孟繁凡1,2, 武瑶1,2, 时涛3, 黄贵修3
, 王莉1 1. 中国科学院微生物研究所, 植物基因组国家重点实验室, 北京 100101;
2. 中国科学院大学生命科学学院, 北京 100049;
3. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海南 海口 571101
收稿日期：2020-10-24；修回日期：2020-12-26；网络出版日期：2021-01-11
基金项目：国家重点研发计划（2018YFD0201109）；国家自然科学基金（31772123）
*通信作者：Tel: +86-10-64806124; Fax: +86-10-64858245; 黄贵修, E-mail: hgxiu@vip.163.com;
王莉, E-mail: jennywangli@im.ac.cn.
摘要：[目的] 研究地毯草黄单胞菌双组分系统VgrS-VgrR与致病性的关系，为木薯细菌性病害的高效防控提供分子生物学证据。[方法] 采用同源重组方法构建vgrS和vgrR的插入失活突变体，用可移动的cosmid载体pHM1构建互补菌株。检测突变体的致病性、细菌游动性、胞外酶、胞外多糖的变化，观察细菌对H2O2和金属离子胁迫的反应。[结果] 相比野生型菌株，vgrS和vgrR突变体接种寄主植物木薯后致病力显著降低，突变体的游动性减少、蛋白酶活性减弱、H2O2耐受性降低，在高浓度金属离子Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的胁迫条件下菌体生长显著减弱。然而，vgrS和vgrR突变体的胞外多糖含量显著升高，分别是野生型的2.14和1.89倍。[结论] 阐明了VgrS-VgrR系统在细菌致病过程中发挥的重要作用，为鉴定VgrS-VgrR调控机制提供线索，为药物筛选提供靶向目标。
关键词：地毯草黄单胞菌双组分系统突变体表型筛选
Gene deletion and phenotype observation of two-component system VgrS-VgrR in Xanthomonas axonopodis pv. manihotis
Fanfan Meng1,2, Yao Wu1,2, Tao Shi3, Guixiu Huang3
, Li Wang1 1. State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2. School of Biological Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, Hainan Province, China
Received: 24 October 2020; Revised: 26 December 2020; Published online: 11 January 2021
*Corresponding author: Tel: +86-10-64806124; Fax: +86-10-64858245; Guixiu Huang, E-mail: hgxiu@vip.163.com;
Li Wang, E-mail: jennywangli@im.ac.cn.
Foundation item: Supported by the National Key Research and Development Project (2018YFD0201109) and by the National Natural Science Foundation of China (31772123)
Abstract: [Objective] In this study, we investigated the relationship between the VgrS-VgrR two-component system (TCS) of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) and the bacterial pathogenicity. The study can provide molecular biological evidence for the effective prevention and control of cassava bacterial blight. [Methods] We constructed the insertion-inactivation mutants of vgrS and vgrR by homologous recombination, and constructed the complementary strains of each mutant by using the mobile cosmid vector pHM1. The study measured the pathogenicity of each mutant, its swimming and the changing in extracellular enzyme and extracellular polysaccharide production. We also observed the bacterial response to hydrogen peroxide and metal ion stress. [Results] Compared with wild-type strain, both vgrS and vgrR mutants exhibited significantly reduced pathogenicity after inoculation of the host plant cassava. Both mutants exhibited decreased swimming, reduced protease activity and hydrogen peroxide tolerance. Under the stress conditions of high concentrations of metal ions Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Zn2+ and Cu2+, the mutants' growth were also significantly decreased. However, the extracellular polysaccharide content of vgrS and vgrR mutants increased dramatically, which was 2.14 and 1.89 times that of the wild type, respectively. [Conclusion] The results clarified the important role of the VgrS-VgrR TCS in the pathogenesis of Xam, and provided clues for further research on the regulation mechanism of VgrS-VgrR and drug screening targeting Xam.
