周晓雪1, 杨佳凡2,3, 李明哲4, 宋永相2,3, 鞠建华2,3, 李晓帆1, 王立岩1
1. 深圳大学生命与海洋科学学院 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室, 广东 深圳 518055;
2. 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301;
3. 中国科学院大学海洋学院, 北京 100049;
4. 华南农业大学材料与能源学院, 广东 广州 510642
收稿日期：2021-02-06；修回日期：2021-03-30；网络出版日期：2021-04-19
基金项目：深圳市科技计划(JCY20180305123659726)
*通信作者：王立岩.Tel: +86-755-26012653; E-mail: lwang@szu.edu.cn.
摘要：[目的] 本文以一株南海珊瑚来源的真菌Parengyodontium album SCSIO SX7W11为目标菌株，挖掘其生产聚酮类化合物的潜能。[方法] 本研究利用Illumina Miseq技术对SX7W11菌株进行全基因组扫描测序，运用生物信息学手段对其基因组的生物合成基因簇进行预测和基因功能注释，挖掘可能产生新颖聚酮化合物的基因簇。对SX7W11进行放大发酵后，利用正相色谱、中压反相色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、HPLC半制备等分离手段分离纯化出单体化合物。再利用高分辨质谱（HR-ESI-MS）、1H NMR、13C NMR、X-ray单晶衍射等波谱手段确定化合物的结构，并根据生物合成基因簇对化合物的生物合成途径进行推导。[结果] 全基因组扫描测序结果显示，P.album SCSIO SX7W11基因组大小为34.0 Mb，含有24个生物合成基因簇，包括6个聚酮合酶基因簇以及3个萜烯合酶基因簇。从发酵产物中分离鉴定到3个聚酮类化合物：emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3），其中化合物3获得了单晶结构数据。通过生物信息学方法从菌株基因组中定位到了sydowinin A的生物合成基因簇。结合文献对emodin（1）、alternaphenol B（2）和sydowinin A（3）的生物合成途径进行了分析。[结论] 本研究通过基因组挖掘及培养基优化，发现1株珊瑚来源的真菌P.album SCSIO SX7W11具有生产sydowinins类聚酮类化合物的能力，为该类化合物生物合成机制深入研究奠定了基础。
关键词：Parengyodontium album SCSIO SX7W11sydowinin A生物合成基因簇基因组海洋真菌
Discovery of polyketide natural products from corals derived fungi Parengyodontium album SCSIO SX7W11 and their biosynthetic pathway analysis
Xiaoxue Zhou1, Jiafan Yang2,3, Mingzhe Li4, Yongxiang Song2,3, Jianhua Ju2,3, Xiaofan Li1, Liyan Wang1
1. Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource and Eco-environmental Science, College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China;
2. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong Province, China;
3. College of Oceanology, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. College of Materials and Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong Province, China
Received: 6 February 2021; Revised: 30 March 2021; Published online: 19 April 2021
*Corresponding author: Wang Liyan.Tel: +86-755-26012653; E-mail: lwang@szu.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Shenzhen Municipal Science and Technology Project (JCY20180305123659726)
Abstract: [Objective] In this study, we investigated Parengyodontium album SCSIO SX7W11, a marine fungus derived from South China Sea corals for the potential of producing polyketides. [Methods] We sequenced the whole genome of strain SX7W11 using Illumina Miseq. The polyketide biosynthetic gene clusters were then predicted and the functions of open reading frames (ORFs) were annotated. Normal phase chromatography, reversed-phase chromatography, Sephadex LH-20 chromatography, and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) were conducted for the isolation and purification of natural products. The purified compounds were characterized by high resolution mass spectrometry (HR-ESI-MS), 1H NMR, 13C NMR and X-ray data and the biosynthetic pathways were deduced. [Results] The whole genome scanning and sequencing results showed that the genome length of SX7W11 is 34.0 Mb, containing 24 biosynthetic gene clusters. Three polyketides were identified as emodin (1), alternaphenol B (2), and sydowinin A (3). The crystal data of sydowinin A was obtained. The biosynthetic gene cluster of sydowinin A was localized from SX7W11 genome by bioinformatics analysis. The biosynthetic pathway was then proposed. [Conclusion] Through genome mining and medium optimization, P. album SCSIO SX7W11, a coral derived fungus, has shown the potential to produce sydowinin type polyketides. This work laid a foundation for the biosynthesis study of sydowinin.
