objective] Stellera chamaejasme L., a perennial herb of Stellera, is one of symbolic plants of grassland degradation in China. The purpose of this study was to explore the microbial community structure in the rhizosphere of Stellera chamaejasme L. and its relationship with soil environmental factors and enzyme activity in Gansu alpine steppe, so as to provide a theoretical basis for controlling grassland degradation caused by Stellera chamaejasme L. invasion. [Methods] The Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology was used to analyze the composition and diversity of rhizosphere soil microbes of Stellera chamaejasme L. in various regions of Gansu, and further analyze the relationship between soil physical and chemical properties, enzyme activities and microbial communities. [Results] The results indicated that the pH value of the rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. in different areas increased with altitude, showing an upward trend. The content of macro and micronutrient elements in the soil, and the changes of soil enzyme activities were different. At the phylum level, Ascomycota, Zygomycota and Basidiomycota are dominant in rhizosphere soil fungi. Actinobacteria, Proteobacteria and Acidobacteria belong to the dominant groups in rhizosphere soil bacteria. The numbers of fungi and bacteria OTU (Operational taxonomic unit) and Shannon diversity index of altitude 2964 m are higher than the other four sample points (altitude 2373 m, 2608 m, 2733 m, 3280 m). Redundancy analysis showed that the soil microbes in the rhizosphere of S. chamaejasme are different and are affected differently by soil environmental factors. The correlation coefficient showed that the diversity of soil fungi is positively correlated with soil potassium, phosphorus, iron, calcium, molybdenum, altitude, soil moisture, and peroxidase, as well as soil temperature, polyphenol oxidase, dehydrogenase, invertase, and alkaline phosphatase is negatively correlated. Soil bacteria are negatively correlated with soil pH, potassium, phosphorus, magnesium, calcium, and soil moisture, and positively correlated with polyphenol oxidase, peroxidase, urease, dehydrogenase, invertase, acid phosphatase, and alkaline phosphatase. [Conclusion] The composition and diversity of the rhizosphere microbial community of S. chamaejasme in the alpine grasslands of Gansu Province are obviously different. In addition, the physical and chemical properties of soil have a strong positive correlation with soil fungi, and the soil enzymes have more influence on the composition and diversity of soil bacterial communities.
Keywords: Stellera chamaejasme L.rhizospheremicrobial community structuresoil environmental factorshigh-throughput sequencing