Keywords: Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)two-component systemmutantsphenotype screening
由地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，Xam)引起的细菌性萎蔫病是一种世界性病害，严重影响木薯产量，甚至可造成毁种绝收[1]。该病是乌干达木薯产区发生面积最大的病害[2]，2012年对我国广东湛江和广西贵港近400 hm2的木薯种植区造成极大危害，2015年4月贵港地区苗期发病面积达20 hm2[3]。截止2020年11月的入侵物种纲要数据库(Invasive Species Compendium，CABI)显示，该病依然是威胁广东、广西、海南和云南等地区木薯产量的主要病害[4]。
双组分系统(two-component system，TCS)是原核生物感应外界环境刺激调控目标基因表达的主要调控元件[5-6]。该系统在感应外界环境刺激下，调节细菌毒力因子、Ⅲ型分泌系统、胞外酶、胞外多糖、生物膜形成等[7]。2012年，加州大学伯克利分校完成了来自巴西、哥伦比亚、乌干达、印度尼西亚等地65株Xam的全基因组测序工作，并系统分析了Ⅲ型分泌系统效应子在致病过程中的作用[8]。其中，效应子TALE1作为一个关键致病因子，能够被寄主木薯诱导表达[9]；TALE20作为糖类转运体MeSWEET10的激活子，能够促进Xam 668的毒性[10]。进一步全面筛选Ⅲ型分泌系统效应子的功能，发现9个效应蛋白在细菌毒力和植物免疫中发挥了重要作用，其中效应蛋白XopZ、XopX、XopAO1和AvrBs2的缺失突变体完全丧失了对寄主植物的致病性[11]。除效应蛋白，研究显示Xam产生的胞外淀粉酶也可以作为致病生化因子[12]。2013年，中国热带农业科学院环境与植物保护研究所在完成了Xam小种GX11的全基因组测序工作基础上，构建了Tn5插入失活突变体库[13]。随机挑取Tn5转化子，筛选并验证了Ⅲ型分泌系统调节子HrpX、HrpG以及精氨琥珀酸裂解酶Xam_asl是细菌致病过程中的重要因子[14-15]。以上研究都集中在II和Ⅲ型效应子对细菌毒力的作用，然而对于其他毒力因子和调控元件在Xam中的作用，特别是与野油菜黄单胞菌(X. campestris pv. Campestris，Xcc)、水稻黄单胞菌(X. oryzae pv. Oryzae，Xoo)相比，包括双组分系统在内的调控元件在Xam中的致病机理还有待进一步挖掘。
到目前为止，黄单胞菌属(Xanthomonas)中经活性和调控功能验证的TCS蛋白有19个，分别是RpfC-RpfG、RavS-RavA-RavR、VgrS-VgrR、PhoQ-PhoP、RaxH-RaxR、HpaS-HrpG、SreK-SreR- SreS、PcrK-PcrR和VemR[16-20]。其中VgrS-VgrR是一组控制细菌毒力的典型调控子。vgrS和vgrR突变后，Xcc的致病力、胞外多糖与脂多糖合成、胞外蛋白酶活性、细菌生长速度等均明显下降[16]。Xoo中的vgrS和vgrR突变后，也分别造成水稻(IR24)的致病力下降和丧失[21]。此外，VgrS-VgrR还特异性地调控Xcc在非寄主植物辣椒上的过敏反应，影响细菌Ⅲ型分泌系统hrcC和hrcE操纵子的表达[22]。在柑桔溃疡病黄单胞菌(X. citri pv. citri)中，VgrS-VgrR被证明影响细菌Ⅲ型分泌系统基因hrpD6、hpaF、O-抗原合成相关基因rfbC和过氧化物酶基因katE的转录[23]。研究显示，VgrS作为组氨酸激酶能够直接感应来自外界环境中Fe离子的变化，调节细菌体内Fe的平衡[24]。由此可见，VgrS-VgrR是一个在多种黄单胞菌中调控致病力的关键TCS。
本文在Xam小种GX08基因组中搜索到与Xcc和Xoo的vgrR-vgrS遗传位点同源的基因，命名为vgrRXam和vgrSXam。通过同源重组的方法获得vgrRXam和vgrSXam插入失活突变体，表型分析结果证实了该VgrS-VgrR系统与致病性的关系，研究将为木薯细菌性病害的高效定向防控提供可供选择的靶标。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒: 地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种Xam GX08、重组质粒pK18mob、互补载体pHM1以及大肠杆菌DH5α菌株皆为本实验室保存。EZ-T载体购自GenStar生物科技有限公司。抗生素工作浓度为：氨苄青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，壮观霉素150 μg/mL。实验过程中的质粒和菌株见表 1，所需引物见表 2。
表 1. 菌株及质粒 Table 1. Strains and plasmids in this study