Keywords: Parengyodontium album SCSIO SX7W11sydowinin Abiosynthetic gene clustergenomemarine fungi
天然产物是新药开发的重要来源之一，在过去的一个世纪里，对陆生生物的天然产物研究已相对饱和，人们将目标转移至与陆生生物生态环境迥然不同的海洋生物。目前美国、欧盟、澳大利亚以及日本的药品监督管理机构先后批准了18种来自海洋生物的药物上市，临床广泛应用于抗肿瘤、抗病毒和抗菌等方面[1-2]。海洋真菌是重要的海洋活性天然产物的来源，1964年从顶头孢霉菌(Cephalosporium acremoium)中分离得到的头孢菌素C (cephalosporin C)成功上市，成为具有划时代意义的海洋真菌来源药物[3]。但是直到19世纪80年代，人们才真正开始意识到海洋真菌来源天然产物的化学多样性以及由此带来的成药潜力，海洋真菌来源天然产物的研究进入快车道。根据Carroll等发表在Natural Product Reports的统计分析，截止至2018年，海洋真菌来源(不包括红树林来源)的新化合物总数已达4708个，成为海洋天然产物第二大主体。仅2018年就发现新化合物617个，比2017年增加38%[4]。
聚酮类化合物以其惊人的结构多样性在天然产物创新药物研究中占有重要的地位。众多明星药物如红霉素(大环内酯类)、制霉菌素(多烯类)、四环素(四环类)、莫能霉素(聚醚类)等都是由聚酮合酶经过生物合成产生。聚酮类化合物的研究主要集中于放线菌，近年来海洋真菌被证明是聚酮类化合物的又一重要来源。Jin等报道了2014–2017年海洋真菌来源的天然产物153个，其中聚酮类化合物占25.7%，仅次于生物碱(27.0%)，占主导地位。此外，萜、内酯和甾体的含量分别为9.9%、3.9%和3.3%[5]。
随着基因组测序和生物信息学的快速发展，研究海洋真菌的代谢产物拥有越来越多的手段[6]。目前挖掘菌株的代谢产物最常用的有4种策略：(1) 传统的生物活性指导分离化合物；(2) 菌株培养条件的变化；(3) 基于代谢组学的分析；(4) 基于基因组中生物合成基因簇的分析[7]。其中由于测序技术的发展，基于基因组的代谢产物发现策略越来越受到重视。
近期，我们从南沙群岛海域的珊瑚中分离得到1株海洋真菌，命名为SCSIO SX7W11。经ITS序列分析鉴定为Parengyodontium album。本研究利用Illumina Miseq技术对SCSIO SX7W11菌株进行全基因组扫描测序，并对其进行生物信息学分析，发现该菌株基因组中具有6个聚酮合酶基因簇以及3个萜烯合酶基因簇，其中4个聚酮合酶基因簇未能找到相似序列，有可能编码新颖结构的聚酮类化合物。我们对P. album SCSIO SX7W11进行初步的培养基优化后，选取次级代谢产物更为丰富的大米培养基和PDB液体培养基进行放大发酵，最终分离到3个聚酮类化合物(1–3，结构见图 1)。结合质谱、1H NMR、13C NMR、X-ray单晶衍射等相关数据，确定化合物1、2、3分别为alternaphenol B、emodin和sydowinin A。化合物1–3同属一条生物合成途径，本研究也对其相关的生物合成途径进行了推导和预测分析。
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| 图 1 化合物1–3的化学结构式(A)与化合物3的单晶结构(B) Figure 1 Chemical structures of compound 1–3 (A) and crystal structure of compound 3 (B). |
| 图选项 |
1 材料和方法 1.1 菌株信息 菌株SCSIO SX7W11分离自南沙群岛海域的鹿角珊瑚(Acropora sp.)(图 2)。菌株分离纯化后通过ITS基因序列比对鉴定为Parengyodontium album，菌种保存于中国科学院南海海洋研究所菌种保藏库。
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| 图 2 鹿角珊瑚(A)和菌株SCSIO SX7W11在PDA培养基上的形态图(B) Figure 2 Acropora sp. (A) and phenotype of SCSIO SX7W11 on PDA medium plate (B). |
| 图选项 |
1.2 仪器和试剂
1.2.1 培养基: (1) 提取真菌DNA培养基：YG：酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，trace element 400 μL/L (Trace element 100 mL：ZnSO4?7H2O 2.2 g，H3BO3 1.10 g，MnCl2?4H2O 0.50 g，FeSO4?7H2O 0.16 g，CoCl2?5H2O 0.16 g，CuSO4?5H2O 0.16 g，(NH4)6Mo7O24?4H2O 0.11 g)，pH 7.0。