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属(Stellera)多年生草本植物，广泛分布于我国甘肃、青海、宁夏等省区的海拔2300–4200 m、年均温约为2 ℃的高山及亚高山高寒草地[1]。狼毒具有粗大的肉质根，全株有毒，家畜误食后容易引发呕吐、腹泻、甲状腺功能亢进等中毒反应，情况严重更能导致家畜死亡[2]。狼毒全株中根毒性最大，李时珍在本草纲目中描述为“狼毒根有大毒，可杀飞鸟走兽”[3]。此外，瑞香狼毒入侵草地后，形成斑块状集群，其发达的根系具有更高的土壤微生物生物量、土壤养分转化效率，能在营养物质竞争中取得巨大优势，加剧原有草类植被的退化[4–5]。另一方面，瑞香狼毒由于粗大的根系导致周围土壤水分及有机质不断减少，抑制了其他牧草的生长，进而降低了草地载畜量，制约了草地畜牧业的发展[6]。现今，瑞香狼毒已成为我国北方高寒草甸退化的标志性植物之一[7]，制约着我国西北草地的生产力以及畜牧业的发展。
目前，瑞香狼毒中分离的双黄酮类、香豆素类等化合物在抗肿瘤[8]、抗炎[9]等方面具有良好活性，因而瑞香狼毒的研究主要集中在其形态学、化感物质、药理活性等方面[10–11]，对于瑞香狼毒根际微生物与土壤理化性质和酶活性相关性的研究少有报导。金辉等[12–13]对于瑞香狼毒根茎叶以及根际微生物的研究发现，瑞香狼毒根际细菌与根内细菌虽组成相似，但在群落结构以及细菌多样性方面存在较大差异；周攀[14]通过宏基因组测序方法，对瑞香狼毒根际土壤以及非根际土壤微生物进行测序，发现根际与非根际微生物存在较大差异；金辉等[15]对青藏高原瑞香狼毒根际和根部细菌群落的研究发现，土壤磷、pH、纬度、海拔和钾与根际土壤细菌群落呈正相关。但有关甘肃高寒草原瑞香狼毒根际真菌及细菌组成与土壤理化性质和酶活性之间的相关关系仍然缺乏足够认识和系统研究。
植物根系、根际微生物以及根际土壤的相互作用，构成了一个特殊的微生态系统，即植物根际微生态系统[16]。土壤微生物是维持土壤肥力主要组成部分之一，根际微生物作为根际土壤区域中生存的微生物群落，在土壤演化过程也发挥着重要作用[17]。根际土壤微生物与土壤的相关关系是探究植物生长发育、生理生化的重要途径之一，现今已得到越来越多的重视[18]。土壤理化性质与土壤酶是影响土壤微生物群落数量、结构的主要因素之一[19]，土壤理化性质是土壤肥力的重要指标之一[20–22]，土壤酶是表征土壤中物质、能量代谢旺盛程度的一个重要生物指标[23]。土壤有机碳、全氮、土壤水分等与土壤微生物生物量呈显著正相关关系[24]。也有研究表明，土壤环境因素，例如海拔、pH、有机质、全氮、碱解氮、速效钾、有效磷含量，与土壤微生物群落的组成结构以及多样性有关[25]。土壤酶在土壤生态系统中非常活跃，土壤中所有的碳、氮、磷循环和养分转化过程都有土壤酶参与[26]。然而大多数对酶的研究都集中在土壤酶与单一理化特性或养分变化之间的关系上，而没有为这种变化提供实质性的解释[27]。现今对于土壤理化性质以及酶活性的研究，多集中在土壤性质、环境污染治理、对植物生长发育影响等方面，但其与土壤微生物群落结构的相关性方面的研究相对匮乏[28–29]。
本文采用测定微生物多样性的高通量测序技术，对甘肃不同地区高寒草原分布的瑞香狼毒根际微生物群落组成、多样性等结构特征进行了系统研究，并结合土壤理化性质和酶活性，分析瑞香狼毒根际微生态系统要素之间的相关性，揭示根际微生态系统对瑞香狼毒种群竞争和生态适应影响的内在机制。本研究可为合理有效调控草原毒草根际生态系统和制定有毒杂草科学有效的生态控制策略提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 样品信息 本实验选取祁连山东麓具有代表性的天然高寒草原，属亚高山和高山属寒冷湿润气候。根据瑞香狼毒的天然分布模式和种群密度设置5个采样地区，各样点的具体信息见表 1。每个采样点设置3个10 m×10 m样方，作为平行重复。利用五点取样法，挖取健康的瑞香狼毒完整带土植株，用无菌毛刷收集根系2.5 mm范围内的土壤，即为根际土壤。采集大小相似的瑞香狼毒植株，测得地上生物量约为3.0–4.5 g，地下生物量约为45.0–55.0 g。将每个样方采集的5株根际土壤样品混匀，低温带回实验室，放入–4 ℃冰箱备用。将混匀的根际土壤样品分成3份，一份用于测定土壤理化性质，一份用于测定土壤酶活性，另外一份用于微生物多样性的高通量测序，每个样地样品设置3个重复。
表 1. 瑞香狼毒采样地信息表 Table 1. Information table of Stellera chamaejasme L. sampling
| Serial number | Sampling location | Altitude/m | North latitude | East longitude | Average annual temperature/℃ | Average annual precipitation/mm |
| 2.3KS | Huangcheng Grassland, Sunan County | 2373 | 37°59′47″ | 101°56′42″ | 2 | 260 |
| 2.6KS | Machangtan Grassland, Sunan County | 2608 | 38°50′31″ | 99°53′40″ | 2 | 300 |
| 2.7KS | Mati Temple Grassland, Sunan County | 2733 | 38°27′58″ | 100°24′27″ | 2 | 425 |
| 2.9KS | Zhaxi Xiulong township Grassland, Tianzhu Tibetan Autonomous County | 2964 | 37°07′19″ | 102°50′08″ | –2 | 400 |
| 3.2KS | Zhaxi Xiulong township Grassland, Tianzhu Tibetan Autonomous County | 3280 | 37°07′18″ | 102°46′40″ | –2 | 400 |
| 2.3KS: soil sample from 2373 altitudes; 2.6KS: soil sample from 2608 altitudes; 2.7KS: soil sample from 2733 altitudes; 2.9KS: soil sample from 2964 altitudes; 3.2KS: soil sample from 3280 altitudes. | ||||||
表选项
1.2 土壤理化性质及酶活性测定 土壤pH值采用酸度计测定[30]；土壤含水量采用烘干法测定；土壤温度使用土壤温度计测定；采用重铬酸盐法[31]测定土壤有机质含量；采用重铬酸钾硫酸消化法[32]测定土壤全氮含量；全碳使用元素分析仪(Vario EL/micro cube，Elementar，Hanau，Germany)测定；有效钾采用NH4OAc浸提-火焰光度法测定；土壤有效磷采用钼锑抗比色法[33]测定；土壤微量元素(Fe、Ca、Mo、Mg)含量采用HF-HClO4-HNO3消煮，用电感耦合等离子体发射光谱法[34] (ICP-OES)测定。