| Strains/Plasmids | Genotype or description | Resources |
| Strains | ||
| ??DH5α | fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 | Lab collection |
| ??Xam GX08 | Xanthomonas axonopodis pv. manihotis GX08 | Lab collection |
| ??ΔvgrS | Insertional mutant of vgrS, KanR | This study |
| ??ΔvgrR | Insertional mutant of vgrR, KanR | This study |
| ??ΔvgrS-pHM1 | ΔvgrS strain containing a blank pHM1 vector, SpR | This study |
| ??ΔvgrR-pHM1 | ΔvgrR strain containing a blank pHM1 vector, SpR | This study |
| ??ΔvgrS-vgrS | Genetic complementary strain of vgrS mutant which contains a vector of pHM1:: vgrS, SpR | This study |
| ??ΔvgrR-vgrR | Genetic complementary strain of vgrR mutant which contains a vector of pHM1:: vgrR, SpR | This study |
| Plasmids | ||
| ??pK18mob | Suicide plasmid for Xam, KanR | Lab collection |
| ??pHM1 | Broad-host-range cos IncW derivative of pRI40, SpR | Lab collection |
| ??pK18-vgrS | Recombinant suicide vector for constructing vgrS insertion inactivation mutant, KanR | This study |
| ??pK18-vgrR | Recombinant suicide vector for constructing vgrR insertion inactivation mutant, kanR | This study |
| ??pHM1-vgrS | Recombinant vector for genetic complementation of vgrS mutant, SpR | This study |
| ??pHM1-vgrR | Recombinant vector for genetic complementation of vgrR mutant, SpR | This study |
表选项
表 2. 本研究所用引物 Table 2. Primers used in this study
| Primer name | Sequence (5′→3′) | Enzyme |
| VgrR-F | GAATTCGGACCGGGGCCACACTGT | EcoR Ⅰ |
| VgrR-R | AAGCTTCGCACTTCCAGCGTATCCA | Hind Ⅲ |
| VgrS-F | GAATTCGGTGTTGGTATTCAGCGGGTT | EcoR Ⅰ |
| VgrS-R | AAGCTTCGCTCGTTACGCGAGAGCA | Hind Ⅲ |
| pcom-VR-F | AAGCTTGTGCGAATTCTAGTAATTGAAGATAAC | Hind Ⅲ |
| pcom-VR-R | GAGCTCTCAGGCATCGGGCGAGGC | Sac Ⅰ |
| pcom-VS-F | GTCGACATGAATCGCAACATCGACGCCTT | Sal Ⅰ |
| pcom-VS-R | GAGCTCTCAGCGATGGAAGGCCA | Sac Ⅰ |
| VS-up-F | GAATTCCCCCGGTGTTGATGCTGA | Paired with M13F |
| VS-down-R | AAGCTTCGCACGGACAACGGCAA | Paired with M13R |
| VR-up-F | AAGCTTTGGTGCTGGAGGTCAACTCGA | Paired with M13F |
| VR-down-R | GAATTCGCAGCCAGTGGCTTGGGTT | Paired with M13R |
表选项