(2) 固体发酵种子培养基：YG固体培养基：酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，trace element 400 μL/L，pH 7.0。
(3) 液体发酵种子培养基：PDB：马铃薯浸出粉300 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 7.0。
(4) 固体放大发酵培养基：大米培养基：直径为15 cm玻璃平皿内放入10 mL大米，20 mL海水(0.3% 海盐)，pH 7.0。
(5) 液体放大发酵培养基：PDB：同种子培养基。
以上培养基均1×105 Pa灭菌30 min，冷却后备用。
1.2.2 实验仪器及试剂: PCR扩增仪(Thermo Fisher Scientific ABI Veriti 96 well型，德国Thermo Fisher Scientific公司)；多功能组合式摇床(HYG-C，太仓实验设备厂)；超导核磁共振仪(Bruker AVANCE 700M型，德国Bruker公司)；高分辨飞行时间质谱(Bruker maXis，德国Bruker公司)；柱色谱硅胶(100–200目，烟台江友硅胶开发有限公司)，硅胶薄层板(HS-GF 254，烟台江友硅胶开发有限公司)；单晶衍射仪(XtaLAB PRO MM007HF型，日本理学株式会社)；高效液相色谱仪(Agilent 1260，美国Agilent公司)；半制备高效液相色谱仪(Hitachi Primaide，日本日立公司)；色谱柱(Thermo C18，250 mm×10 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；培养箱(MJ01，湖北黄石恒丰医疗器械有限公司)。试剂：色谱纯乙腈(安徽时联公司)；其他试剂均为国产分析纯(广州化学试剂厂)。
1.3 SCSIO SX7W11菌种鉴定
1.3.1 gDNA的制备: 用YG固体培养基将25%甘油管保存的菌株P. album SCSIO SX7W11复苏，将单克隆转接到新的YG固体培养基，28 ℃培养3–4 d。取少量真菌菌丝于1.5 mL离心管。再加100 μL玻璃珠(直径0.5–1.0 mm)和700 μL LETS buffer于离心管中，振荡10 min。振荡完毕后14000 r/min离心5 min，取上清(内含gDNA) 500 μL，加入等体积的Tris酚/氯仿/异丙醇(25︰24︰1)，振荡混合10 min，14000 r/min离心5 min。取上清400 μL，加1 mL异丙醇手动颠倒混合约2 min。14000 r/min离心10 min。弃去上清后再离心30 s，将剩余上清吸尽弃去，剩余沉淀为gDNA。加40 μL 1×TE或dd H2O至EP管底部溶解。
1.3.2 SCSIO SX7W11 ITS的PCR扩增与测序: 对已提取的总DNA使用真菌通用引物ITS1 (5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?)、ITS4 (5?-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3?)和FastPfu高保真聚合酶进行18S rDNA扩增，50 μL反应体系为：ddH2O 31 μL，dNTPs 5 μL，5×FastPfu buffer 10 μL，FastPfu Enzyme 1 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，gDNA 1 μL。PCR程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，4 ℃保温。PCR产物由广州擎科生物技术有限公司回收纯化，完成测序。
1.3.3 系统发育分析: 将测序得到的序列结果进行校对拼接后，登录GenBank通过BLAST进行同源性序列比对，选择同源性较高且具有代表性的真菌作为参考序列，下载相应菌株的序列和信息，以Engyodontium parvisporum (LC425558.1)作为外群菌株，所有包含空白和缺失数据的位置都被消除，经bootstrap试验[8]后，相关类群聚集在一起的百分比(1000次重复)显示在分支旁边的进化枝上。使用MEGA 7[9]以邻接法(Neighbor-Joining，NJ)对供试菌株进行多序列比对[10]，构建ITS碱基序列系统发育树。
1.4 SCSIO SX7W11的菌体制备与基因组扫描测序 从平板中挑取部分单克隆菌株接种至YG液体培养基(50 mL)中，摇床培养2 d (28 ℃，200 r/min)，待摇瓶内累积一定菌体量后，在无菌条件下转移至离心管离心(4000 r/min，10 min)，倒去上清获得菌体。菌体委托上海凌恩生物科技有限公司进行基因组扫描测序。