土壤多酚氧化酶活性采用没食子素比色法测定；土壤过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；土壤脲酶活性采用用苯酚-次氯酸钠比色法[35]测定；脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法测定；土壤蔗糖酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸比色法[36]测定；土壤酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定；土壤碱性磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸盐法[37]测定。
1.3 样品总DNA提取与MiSeq测序 准确称取1.0 g根际土壤样品用于土壤总DNA提取，使用土壤微生物DNA提取试剂盒(ZR Soil Microbe DNA KitTM，Zymo Research，Orange，CA，USA)提取DNA，流程参见产品说明书。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。使用无菌水稀释样品至1 ng/μL作为基因组DNA模板，对带标签序列(Barcode)的ITS区进行扩增。PCR扩增采用引物ITS1F/ITS2R (ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[38]。PCR反应体系为50 μL：DNA模板3.0 μL，引物各2.0 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，Taq酶0.4 μL (Promega，Madison，WI，USA)，dNTPs 5.0 μL，ddH2O 32.6 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 1 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。细菌方面，利用细菌16S rRNA的V3–V4可变区通用引物341F (5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACTACHVGGG TATCTAATCC-3′)[39]，扩增条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环，94 ℃ 20 s，5 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环，72 ℃ 5 min。通过引入Illuminn桥式PCR兼容引物进行第二轮扩增，扩增体系：1 mL 10 μmol/L的Primer F，1 μL 10 mol/L的Primer R，基因组DNA 20 mg，15 μL 2×Tag酶，加ddH2O补足至30 μL。PCR产物使用1.5 %浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，GeneJET (Thermo Scientific)胶回收试剂盒回收PCR产物。通过NEB Next? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，对文库经Qubit定量和文库检测合格后，使用MiSeq进行上机测序。
1.4 数据分析 根据Barcode序列将下机数据拆分为不同样品数据，截去Barcode序列和PCR扩增引物序列；使用FLASH对每个样品的reads进行拼接，得到原始Tags数据(Raw Tags)；参照Qiime的Tags质量控制流程，将原始Tags数据过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)；检测嵌合体序列并去除，得到有效数据(Effective Tags)；用Uparse v7.0.100软件对所有样品的全部Effective Tags序列进行OTUs (operational taxonomic units)聚类(97%的一致性)。用Qiime中的BLAST方法与Unite_INSDC数据库进行物种注释分析，OTUs的丰度初步表明样品的物种丰富度。
采用QIIME计算的指数，利用软件R进行稀释度曲线绘制；利用Mothur软件进行单个样品的Alpha多样性分析(Alpha Diversity)，基于OTU的结果，对Shannon指数、Chao1指数进行计算，用以进行生物多样性分析。Beta Diversity是对不同样品的微生物群落构成进行比较，利用Qiime (Version 1.7.0)软件，进行样品的Beta多样性分析，以此来挖掘样品之间的差异。使用Qiime中的BLAST方法与Unite_INSDC数据库进行物种注释分析，各组样品在不同水平上的分类比较柱形图、单个样品的群落分布柱形图是使用Qiime软件获得的。为了分析土壤环境因子与微生物群落之间的关系，分别以真菌群落在纲水平上、细菌群落在门水平上的相对丰度数据作为物种数据，土壤的理化性质以及酶活性作为土壤的环境变量，通过软件Canoco 4.5进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。
2 结果和分析 2.1 瑞香狼毒根际土壤理化性质及酶活性 由表 2可知，2.3KS和2.6KS样地的瑞香狼毒根际土壤pH呈中性偏酸，其余采样点的土壤呈中性偏碱。土壤大量元素、微量元素的含量变化各异，总体上，土壤pH、土壤含水率随着样地海拔高度增加而增加，土壤温度则呈现下降趋势，土壤全氮与土壤有机质含量呈增加趋势。各样地土壤大量和微量元素含量变化趋势随海拔高度增加呈先增加后下降的趋势，在2.7KS样地或2.9KS样地达到峰值。土壤过氧化物酶随样地海拔高度增加呈先增加后下降的趋势，在2.7KS样地达到峰值，而其他6种土壤酶则呈先下降后增加的趋势，在2.7KS或2.9KS样地时达到最低值(表 3)。
表 2. 不同地区瑞香狼毒根际土壤营养元素含量 Table 2. Contents of nutrient elements in rhizosphere soil of S. chamaejasme from different regions
| Sample plot | 2.3KS | 2.6KS | 2.7KS | 2.9KS | 3.2KS |
| pH | 6.75±0.14c | 6.69±0.09c | 7.70±0.05a | 7.35±0.05b | 7.52±0.11b |