1.1.2 生化试剂及培养基: 限制性内切酶购自Thermo Scientific公司，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自康为世纪生物科技有限公司。氨苄青霉素、卡那霉素购自Sigma公司，壮观霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公司。质粒纯化和胶回收试剂盒购自博迈德基因技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯，购自北京化工厂。大肠杆菌用LB培养基37 ℃培养，Xam用NYG培养基28 ℃培养，胞外多糖含量测定用TGM培养基(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，2%甘油，1%葡萄糖，0.07% K2HPO4，0.025% MgSO4 ·7H2O)。
1.2 vgrS和vgrR插入失活菌株的构建 以Xam GX08基因组DNA为模板，VgrS-F/ VgrS-R和VgrR-F/VgrR-R为引物扩增基因内部分片段。PCR产物连接EZ-T载体测序，酶切后连接pK18mob载体，分别得到重组质粒pK18- vgrS和pK18-vgrR。重组质粒电击转化Xam感受态细胞，在50 μg/mL卡那霉素的NYG培养基上筛选并PCR鉴定阳性克隆。鉴定引物分别为M13F/VS-up-F、VS-down-R/M13R和M13F/VR- up-F、VR-down-R/M13R。引物VS-up-F和VS- down-R是vgrS基因编码区以外的上下游序列，VR-up-F和VR-down-R是vgrR基因编码区外的上下游序列，M13F和M13R为载体序列。载体引物和基因组引物配对扩增时，单交换重组子可以扩增到特异片段，分别为1389、1566、1264、1258 bp，野生型菌株没有相应扩增产物。
1.3 互补菌株的构建 以Xam GX08基因组DNA为模板，pcom- VS-F/pcom-VS-R和pcom-VR-F/pcom-VR-R为引物扩增全基因片段。PCR产物连接EZ-T载体测序，酶切后连接pHM1，分别得到互补质粒pHM1-vgrS和pHM1-vgrR。互补质粒分别电击转化vgrS和vgrR突变体感受态细胞，在含150 μg/mL壮观霉素的NYG培养基上筛选并PCR鉴定阳性克隆。
1.4 Xam致病力检测 挑取野生型、突变体菌株单菌落于5 mL含不同抗生素的NYG液体培养基中，28 ℃摇床培养16 h以上，使之达到对数生长后期。离心收集菌体，10 mmol/L MgCl2清洗2次去除抗生素并重悬至OD600=0.4。灭菌剪刀沾取菌液沿木薯叶片横向剪掉叶尖约1 cm大小的部分，28 ℃培养10 d观察病斑的长度。
1.5 胞外酶活性检测
1.5.1 纤维素酶活性检测: 不同菌株单克隆培养在含抗生素的NYG液体培养基，28 ℃培养过夜，离心收集菌体，灭菌ddH2O洗菌体2次，菌体重悬至OD600=0.4。取1 μL培养液点接于含0.5%羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC，Sigma)的NYG固体平板上，28 ℃培养48 h。加入20 mL 0.1%刚果红染色30 min，1 mol/L的NaCl洗2次，染色后在红色背景下可见一透明圈。野生型Xam和互补菌株作阳性对照。
1.5.2 淀粉酶活性检测: 将调OD600=0.4的不同待测菌株接种在含有0.1%可溶性淀粉的NYG固体平板上，28 ℃培养24 h；用I2/KI (0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI)溶液染色10 min。淀粉酶活性通过紫黑色背景下形成无色透明圈的大小来衡量。
1.5.3 蛋白酶活性检测: 将调OD600=0.4的不同待测菌株接种在终浓度为2%的脱脂奶粉NYG固体平板上，28 ℃培养48 h。能产生胞外蛋白酶的菌株在菌落周围形成一个水解脱脂奶粉的透明圈。
1.6 细菌游动性检测 单克隆细菌接种于5 mL含抗生素的NYG液体培养基中，28 ℃培养过夜，10000 r/min室温离心收集菌体，灭菌ddH2O清洗2次，菌体重悬至OD600=0.4。取2 μL点板到含0.3%琼脂糖的NYG半固体培养基上，28 ℃培养48–72 h，观察并测量菌落直径。
1.7 过氧化氢(H2O2) 耐受性分析 培养过夜的细菌用ddH2O清洗2次并重悬至OD600=0.4。加终浓度为10 mmol/L的H2O2，室温静置15 min，ddH2O清洗2次，重悬至原体积。细菌梯度稀释至4×104 CFU/mL，取100 μL涂NYG平板，28 ℃静置培养48 h，计算菌落数。
1.8 金属离子胁迫实验 培养过夜的细菌用ddH2O清洗2次并重悬至OD600=0.4，细菌稀释成5个梯度：4×108、4×107、4×106、4×105、4×104 CFU/mL。取1.5 μL稀释培养液分别点接于含2.5 mmol/L FeSO4+0.5 mmol/L抗坏血酸、1.5 mmol/L FeCl3、0.4 mmol/L CuSO4、0.4 mmol/L ZnSO4、0.3 mmol/L CoCl2和0.5 mmol/L NiSO4的NYG平板上，28 ℃静置培养2–3 d，观察菌体生长状况。