1.5 基因组的生物信息学分析 将基因组扫描测序结果上传至antiSMASH V5.2.0在线分析网站(网址为：https://fungismash.secondarymetabolites.org/)和2nd find(http://biosyn.nih.go.jp/2ndfind/)，对基因组编码的次生代谢产物类型进行预测分析，结合NCBI数据库，利用BLAST (v2.2.23)软件对菌株基因组中的核苷酸和蛋白质序列进行比对注释，预测相关基因的功能。
1.6 P.album SCSIO SX7W11的发酵与萃取 选取大米培养基和PDB培养基进行放大发酵，大米培养基150 mm培养皿培养100板，收菌后加丁酮提取3次。粗提物加等量水混悬，用丁酮萃取获得丁醇层提取物(M)。液体发酵将孢子接入种子培养基(50 mL)发酵48 h，种子成熟后转入发酵培养(200 mL×100)发酵7 d，菌液用丁酮萃取3次，减压浓缩得到粗提物(L)。
1.7 化合物分离与鉴定 将大米培养基M提取物经正相硅胶柱(4 cm× 17 cm，100目)分离，氯仿/甲醇体系梯度洗脱(100/0, 98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 9/1, 8/2, 1/1)，得到Fr.MA1–Fr.MA10共10个馏分。将Fr.MA4–Fr.MA6合并过MPLC柱(ODS自装色谱柱，10 cm×3 cm，40–60 μm)分离，采用乙腈/水体系(A相：1‰ CH3COOH/ H2O B相：1‰ CH3COOH/CH3CN 0– 10 min 0% B-20% B；10–70 min 20%B–80%B；70–90 min 80% B–100% B；90–120 min 100%B)；流速10 mL/min，检测波长254 nm以及280 nm，得到Fr.E1–Fr.E13共13个馏分。将Fr.E8以Thermo C18色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm)进一步分离。采用乙腈/水体系(A相：1‰ CH3COOH/H2O，B相：1‰ CH3COOH/CH3CN，以40% B等梯度洗脱，流速2.5 mL/min，得到化合物1 (TR=18.2 min，5 mg)。将Fr.MA1过硅胶柱(3 cm×20 cm，100目)，以石油醚/氯仿(100/0, 50/50)以及氯仿/甲醇(100/0, 95/5, 9/1, 85/15, 8/2, 75/25, 7/3, 65/35, 6/4, 4/6)进行梯度洗脱，得到Fr.MB1-Fr.MB10共10个馏分。Fr.MB4和Fr.MB5合并，经中压反相制备色谱MPLC柱(以ODS自装色谱柱10 cm×3 cm，40– 60 μm)分离，采用乙腈/水(A相：1‰ CH3COOH/ H2O，B相：1‰ CH3COOH/CH3CN 0–60 min 30% B–100%B；60–90 min 100%B)梯度洗脱120 min，流速10 mL/min，检测波长254 nm，以及280 nm，得到Fr.MC1–Fr.MC13共13个馏分。将Fr.MC4过硅胶柱(4 cm×17 cm，100目)，以氯仿/甲醇梯度(100/0, 98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 9/1)洗脱，分离纯化得到化合物2 (58.1 mg)。将PDB培养基粗提物L经正相硅胶柱(4 cm×17 cm，100目)分离，氯仿/甲醇体系梯度(100/0, 98/2, 96/4, 94/6, 92/8, 9/1, 7/3, 8/2, 1/1)洗脱，得到Fr.LA1–Fr.LA11共11个馏分。将Fr.LA9组分通过重结晶法，纯化得到化合物3(6.1 mg)。化合物1、2通过高分辨质谱(HR-ESI-MS)、1H NMR、13C NMR等波谱手段确定结构，化合物3通过X-ray单晶衍射确定结构。
2 结果和分析 2.1 SCSIO SX7W11的鉴定及系统发育分析 SCSIO SX7W11菌株在PDA培养基平板上菌丝呈现白色至米白色，菌落表面呈棉絮状，蔓延性弱(图 2)。将SCSIO SX7W11的ITS测序结果上传GenBank数据库，获得序列号：MW559477，再与GenBank中的序列进行系统发育分析(图 3)，发现SCSIO SX7W11的ITS序列与Parengyodontium album (LR778170.1)的相似性最高，以100%可信度聚在一个分支。综合以上分析结果，将SCSIO SX7W11鉴定为Parengyodontium album。