| SH/% | 18.61±1.86c | 9.65±0.71d | 29.53±2.12b | 39.00±0.84a | 36.68±1.21a |
| ST/℃ | 11.65±1.04b | 14.19±0.93a | 11.42±0.17b | 9.77±0.89c | 8.43±0.58c |
| TN/(g/kg) | 0.30±0.07b | 0.74±0.22a | 0.41±0.17b | 0.73±0.02a | 0.73±0.04a |
| SOM/(g/kg) | 3.85±0.24c | 5.57±0.31b | 2.57±0.14c | 8.85±0.31a | 9.62±1.26a |
| H%/(g/kg) | 0.65±0.05c | 1.18±0.03b | 0.42±0.14c | 1.63±0.01a | 1.77±0.16a |
| K/(g/kg) | 16.14±0.50b | 15.92±0.31b | 18.93±0.35a | 18.19±0.86a | 15.03±0.63b |
| P/(mg/kg) | 9.30±0.34b | 7.34±0.28c | 10.52±0.42a | 9.41±0.30b | 7.51±0.45c |
| Fe/(g/kg) | 24.58±0.98d | 34.95±0.27b | 32.60±1.76c | 80.55±1.19a | 31.64±1.06c |
| Ca/(g/kg) | 5.81±0.46c | 3.01±0.01d | 10.83±0.56b | 24.56±1.47a | 10.77±0.25b |
| Mo/(μg/kg) | 33.53±0.96e | 76.96±0.09c | 134.63±8.05a | 62.03±6.25d | 96.06±4.74b |
| Mg/(g/kg) | 10.76±0.53b | 7.18±0.35d | 11.78±0.29a | 8.65±0.18c | 8.17±0.56c |
| pH: pondus hydrogenii; SH: soil humidity (%); ST: soil temperature (℃); TN (g/kg): The nitrogen content per kilogram of soil; SOM (g/kg): the content of organic matter per kilogram of soil; H% (g/kg): hydrogen content per kilogram of soil; K (g/kg), P (mg/kg), Fe (g/kg), Ca (g/kg), Mo (μg/kg), Mg (g/kg): represent the content of potassium, phosphorus, iron, calcium, molybdenum, and magnesium per kilogram of soil. | |||||
表选项
表 3. 不同地区瑞香狼毒根际土壤酶活性 Table 3. Soil enzyme activities in the rhizosphere of S. chamaejasme from different regions
| Sample plot | 2.3KS | 2.6KS | 2.7KS | 2.9KS | 3.2KS |
| PPO/[mg/(d·g)] | 24.61±0.02c | 34.18±0.07a | 20.94±0.03d | 11.46±0.01e | 27.18±0.01b |
| POD/[mg/(d·g)] | 39.24±0.09e | 52.21±0.01c | 65.11±0.01a | 57.84±0.01b | 51.41±0.01d |
| UE/[g/(d·g)] | 254.24±0.14b | 225.39±0.10d | 169.55±0.05e | 423.33±4.36a | 238.69±0.09c |
| DHA/[g/(d·g)] | 25.78±0.03a | 21.82±0.01b | 20.27±0.02c | 21.97±1.00b | 19.46±0.04c |
| SC/[mg/(d·g)] | 29.79±0.02b | 32.33±0.02a | 17.77±0.01e | 24.33±0.01d | 25.13±0.01c |
| ACP/[mol/(d·g)] | 22.80±0.01b | 11.53±0.02e | 16.88±0.01d | 24.81±0.01a | 20.46±0.01c |
| AKP/[mol/(d·g)] | 6.56±0.45b | 9.83±0.01a | 3.67±0.01d | 1.26±0.04e | 6.07±0.17c |
| PPO: polyphenol oxidase; POD: peroxidase; UE: urease; DHA: dehydrogenases; SC: invertase; ACP: acid phosphatase; AKP: alkaline phosphatase. | |||||
表选项
2.2 瑞香狼毒根际土壤微生物群落丰度 各样品测序真菌样品覆盖度均在94%以上，细菌样品覆盖度在84%以上，且样品稀释曲线显示，随着测序样品数目的增加，5个样品的OTUs稀释曲线趋于平缓，表明本实验测序的数据量渐进合理，能较全面地反映测序样品的微生物群落组成，数据量的增多对于发现新的OTU数目的贡献变小(图 1)。
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| 图 1 瑞香狼毒根际土壤真菌(A)及细菌(B) OTU稀疏度曲线 Figure 1 OTU sparsity curve of rhizosphere soil fungi (A) and bacterial (B) of Stellera chamaejasme L.. |
| 图选项 |
2.3 瑞香狼毒根际土壤微生物组成和多样性 不同地区瑞香狼毒根际土壤真菌在门水平上的物种组成结果显示，5个样地的根际土壤样品中共获得5个门的真菌，其中子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)和担子菌门(Basidiomycota)分别占真菌总序列数的62.3%、17.8%和16.6%，是根际土壤的优势真菌类群(图 2-A)。不同采样地的真菌群落分布有着比较明显的差异，其中2.3KS、2.6KS、2.7KS和2.9KS样地土样皆以子囊菌门真菌为主，而3.2KS样地则以接合菌门真菌为主要菌群。在纲水平上，共注释到了22个纲的真菌，其中散囊菌纲(Eurotiomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、接合菌门(Zygomycota Incertae sedis)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)的相对丰度分别为20.5%、19.3%、17.8%、12.8%以及11.0%，相对丰度之和超过73% (图 2-B)。