1.9 胞外多糖(EPS) 含量测定 挑取单菌落于5 mL NYG液体培养基中，28 ℃摇床培养过夜，取1 mL转接到40 mL TGM液体培养基，28 ℃、220 r/min培养96 h。4 ℃、25000×g离心45 min分离菌体，沉淀烘干为菌体干重。上清加入1/10体积的饱和KCl，等体积的无水乙醇，混匀，4 ℃沉淀过夜。4 ℃、25000×g离心30 min，用等体积95%乙醇洗2次，烘干得到多糖干重。胞外多糖含量为每克菌体干重包含的多糖干重量[25-26]。
2 结果和分析 2.1 VgrR-VgrS的结构特征分析 tblastn序列比对结果显示，Xam中vgrR-vgrS遗传位点的序列长度为2.0 kb，vgrR基因全长678 bp，vgrS全长1158 bp，基因间隔区169 bp，vgrR位于vgrS的基因组上游。搜索NCBI数据库中具有vgrR-vgrS基因簇的细菌基因组，筛选相似度最高的前500个序列进行比对，发现vgrR-vgrS基因簇在革兰氏阴性菌中具有广泛的相似性，并且在植物病原菌中相对保守。根据基因间隔区序列的长度，将vgrR-vgrR遗传位点分为3种主要形式(图 1)。
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| 图 1 vgrR-vgrS遗传位点进化树及基因序列排列模式分析 Figure 1 Phylogenetic tree analysis for vgrR-vgrS gene cluster. The phylogenetic tree is constructed by Neighbor-Joining method. The arranged pattern of vgrR-vgrS locus based on gene spacer region is shown in the schematics. The gene name and the gene size are marked in the figure. |
| 图选项 |
第一种模式vgrR和vgrS之间有4–44 bp的重叠区，即vgrR的3′区与vgrS的5′区重叠，这样的细菌包括X. campestris pv. vesicatoria 85-10、Pseudomonas oryzae KCTC 32247、Dyella sp. M7H15-1、X. citri pv. mangiferaeindicae XC01、X. translucens pv. undulosa Xtu 4699和X. fragariae Fap21等。
第二种vgrR和vgrS 基因之间存在100 bp左右基因间隔区，包含这种模式的细菌有Xam GX08、Xcc 8004、X. axonopodis pv. citri 306、X. vasicola pv. vasculorum Xv1601、Lysobacter capsici 55、Stenotrophomonas maltophilia JV3以及基因间隔区序列为495 bp的X. albilineans GPE PC73等。
第三种模式只存在于Xoo中，vgrR和vgrS之间不仅有基因间隔区，而且基因间隔区编码一个IXO1 transposase蛋白。虽然这种模式区别于其他细菌，但进化谱系树分析显示其遗传位点依然与Xam GX08进化距离较近，与Pseudomonas和Lysobacter的亲缘关系较远，推测此遗传位点发生重大功能改变的位置不在基因间隔区(图 1)。
2.2 vgrS和vgrR突变体菌株的构建和筛选 生物信息学分析显示vgrR-vgrS遗传位点的分析重点在于基因编码蛋白功能的不同，实验首先构建了vgrR和vgrS的突变体，按照1.2.1方法筛选阳性克隆子。图 2-A结果显示，以不同菌株基因组DNA为模板，M13F/VS-up-F为配对引物时，ΔvgrS的2、5、9和12克隆能够得到1389 bp的PCR条带，以M13R/VS-down-R为配对引物，2、3、4、5、6、9和12号克隆的PCR产物是1566 bp，野生型GX08基因组DNA模板条件下，两对引物都没有得到PCR产物。结合两次实验结果，2、5、9和12是筛选到的vgrS阳性突变体菌株。同样，根据图 2-B结果，vgrR的阳性突变体为2、4和6号克隆。