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| 图 3 SCSIO SX7W11 ITS碱基序列聚类分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of ITS sequence of SCSIO SX7W11. Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; numbers at the nodes indicate the level of bootstrap values based on 1000 replications; the scale bar indicates 0.10 substitutions per nucleotide position; Engyodontium parvisporum LC425558.1 is outgroup. |
| 图选项 |
2.2 P.album SCSIO SX7W11的基因组扫描测序与组装 P. album SCSIO SX7W11委托上海凌恩生物科技有限公司进行基因组扫描测序。测序结果显示，K-mer预估P. album SCSIO SX7W11基因组大小为34.0 Mb，GC含量为50.84%。将数据组装成Scaffold后，统计数据结果表明，该组装基因组一共有345个Scaffold，大于1 kb的有317个。预测编码9135个基因，编码基因平均长度为1521 bp。编码区域长度占基因组44.49%。基因组包含125个非编码RNA(ncRNA)，其中104个为tRNA，19个5S rRNA，1个18S rRNA，1个28S rRNA。在重复元件中，散在重复序列共3342个，串联重复序列共5748个。
2.3 基因组数据分析 利用antiSMASH (v5.0.0)和2nd find在线软件对P. album SCSIO SX7W11基因组测序结果进行分析，预测其基因簇编码的次生代谢产物类型。P. album SCSIO SX7W11的基因组中包含24个生物合成基因簇，其中包括6个聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)基因簇，6个非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)基因簇，5个NRPS-like基因簇，3个萜烯合酶(terpene synthase, TPS)基因簇，4个(PKS-NRPS)杂合型基因簇。进一步比对发现24个基因簇中有10个基因簇与已知基因簇序列相似(表 1)。而6个聚酮基因簇与已知基因簇的相似度都很低，仅cluster 7和cluster 18与已知基因簇分别有20%与47%的相似度，剩下4个聚酮基因簇均为未知基因簇。上述结果表明P. album SCSIO SX7W11菌株具有合成新型聚酮类化合物的潜力，值得对其产生的聚酮类化合物进行挖掘。
表 1. P. album SCSIO SX7W11菌株antiSMASH (v5.0.0)分析结果 Table 1. The analysis of P. album SCSIO SX7W11 by antiSMASH (v5.0.0)
| Number | Cluster type | Query length/bp | Similarity/% | Compounds encoded by similar cluster |
| Cluster 5 | Terpene | 21571 | 40 | Squalestatin S1 |
| Cluster 7 | T1PKS | 47332 | 20 | 4-epi-15-epi-brefeldin A |
| Cluster 8 | NRPS | 49171 | 100 | Dimethylcoprogen |
| Cluster 9 | PKS-NRPS | 51865 | 100 | Pyranonigrin E |
| Cluster 12 | NRPS | 38032 | 71 | Cephalosporin C |
| Cluster 15 | NRPS-like | 42259 | 100 | eq-4 |
| Cluster 17 | NRPS-like, T1PKS | 51702 | 22 | Burnettramic acid A |
| Cluster 18 | T1PKS | 43723 | 47 | Neosartorin |
| Cluster 19 | Terpene | 22876 | 100 | Clavaric acid |
| Cluster 20 | PKS-NRPS | 37941 | 50 | Curvupallide-B |
表选项
2.4 化合物结构鉴定
2.4.1 发酵结果: 通过大米固体培养基发酵分离得到emodin (1)和alternaphenol B (2)。通过PDB液体发酵分离得到sydowinin A (3)。