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| 图 2 根际土壤真菌门水平(A)及纲水平(B)组成 Figure 2 Rhizosphere soil fungi phyla level (A) and class level (B) composition. |
| 图选项 |
瑞香狼毒根际土壤细菌在门水平上共检测到34门的细菌，其中放线菌门(Actinobacteria) (37.4%)、变形菌门(Proteobacteria) (24.7%)、酸杆菌门(Acidobacteria) (10.7%)为优势菌群，占总丰度和的72.8% (图 3-A)。2.6KS、2.7KS和3.2KS样地均以放线菌门为主，而2.3KS和2.9KS样地以变形菌门为主。在纲水平上共注释得到112个纲的细菌，其中油菌纲(Thermoleophilia) (19.6%)、放线菌纲(Actinobacteria) (13.6%)、变形菌纲(Alphaproteobacteria) (12.9%)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia) (7.4%)为主要类群，相对丰度之和超过54% (图 3-B)。
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| 图 3 根际土壤细菌门水平(A)及纲水平(B)组成 Figure 3 Rhizosphere soil bacterial phyla level (A) and class level (B) composition. |
| 图选项 |
以OTU水平对5个采样地瑞香狼毒根际土壤真菌群落进行主坐标分析，绘制成PCoA图，如图 4-A所示。真菌群落主坐标PCoA1与PCoA2分别达到42.52%与25.76%。2.3KS与2.9KS样地在图中相距较近，2.6KS与2.7KS样地的距离较近，距离较近表明真菌群落结构相似；而3.2KS样地与其余4个样地在图中相距较远，因而其真菌群落结构与其余4个样地的差异较大。对根际土壤细菌群落的主坐标分析发现，细菌群落主坐标成分PCoA1与PCoA2分别达到49.44%与24.68%。2.3KS与2.9KS细菌菌群在图中相聚较近并在同一象限内，它们与3.2KS在图中距离也较为接近，表明细菌群落结构相似。此外，2.6KS和2.7KS样地相互之间的距离均较远，它们与其余3个样地之间的距离也较远，表明细菌群落结构组成差异较大(图 4-B)。
 |
| 图 4 瑞香狼毒根际土壤真菌(A)及细菌(B)群落主坐标分析 Figure 4 Principal coordinate analysis of rhizosphere soil fungi (A) and bacterial (B) communities of Stellera chamaejasme L.. |
| 图选项 |
5个采样地瑞香狼毒根际微生物Alpha多样性分析结果见表 4。根际土壤真菌的Shannon多样性指数的变化趋势为：2.9KS＞2.7KS＞2.6KS＞3.2KS＞2.3KS，随海拔高度增加呈先增加后下降趋势，2.9KS样地Shannon指数最高，2.3KS样地Shannon指数最低。Chao1指数的变化趋势为：2.3KS＞2.9KS＞2.6KS＞3.2KS＞2.7KS，总体上表现为随海拔高度增加呈波浪状变化趋势，2.3KS样地Chao1指数最高，2.7KS样地Chao1指数最低。根际土壤细菌的Shannon多样性分析结果表明，2.9KS＞3.2KS＞2.3KS＞2.6KS＞2.7KS，总体上呈波浪状变化趋势，2.9KS样地细菌Shannon指数最高，而在2.7KS样地Shannon指数最低；Chao1指数分析结果为：2.3KS＞2.9KS＞3.2KS＞2.6KS＞2.7KS，表现为随海拔高度增加呈波浪状变化趋势，2.3KS样地Chao1指数最高，2.7KS样地Chao1指数最低，变化趋势与真菌结果相似。综合上述结果发现，2.9KS样地的真菌及细菌菌群丰富度及多样性均为最高。
表 4. 根际土壤微生物Alpha多样性分析表 Table 4. Analysis of alpha diversity of rhizosphere soil microorganisms
| Sample plot | 2.3KS | 2.6KS | 2.7KS | 2.9KS | 3.2KS | |
| Fungi | Effective tags | 69879±695b | 96426±948a | 57402±1146c | 24290±397e | 38715±553d |
| OTU (97%) | 299±5c | 286±9c | 325±8b | 386±3a | 331±6b | |
| Shannon (97%) | 3.35±0.01e | 4.03±0.02c | 4.66±0.03b | 5.60±0.03a | 3.96±0.01d | |
| Chao1 (97%) | 425.56±6.01a | 379.12±26.29b | 361.74±6.30b | 394.00±27.67a | 365.20±1.18b | |
| Coverage (%) | 96.55±0.76a | 96.59±1.30a | 96.53±0.59a | 94.34±1.41b | 97.14±0.37a | |
| Bacterial | Effective tags | 54166±382a | 36394±1180c | 17314±790d | 41378±1754c | 51045±2022b |
| OTU (97%) | 1747±177a | 1013±103b | 925±92b | 1818±188a | 1734±169a | |
| Shannon (97%) | 8.81±0.35a | 7.79±0.36b | 7.53±0.29b | 9.16±0.38a | 8.99±0.37a | |
| Chao1 (97%) | 2330.36±404.07a | 1241.76±180.29b | 961.62±106.90b | 2229.90±354.69a | 2170.34±285.14a | |