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| 图 2 vgrS和vgrR突变体菌株的PCR鉴定结果 Figure 2 PCR detection results of vgrS and vgrR mutants. A: PCR verification of ΔvgrS. Lane 1: Amplifications with chromosomal DNA of wild type GX08 as template; lane 2–17: Amplifications with chromosomal DNA of candidate mutant clones; M: DL2000 plus DNA marker. Upper panels: PCR results generated by M13F/VS-up-F primer pairs; lower panels: PCR results generated by VS-down-R/M13R primer pairs. B: PCR verification of ΔvgrR. Lane 1: Amplifications with chromosomal DNA of wild type GX08 as template; lane 2–6: Amplifications with chromosomal DNA of candidate mutant clones. Left panels: PCR results of M13F/VR-up-F primer pairs; right panels: PCR results of VR-down-R/M13R primer pairs. |
| 图选项 |
2.3 vgrR和vgrS突变体降低Xam的致病力 10 d后病症观察结果表明，vgrR和vgrS插入失活突变体都导致Xam的致病力下降(图 3)。根据致病分级标准，Xam GX08致病严重程度为3级(发病症状分级标准：0，无症状；1，剪切口周围变黄；2，发黄表型从切口向外延伸；3，发黄区域内的叶脉变黑，组织枯死；4，组织枯死及叶脉变黑的表型向外延伸)，ΔvgrS为1级，ΔvgrR为0.5级，互补菌株ΔvgrS-vgrS和ΔvgrR-vgrR的致病力恢复至接近野生型水平。
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| 图 3 vgrS和vgrR突变体的致病力分析 Figure 3 The virulence detection of vgrS and vgrR mutants against host cassava. Bacteria were suspended in NYG media at a concentration of 108 CFU/mL for inoculation. Virulence levels were recorded 10 days after inoculation. The Xam GX08, vgrS mutant, vgrR mutant and complementary strains were used. |
| 图选项 |
2.4 vgrR和vgrS影响Xam的胞外蛋白酶含量 胞外蛋白酶含量结果显示，vgrR和vgrS突变导致细菌蛋白酶活性降低，vgrR突变体蛋白酶圈直径大小(平均直径0.95 cm)是野生型(平均直径1.85 cm)的50%–80%，vgrS突变体蛋白酶圈直径大小(平均直径1.35 cm)是野生型的60%–80%，互补菌株能够完全或者部分恢复至野生型水平(图 4)。vgrR和vgrS突变体并不影响纤维素酶和淀粉酶的产生(数据未显示)。表明vgrR和vgrS只是通过调控胞外蛋白酶的分泌影响细菌的致病力。
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| 图 4 vgrS和vgrR突变体的胞外蛋白酶活性检测 Figure 4 Extracellular protease activities of vgrS and vgrR mutants. The activity assay was performed on NYG solid medium containing 2% skimmed milk.ΔvgrS-pHM1 and ΔvgrR-pHM1 are control of mutants with empty vector. ΔvgrS-vgrS and ΔvgrR-vgrR are complementary strains. |
| 图选项 |
2.5 vgrR和vgrS突变体降低Xam的游动水平 如图 5所示，vgrS突变体在0.3%的NYG半固体培养基培养3 d后，其菌落大小在1.15–1.40 cm之间，平均值是1.27 cm，野生型的菌落直径为1.75–1.90 cm，平均直径是1.82 cm，表明vgrS突变体的游动性(swimming)减弱(下降至野生型的69.7%)。同样，与野生型相比，vgrR突变体的游动性下降了42.7% (野生型平均菌落直径1.92 cm，vgrR突变体平均菌落直径1.10 cm)。基因遗传互补完全或者部分恢复至野生型游动水平，进一步证明了vgrS-vgrR调控子调节细菌游动性的能力。
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| 图 5 vgrS和vgrR突变体的游动性分析 Figure 5 Swimming detection of vgrS and vgrR mutants. The motility of different stains on 0.3% NYG semi-solid media was compared. Strain names are the same as in Table 1. |