2.4.2 化合物结构鉴定: 化合物1：橙黄色针状结晶；(–)HR-ESI-MS呈现[M-H]–(m/z 269.0455)峰以及[2M-H]–(m/z 539.0988)峰，确定其分子式为C15H11O5，其核磁数据为：1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) δH: 12.95 (2H, b, 1-OH/8-OH), 7.46 (1H, d, J=1.2 Hz, H-4), 7.13 (1H, d, J=2 Hz, H-5), 7.01 (1H, d, J=1.2 Hz, H-5), 6.39 (1H, d, J=2 Hz, H-7), 2.40 (3H, s, 3-CH3)。13C NMR (DMSO-d6, 700 MHz) δC: 161.7 (C-1), 124.4 (C-2), 147.8 (C-3), 120.6 (C-4), 133.4 (C-4a), 108.4 (C-5), 165.4 (C-6), 107.6 (C-7), 163.2 (C-8), 111.8 (C-8a), 188.3 (C-9), 114.2 (C-9a), 182.6 (C10), 135.3 (C-10a), 21.9(3-CH3)。以上数据与文献报道emodin的核磁波谱数据一致[11]，确定化合物1为emodin。
化合物2：无色针状结晶；(+)HR-ESI-MS呈现[M+H]+(m/z 271.2421)峰以及[M+Na]+(m/z 293.0421)结合13C NMR确定其分子式为：C15H10O5。其核磁数据为：1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) δH: 6.68 (1H, brs, H-2), 6.91 (1H, brs, H-4), 7.68 (1H, dd, J = 8.5, 1.0 Hz, H-10), 7.91 (1H, dd, J= 8.5, 7.3 Hz, H-11), 7.40 (1H, dd, J = 7.3, 1.0 Hz, H-12), 2.40 (3H, s, H-3-Me), 12.16 (1H, s, H-OH)。13C NMR (DMSO-d6, 700 MHz) δC: 160.9 (C-1), 108.0 (C-2), 150.0 (C-3), 111.7 (C-4), 133.4 (C-4a), 155.7 (C-5), 106.8 (C-6), 180.6 (C-7), 116.5 (C-8), 155.9 (C-9), 119.2 (C10), 135.6 (C-11), 122.9 (C-12), 134.4 (C-13), 170.1 (C-14), 21.9 (C-3-Me)。以上数据与文献报道alternaphenol B的核磁波谱数据一致[12]，确定化合物2为alternaphenol B。
化合物3：单斜晶系，P21空间群，晶体大小为0.4 mm×0.1 mm×0.1 mm；晶胞参数：a=7.554 9 (1) ?, b=15.5568 (2) ?, c=10.4880 (1) ?, α= 90.00 °, β=104.645(1)°, γ=90.00°, 晶胞体积V=1192.61(3) ?3, Z=4, 计算密度1.5941 g/cm3，Cu-Kα辐射(λ=1.54184 ?)；收集总衍射点5498，独立衍射点2106；R1=0.0468，wR2=0.1282。晶体数据保存在剑桥晶体数据中心，CCDC编号为2058820。
2.5 Sydowinin A生物合成基因簇的定位与对比分析
2.5.1 Sydowinin A与monodictyphenone的生物合成基因簇的对比: sydowinin A (3)为PKS-NPRS杂合类化合物balanol[13]的前体，比对分析后推测P. album SCSIO SX7W11 cluster 18负责sydowinin A (3)的生物合成，cluster 18的基因与文献报导的monodictyphenone生物合成基因簇[14]相似度较高，sydowinin A (3)与monodictyphenone的化学结构式与生物合成基因簇对比图见图 4。
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| 图 4 Sydowinin A (3)与monodictyphenone的化学结构式(A)与生物合成基因簇结构对比图(B) Figure 4 Chemical structure of sydowinin A (3) and monodictyphenone (A) and the comparison of gene structure between the P. album SCSIO SX7W11 gene cluster and monodictyphenone gene cluster (B). |
| 图选项 |
2.5.2 基因簇cluster 18 ORFs的功能注释: P. album SCSIO SX7W11 cluster 18定位于染色体DNA的1–43723 bp，共包含17个基因。在NCBI数据库内利用BLAST (v2.2.23)对P. album SCSIO SX7W11 cluster 18的各基因进行比对注释，具体注释结果见表 2。