| Coverage (%) | 88.69±4.39a | 88.77±3.24a | 84.20±2.83a | 85.32±4.02a | 86.28±3.91a | |
表选项
2.4 瑞香狼毒根际土壤微生物群落聚类分析 根据根际土壤微生物在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属及其在每个样品中的丰度信息绘制热图，并从分类信息和样品间差异2个层面进行聚类。结果显示，不同样地瑞香狼毒根际土壤真菌群落之间存在差异，Capronia和Cadophora属的真菌在2.3KS样地占优势，外瓶柄霉属(Exophiala) 和葡萄穗霉(Stachybotrys) 属的真菌在2.6KS样地居于主要类群，硬皮马勃属(Sclerodermo)、湿伞属(Hygrocybe)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、腐质霉属(Humicola)、青霉属(Penicillium)和Tetracladium属在2.7KS样地相对富集，2.9KS样地中，裂褶菌属(Schizophyllum)、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、栓菌属(Trametes)、盖孔菌属(Funalia)、鬼伞属(Coprinus)、蜡孔菌属(Ceriporia)、蛇孢日规壳属(Ophiognomonia)、多孔菌属(Irpex)、丝盖伞属(Inocybe)、丝膜菌属(Cortinarius)等19个属的真菌均有较高的富集度，3.2KS样地中，被孢霉属(Mortierella)、轮枝孢属(Verticillium)、油瓶霉属(Lecythophora)、蜜环菌属(Armillaria)和地丝霉属(Geomyces)真菌占优势地位相对富集(图 5-A)。
 |
| 图 5 根际土壤真菌(A)及细菌(B)物种丰度聚类图 Figure 5 Cluster map of the abundance of rhizosphere soil fungi (A) and bacterial (B). |
| 图选项 |
选择相对丰度排名前35的细菌属，绘制瑞香狼毒根际土壤细菌聚类分析热图。结果显示，在2.3KS样地中，假单胞菌属(Pseudomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas)、极地单胞菌属(Polaromonas)和Methylotenera等8个属的细菌占优势；在2.6KS样地中，Amycolatopsls、Rubroacter和分支杆菌属(Mycobacterium)细菌居于优势地位，在2.7KS样地中，链霉菌属(Streptomyces)、亚硝化球菌(Nitrososphaera)、小梨形菌属(Pirellula)、浮霉状菌属(Planctomyces)和原小单孢菌属(Promicromonospora) 的细菌较多，在2.9KS样地中，DA101属和土微菌属(Pedomicrobium) 属于优势类群，在3.2KS样地中，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Skermanella属的细菌占优势(图 5-B)。
2.5 土壤微生物与土壤特征的相关性 根据DCA分析结果，真菌LGA=0.73＜3，细菌LGA=0.83＜3，本研究采用线性模型的RDA分析。结果表明，第一、第二排序轴累计解释率分别为43.4%以及28.7%，累计解释率为72.1% (表 5)。因此第一、第二排序轴能较好地反映出真菌群落与土壤理化性质、酶活性之间的相关性。经蒙特卡洛检验，P＜0.05，表明环境因子与根际土壤真菌存在线性关系。由图 6-A、表 6可知，对于真菌群落来说，物种排序轴与环境因子排序轴第一排序轴与第二排序轴之间的相关系数为1，表明两轴平行，因此RDA排序能较好地解释物种与环境的关系。子囊菌门的古根菌纲、担子菌门的伞菌纲与P、Fe、K、Ca、pH、SH箭头方向一致呈正相关，与土壤蔗糖酶(SC)、土壤碱性磷酸酶(AKP)、土壤多酚氧化酶(PPO)箭头方向相反呈负相关；子囊菌门的锤舌菌纲与土壤脱氢酶(DHA)箭头方向一致呈正相关，与pH、SH、Altitude、Mo箭头相反呈负相关；此外，子囊菌门的散囊菌纲与ST、土壤蔗糖酶(SC)箭头一致呈正相关，与K、P、Fe、Ca、SH、pH、Mo、Altitude箭头方向相反呈负相关。总体上，由表 6可知，K与土壤真菌相关系数最高，系数值为0.907，其次为pH (0.904)，其余金属元素含量均与土壤真菌群落结构有显著正相关。此外，土壤真菌与PPO相关系数最低，系数值为–0.919，除ACP与UE显示正相关性之外，其余酶均表现为显著负相关。海拔和土壤湿度与真菌群落结构呈负相关关系，土壤温度则表现为正相关关系。土壤TN、SOM和H%与土壤真菌群落结构无显著影响(P＞0.05)。5个样地瑞香狼毒根际土壤真菌群落的大部分类群与土壤理化性质箭头方向一致呈正相关，主要分布在第一、第四象限，表明土壤理化性质对土壤真菌影响较大。
表 5. RDA排序轴特征值及解释比例 Table 5. Eigenvalues and explanation percentage of RDA axes
| RDA axes | Fungi | Bacteria | ||||||
| AX1 | AX2 | AX3 | AX4 | AX1 | AX2 | AX3 | AX4 | |
| Eigenvalues | 0.434 | 0.287 | 0.188 | 0.090 | 0.688 | 0.252 | 0.043 | 0.017 |
| Species-environment correlations | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Cumulative percentage variance of species data | 43.4 | 72.1 | 91.0 | 100.0 | 68.8 | 94.0 | 98.3 | 100.0 |
表选项
 |