| 图选项 |
2.6 vgrR和vgrS突变体降低Xam对H2O2的耐受力 10 mmol/L H2O2胁迫处理结果显示，与未处理相比，vgrS和vgrR突变体的存活率是野生型的24.84%和46.07%，转化空载体的突变体存活率是野生型的11.22%和20.87%，遗传互补部分恢复至野生型水平(图 6)，表明vgrR和vgrS在抗H2O2胁迫中起重要作用。
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| 图 6 vgrS和vgrR突变体的H2O2耐受力 Figure 6 Survival rate of vgrS and vgrR mutants subjected to H2O2 stress. Bacterial cultures (OD600=0.4) in NYG media were treated with H2O2 and survival rates were calculated by counting cell numbers before and after the stress challenge. A: a measure result of vgrS; B: a measure result of vgrR. Data are shown as mean±SD. *: a significant difference (by Studen's t-test, P < 0.05) compared with that of WT; **: a significant difference by Student's t-test, P < 0.01. |
| 图选项 |
2.7 vgrR和vgrS调节Xam对金属离子的胁迫反应 分析胁迫反应的结果，高浓度Cu2+ (0.4 mmol/L)、Zn2+ (0.4 mmol/L)、Co2+ (0.3 mmol/L)和Ni2+ (0.5 mmol/L)条件下，vgrR和vgrS突变体的生长速度低于野生型菌株，遗传互补完全或部分恢复至野生型水平，其中VgrS对Cu2+更敏感，VgrR对Zn2+和Ni2+的敏感性高于VgrS (图 7-A)。
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| 图 7 vgrS和vgrR突变体对金属离子的胁迫反应 Figure 7 Bacterial growth under different metal stress. Bacterial strains were inoculated onto NYG plates containing different concentration of metals at 28 ℃ for 48–72 h. A: the bacteria cultured on NYG medium containing different concentration of Cu2+, Zn2+, Co2+ and Ni2+; B: the results of Fe2+ and Fe3+ stress. |
| 图选项 |
在Fe2+ (2.5 mmol/L)条件时，vgrS突变体的生长不受抑制，而vgrR突变体基本不生长；另一方面，Fe3+ (1.5 mmol/L)浓度下，vgrR和vgrS突变体的生长都受到抑制，但是vgrS突变体的受抑制水平显著强于vgrR突变体，遗传互补恢复表型(图 7-B)。这些结果表明，细菌生长需要VgrS-VgrR系统维持铁和其他金属离子的体内平衡。
2.8 vgrR和vgrS突变体增强了Xam胞外多糖的产量 胞外多糖测定结果显示，vgrS突变后平均每克干重菌体含多糖2.60 g，是野生型多糖含量的2.14倍(野生型平均每克干重菌体含多糖1.22 g)，转化空载体的突变体为每克干重菌体含多糖2.53 g，互补菌株与野生型含量接近为1.14 g (图 8-A)。同样，vgrR突变后平均每克干重菌体含多糖1.69 g，是野生型多糖含量的1.89倍(野生型平均每克干重菌体含多糖0.90 g)，互补菌株与野生型接近为1.12 g，表明VgrR和VgrS影响了EPS的合成和产量。