表 2. P. album SCSIO SX7W11基因簇cluster 18与monodictyphenone生物合成基因簇比对结果 Table 2. The gene comparison results of P. album SCSIO SX7W11 cluster 18 and monodictyphenone biosynthesis gene cluster
| Syd proteins | Sizea | ID/SI (%) | Mdp Proteins | Sizea | Proposed function | Homolog | |
| Syd1 | 1525 | 25/43 | Putative protein | Nicotiana tabacum | P10978.1 | ||
| Syd2 | 1246 | 50/64 | Putative FAD-dependent monooxygenase | Claviceps purpurea 20.1 | M1W850.1 | ||
| Syd3 | 264 | 73/87 | MdpC | 265 | Putative short chain dehydrogenase | Aspergillus nidulans FGSC A4 | Q5BH34.1 |
| Syd4 | 166 | 51/69 | MdpB | 214 | Putative dehydratase | Aspergillus nidulans FGSC A4 | C8VQ71.1 |
| Syd5 | 287 | 35/52 | Putative oxidoreductase | Methylorubrum extorquens AM1 | Q49117.2 | ||
| Syd6 | 331 | 67/79 | Putative ACP thioesterase | Aspergillus fumigatus Af293 | Q4WQZ6.1 | ||
| Syd7 | 1798 | 63/77 | MdpG | 1746 | Carboxylic acid synthase Agn pks1 | Paecilomyces divaricatus | A0A411PQP9.1 |
| Syd8 | 499 | 29/44 | Putative transcriptional activator | Aspergillus sp. MF297-2 | E1ACQ7.1 | ||
| Syd9 | 823 | 35/53 | MdpA | 479 | Putative transcriptional coactivator | Aspergillus nidulans FGSC A4 | C8VQ72.1 |
| Syd10 | 453 | 23/40 | Putative acetyltransferase | Saccharomyces cerevisiae S288C | Q12226.1 | ||
| Syd11 | 149 | 28/42 | Putative tRNA ligase | Pyrococcus abyssi GE5 | Q9V176.1 | ||
| Syd12 | 524 | 40/60 | Putative P450 monooxygenase | Passalora fulva | P0CU70.1 | ||
| Syd13 | 481 | 40/58 | MdpL | 446 | Putative Baeyer-Villiger oxidase | Aspergillus nidulans FGSCA4 | C8VQ61.1 |
| Syd14 | 273 | 53/71 | MdpK | 265 | Putative oxidoreductase | Aspergillus nidulans FGSCA4 | C8VQ62.1 |
| Syd15 | 158 | 44/61 | Putative monooxygenase | Pestalotiopsis fici W106-1 | A0A067XNI6.1 | ||
| Syd16 | 251 | 52/65 | Putative epimerase | Saccharomyces cerevisiae S288C | P46969.1 | ||
| Syd17 | 133 | 38/53 | Putative protein | Aspergillus fumigatus Af293 | Q4WNE1.1 | ||
| a: size in units of amino acids (aa); ID/SI: identity/similarity. | |||||||
表选项