| 图 6 土壤微生物群落特征与土壤环境因子的相关性RDA分析 Figure 6 RDA analysis of the correlation between soil fungal community characteristics and soil environmental factors. A: F1: Archaeorhizomycetes; F2: Dothideomycetes; F3: Eurotiomycetes; F4: Incertaese disscape; F6: Leotiomycetes; F7: Orbiliomycetes; F8: Pezizomycetes; F9: Saccharomycetes; F10: Sordariomycetes; F11: unidentified; F12: Agaricomycetes; F13: Exobasidiomycetes; F15: Microbotryomycetes; F16: Tremellomycetes; F19: Glomeromycetes; F21: Incertae sedis; F22: unidentified. B: B1: Unclassified-Other; B2: Crenarchaeota; B4: Bacteria-Other; B5: Acidobacteria; B6: Actinobacteria; B7: Armatimonadetes; B8: BRC1; B9: Bacteroidetes; B10: Chlamydiae; B11: Chlorobi; B12: Chloroflexi; B13: Cyanobacteria; B16: Firmicutes; B21: Gemmatimonadetes; B22: Nitrospirae; B23: OD1; B25: Planctomycetes; B26: Proteobacteria; B30: TM7; B32: Verrucomicrobia; B34: WS3. The red arrow and the blue arrow represent the relative position of soil physical and chemical properties and enzyme activity on the horizontal plane, the angle between the arrow and the sort axis is different, the correlation strength is also different, the smaller the angle, the greater the correlation. The longer the length of the arrow, the greater the effect of the environmental factor; The black arrow represents the species distribution at the class level, and the longer the arrow, the greater the impact of the species in the sample. |
| 图选项 |
表 6. 环境因子与前两个排序轴之间的相关系数 Table 6. Correlation coefficients of water environmental factors and the first two axes of RDA
| Impact factor | Fungi | Bacteria | ||
| SPEC AX1 | SPEC AX2 | SPEC AX1 | SPEC AX2 | |
| SPEC AX1 | 1 | 1 | ||
| SPEC AX2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| ENVI AX1 | 1** | 0 | 1** | 0 |
| ENVI AX2 | 0 | 1** | 0 | 1** |
| pH | 0.904** | 0.407 | –0.248 | –0.803** |
| TN | 0.279 | –0.181 | –0.162 | 0.339 |
| SOM | 0.390 | –0.120 | 0.345 | 0.192 |
| H% | 0.328 | –0.178 | 0.269 | 0.290 |
| K | 0.078 | 0.907** | –0.167 | –0.833** |
| P | 0.030 | 0.820** | 0.094 | –0.873** |
| Fe | 0.020 | 0.711** | 0.336 | –0.331 |
| Ca | 0.328 | 0.780** | 0.401 | –0.624** |
| Mo | 0.736** | 0.060 | –0.820** | –0.481* |
| Mg | 0.069 | 0.466* | 0.035 | –0.718** |
| Altitude | 0.852** | –0.048 | –0.060 | –0.199 |
| SH | 0.746** | 0.492* | 0.282 | –0.685** |
| ST | –0.731** | –0.188 | –0.427 | 0.461* |
| PPO | –0.188 | –0.919** | –0.476* | 0.791** |
| POD | 0.556** | 0.514* | –0.624** | –0.639** |
| UE | –0.173 | 0.537* | 0.691** | –0.106 |
| DHA | –0.858** | 0.078 | 0.639** | 0.256 |
| SC | –0.714** | –0.588** | 0.270 | 0.937** |
| ACP | 0.109 | 0.500* | 0.874** | –0.445* |
| AKP | –0.387 | –0.882** | –0.339 | 0.876** |
| SPEC AX1: zooplankton species ordination AX1; SPEC AX2: zooplankton species ordination AX2; ENVI AX1: environmental ordination AX1; ENVI AX2: environmental ordination AX2. *: P < 0.05; **: P < 0.01. | ||||
表选项
根际土壤细菌与土壤环境因子相关性的RDA分析结果表明，第一排序轴的解释率为68.8%，第二排序轴的解释率为25.2%，累计解释率有94.0%，表明土壤细菌与土壤理化性质、酶活性之间的相关性较大。蒙特卡洛检验表明，P＜0.05，表明环境因子与根际土壤细菌存在线性关系。图 6-B与表 6说明排序能较好地解释物种与环境的关系。酸杆菌门、泉古菌门、浮霉菌门、WS3与pH、K、Mg、P箭头方向一致呈正相关，与土壤蔗糖酶(SC)、土壤碱性磷酸酶(AKP)、土壤多酚氧化酶(PPO)箭头方向相反呈负相关。放线菌门、绿弯菌门与Mo箭头方向一致呈正相关，与土壤酸性磷酸酶(ACP)箭头方向相反呈负相关。厚壁菌门与土壤蔗糖酶(SC)箭头方向一致呈正相关，而与pH、Mo、K箭头相反呈负相关。蓝细菌则与土壤碱性磷酸酶(AKP)、土壤多酚氧化酶(PPO)箭头一致呈正相关，与SH、Ca、P、Mg呈负相关。总体上，表 6中，SC相关系数最高(0.937)，P相关系数最低(–0.873)。酶与土壤细菌群落有较强的正相关关系，K、P、Ca、Mo、Mg则与土壤细菌群落有较强的负相关关系。土壤湿度与真菌群落结构呈负相关关系，土壤温度则表现为正相关关系。海拔高度、TN、SOM、H%、Fe与土壤细菌群落结构无显著影响(P > 0.05)。
3 讨论 瑞香狼毒根际土壤样品真菌及细菌物种组成丰富，不同高寒草地瑞香狼毒根际土壤真菌及细菌群落结构存在一定的差异。本研究中子囊菌门在2.3KS、2.6KS、2.7KS以及2.9KS四个样地的真菌类群中均占优势地位，接合菌门在3.2KS样地为优势类群。子囊菌门[40–41]是土壤中丰富度最高的真菌，在偏碱与偏酸性的土壤中均能大量生存。Jin等[12]对甘肃岷县瑞香狼毒根际土壤真菌的研究结果显示，主要真菌门为子囊菌门，这与本研究结果一致。然而，周攀等[24]在对青海省祁连县瑞香狼毒根际土壤微生物的研究发现，该地的根际土壤真菌主要菌门为接合菌门，子囊菌门次之，这与本研究3.2KS样地结果相似。本文Beta多样性分析显示，各样地瑞香狼毒根际土壤真菌群落差异性都较大，表明土壤真菌具有丰富的多样性，不同地方的土壤中存在各自的优势真菌群，瑞香狼毒根际土壤真菌群落结构受到自身生长地点土壤的影响。在细菌方面，本研究中主要优势菌群为放线菌门，其次为变形菌门与酸杆菌门。5个样地中2.6KS、2.7KS、3.2KS三个样地中放线菌门为主要优势菌群，2.3KS与2.9KS样地为中变形菌门为主要优势细菌菌群，这与前人研究结果相似[15, 42–43]，表明变形菌门与放线菌门是土壤主要的优势菌门。Jin等[13]对甘肃榆中县萃英山瑞香狼毒根际土壤细菌的研究结果表明，主要优势细菌门为变形菌门，这与本研究中2.3KS与2.9KS样地一致。根际土壤为植物与外界环境物质循环的主要场所，微生物作为土壤与植物联系的重要参与者，受到土壤环境因子与植物的共同影响[44]。因此，不同地区的气候及土壤环境造就了瑞香狼毒根际土壤微生物组成的多样性。
前期****研究表明，土壤微生物多样性以及群落组成结构受土壤理化性质的显著影响[45]。本研究中，瑞香狼毒的生长地区在偏酸与偏碱的地方均有生长，RDA分析结果显示，土壤理化性质对于根际真菌组成均有较大的相关性。瑞香狼毒根际土壤真菌多样性与土壤K、P、Fe、Ca、SH等呈正相关，而根际土壤细菌则于pH、K、P、Mg、Ca等呈负相关。瑞香狼毒根际土壤pH对于真菌子囊菌门的古根菌纲、担子菌门的伞菌纲呈正相关，图 6-B显示pH对于细菌酸杆菌门、泉古菌门等也呈正相关，这与Jin等[46]对青海瑞香狼毒根际土壤理化性质的研究结果相似。本研究中瑞香狼毒根际土壤中各大量元素与微量元素的含量随样地海拔高度的升高大致上呈现增加的趋势，Alpha多样性分析显示各样地瑞香狼毒根际土壤微生物的多样性随样地海拔增加而增加，表明瑞香狼毒根际土壤营养元素与土壤微生物的丰富度以及多样性之间呈正相关关系。这与郑诗樟等[47]对于丘陵红壤不同人工林型土壤微生物类群的研究结果相似。另外，瑞香狼毒根际细菌变形菌门与土壤P在RDA图中箭头夹角小于90°，表明P与变形菌门呈正相关，这与Jin等[15]的研究结果相反，这可能是土壤样地的不同导致的。现今，对于瑞香狼毒根际土壤微生物与土壤理化性质相关性的研究鲜有报道，土壤理化性质对其入侵机制的影响还未可知，需要更深入、系统的研究。另一方面，土壤理化性质中元素含量也伴随着土壤酶活性在一定程度上有所增加[48]。因此，对于瑞香狼毒根际土壤理化性质因子与土壤各个酶活性之间存在的内在联系需要更进一步的探究。
土壤酶是生态系统物质循环以及能量转化过程中重要的参与者[49]。本研究中，总体上土壤酶与细菌的相关性大于真菌。相较于其余样地，根际土壤微生物多样性及丰富度最高的2.9KS样地有最低的多酚氧化酶和碱性磷酸酶以及最高含量的脲酶和酸性磷酸酶。RDA分析结果显示，不同真菌及细菌类群与各土壤酶之间相关性不同，其中多酚氧化酶与瑞香狼毒根际土壤微生物群落结构呈较强负相关。微生物组成多样性及丰富度最高的2.9KS样地，多酚氧化酶活性最低(表 3)。瑞香狼毒根际土壤中的多酚氧化酶活性不足以完全降解植物残体中由木质素转化的酚类、芳香族类等化合物[50–51]，无法形成土壤物质循环。这或许是导致瑞香狼毒入侵、土壤退化的因素之一。本研究中瑞香狼毒根际土壤中脲酶活性仅与土壤细菌呈正相关，且与土壤全氮呈负相关，这与前人研究结果相反[52]，表明瑞香狼毒的入侵可能改变了对于土壤氮的利用方式以及效率。此外，瑞香狼毒根际土壤酸性磷酸酶与土壤细菌群落呈正相关，而碱性磷酸酶对土壤真菌和细菌呈显著负相关性。这与王毅[53]对与若尔盖沙化草地酸性磷酸酶的研究和郝玉兰等[54]对自然土壤中碱性磷酸酶活性状况的研究不同。表明瑞香狼毒的入侵，会改变原有土壤微生物与土壤酶活性之间的相关性。
4 结论 甘肃省不同高寒草地瑞香狼毒根际土壤pH随海拔高度升高而由偏酸性改变为偏碱性。5个样地瑞香狼毒根际土壤大量元素和微量元素含量变化趋势随海拔高度增加呈先增加后下降的趋势，在2.7KS样地或2.9KS样地达到峰值。土壤酶除过氧化物酶(POD)外，其他6种土壤酶则呈先下降后增加的趋势，在2.7KS或2.9KS样地时达到最低值。不同样地之间比较发现，2.9KS样地瑞香狼毒根际土壤微生物多样性高于其余4个样地。子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是瑞香狼毒根际土壤中主要的真菌类群，放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)是主要的细菌类群。通过RDA分析及其相关系数发现，瑞香狼毒根际土壤单个真菌或细菌受土壤理化性质和酶的影响各异；总体上，根际土壤真菌与土壤pH、钾、磷、铁、钙、钼、土壤水分呈正相关，与土壤多酚氧化酶、过氧化物酶、脱氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶呈负相关；根际土壤细菌与多酚氧化酶、过氧化物酶、脲酶、脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶呈正相关，与土壤pH、钾、磷、镁、钙、土壤水分呈负相关。总之，土壤理化性质对于瑞香狼毒根际土壤微生物真菌的影响较大，土壤酶活性对于瑞香狼毒根际土壤细菌的群落组成结构影响较大。
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