2.5.3 Sydowinin A生物合成途径推导: 参考目前文献已报道的有关sydowinin A (3)的生物合成途径[13-14]，发现sydowinin A极有可能与化合物monodictyphenone具有相似的生物合成路径。结合菌株P. album SCSIO SX7W11基因簇中cluster 18的基因注释结果以及其前体化合物emodin (1)和alternaphenol B (2)，对sydowinin A (3)在菌株SX7W11中的生物合成途径进行了推导(图 5)。基因注释结果提示，P. album SCSIO SX7W11的cluster 18中包含8个可能直接参与sydowinin A生物合成的基因，包括syd3、syd4、syd6、syd7、syd12、syd13、syd14以及syd15。其中聚酮合酶Syd7以及ACP硫酯酶Syd6共同负责参与大黄素emodin (2)中三环蒽醌骨架的合成，短链脱氢酶Syd3负责大黄素emodin (2)中羟基的还原；脱水酶Syd4负责蒽醌类中间体(2b)的合成；氧化还原酶Syd14可能负责alternaphenol B(1)的生物合成；细胞色素P450单加氧酶Syd12负责中间体3b中C-9?位羧基的形成。终产物sydowinin A (3)的生物合成则推测可能是通过Baeyer-Villiger氧化酶Syd13或单加氧酶Syd15负责。具体的生物合成途径推测如图 5。
 |
| 图 5 P. album SCSIO SX7W11菌株中sydowinin A的生物合成途径 Figure 5 Putative biosynthetic pathway of sydowinin A in P. album SCSIO SX7W11. |
| 图选项 |
综上所述，sydowinin A (3)的八酮体聚酮骨架是由一个非还原型聚酮合酶Syd7催化形成的。即通过起始单元酰基转移酶(serine acetyltransferase，SAT)结构域、酮基合酶(ketosynthase，KS)结构域、酰基转移酶(acyltransferase，AT)结构域、酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)结构域的共同参与下，经过7轮链延伸形成八酮基-S-ACP链。再通过产物模板结构域(product templete，PT)将C6-C11，C4-C13以及C2-C15间环化形成大黄素骨架，最终在硫酯酶Syd6的催化下，经过脱水脱羧形成emodin (1)。在合成emodin (1)后，再通过短链脱氢酶的催化，将emodin还原为中间体2a，2a再通过脱水酶Syd4的催化下还原为蒽醌类中间体2b，最后在氧化酶Syd14催化下，通过Baeyer- Villiger氧化重排反应将蒽醌类中间体2b氧化为缩酚酸类化合物alternaphenol (2)。Alternaphenol (2)水解生成中间体3a，经过氧化酶Syd13或单加氧酶Syd15的作用脱水环化形成中间体3b，最后经细胞色素P450单加氧酶Syd12将3b的9?位的甲基羟化生成终产物sydowinin A (3)(图 5)。
3 讨论与结论 Sydowinins是Hamasaki等在1975年从一株Aspergillus Sydowi中首次发现的氧杂蒽酮类化合物[15]。sydowinin A对刀豆蛋白A(Con A)和磷酸酯多糖(LPS)诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖表现出中等的抑制活性(IC50分别为6.5和7.1 μmol/L)[16]。sydowinin A对人结肠癌细胞(HT-29)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)具有细胞毒性(IC50分别为124.3和117.8 μmol/L)，当sydowinin A与藻毒素okadaic acid混合后，在所有作用浓度水平下均对SH-SY5Y细胞表现出协同抑制作用，毒性显著高于单独化合物[17]。除此之外，sydowinin A对葡萄叶片也具有一定的植物毒性[18]。综上所述，sydowinin A具有丰富的生物活性，生物合成机制研究未见报道。因此系统阐述其生物合成途径对于深入开发sydowinin A具有较高的科学意义。
本研究通过对P. album SCSIO SX7W11进行聚酮类化合物的基因组挖掘，从一株珊瑚来源的真菌P. album SCSIO SX7W11中分离得到了emodin、alternaphenol B和sydowinin A 3个化合物，并第一次获得了sydowinin A的晶体学数据。通过生物信息学方法从菌株基因组中定位到了sydowinin A的生物合成基因簇，经生物信息学分析并结合文献对其生物合成途径进行了推测，为sydowinins类化合物的生物合成研究奠定了一定的基础。
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