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| 图 8 vgrS和vgrR突变体胞外多糖产量检测 Figure 8 The EPS production of vgrS and vgrR mutants. Bacterial strains were inoculated in TGM media supplemented with 1% glucose and incubated at 28 ℃ for 96 h. EPS production was determined by dividing the dry weight of polysaccharides by the dry weight of bacteria. A: the EPS production of vgrS mutant; B: the result of vgrR mutant. Data are shown as mean±SD. *: a significant difference (by Student's t-test, P < 0.05) compared with that of WT. |
| 图选项 |
3 讨论 本研究成功构建地毯草黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xam GX08)双组分调控因子vgrR-vgrS的插入失活突变体，并通过胞外酶、胞外多糖、游动性、过氧化氢耐受性、金属离子胁迫反应以及直接的致病性接种实验，验证了VgrS-VgrR系统参与细菌的致病调控途径，是细菌致病过程中不可或缺的调节子。
以9个具有代表性的植物病原菌绘制vgrR-vgrS基因簇的系统发育树显示，辣椒溶杆菌(L. capsici)、甘蔗白纹病黄单胞菌(X. albilineans)与Xam的进化距离较远，位于早期的进化分支，推测完整的vgrR-vgrS基因簇起源于包括L. capsici或者X. albilineans在内的相关细菌，它们通过水平基因转移的方式在同源物种中获得或者丢失基因(图 1)。这一假设表明，Xam在黄单胞菌属中是较晚获得vgrR-vgrS基因簇的，或者Xam基因簇的进化速率要快于Xoo等其他黄单胞菌。虽然vgrR-vgrS基因簇的基因间隔区具有较大序列长度和碱基的差异，但它们并不影响基因簇在进化树中的系统发育关系，这些序列可能是vgrS基因转录和翻译的潜在起始序列，因此间隔序列的多态性对基因簇的功能影响甚少，进一步说明vgrR和vgrS保守基因是协同进化的。在细菌中，通过水平基因转移获得新基因有助于病原菌的感染和生存，同时不同的选择压力也会促进新功能的出现。
本研究表明，vgrR-vgrS基因簇与细菌的致病力紧密相关。另外，VgrS-VgrR系统能够提高细菌对金属离子的耐受性，在Xcc中VgrS-VgrR耐受Fe、Cu、Zn、Ni、Mn以及Co的高浓度胁迫[24]，恶臭假单胞菌(P. putida)的VgrS-VgrR对Fe、Zn、Mn以及重金属镉具有较强的耐受性[27]，柑桔溃疡病黄单胞菌是对Cu耐受[23]。对比以上研究结果，vgrR-vgrSXam的突变体对Cu、Zn、Ni、Co的胁迫敏感(图 7-A)，这与Xcc的结果一致，但是在Fe3+和Fe2+离子胁迫平板上，vgrS和vgrR突变体的生长出现了差异。首先，vgrS突变体对Fe2+的胁迫没有反应，突变体的生长速度与野生型基本一致，而在Fe3+平板上，vgrS突变体的生长受到严重抑制(图 7-B)；其次，虽然vgrR突变体对两种离子的胁迫都有反应，但是对Fe2+离子更敏感(图 7-B)。推测Xam中的VgrS可能既不感应Fe2+离子信号也不调控Fe2+的转运，双组分系统VgrS-VgrR在Fe2+还原条件下发生了调控分化，此时VgrR可能接受来自其他组氨酸激酶的磷酸信号。考虑到Xam的寄主木薯属于热带作物，不同于温带的甘蓝、萝卜等十字花科植物，VgrS-VgrR系统在这2个菌中发生功能分化并不奇怪，VgrSXam和VgrSXcc的蛋白序列达到96.6%的高相似度，但是在信号感应区却有一个与细菌致死相关的位点差异(未发表数据)，推测Xam中VgrS-VgrR的信号识别机制可能与Xcc不同，其针对不同环境启动的调控途径也会有差异。
细菌多糖可分为3种类型：细胞壁多糖(如肽聚糖)、胞外多糖(如黄原胶)、胞内多糖(如脂多糖)[28]，其中胞外多糖形成的粘质层能够为病原菌侵染、聚集、生长提供必需的条件，是细菌致病过程中非常重要的致病因子[29]。本研究显示，vgrS和vgrR突变体产生的胞外多糖含量高于野生型(图 8)，暗示VgrS-VgrR负调控EPS的合成和转运。豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv. trifolii)的转录调节子抑制脂多糖LPS、β-葡聚糖等生物合成基因的转录，同时促进肽聚糖、纤维素和EPS合成的基因表达[30]；油酸不动杆菌(Acinetobacter oleivorans DR1)的烷基过氧化氢还原酶基因ahpC突变体产生的EPS是野生型菌株的1.7倍，推测高水平的EPS有利于细胞承受更多的氧化应激[31]；另外，不是所有EPS合成基因发生突变后都会使细菌感染能力减弱，例如Xcc EPS合成基因族的gumL突变后并不影响致病力[32]。这些结果都表明EPS对细菌感染过程的影响是多样化的，VgrS-VgrR调控致病性的机制也是多途径的。
综上，本研究对Xam中重要的调控系统VgrS-VgrR进行了全面的致病性分析，结果显示该系统是一个全局性的转录调节系统，通过不同方式参与多种细胞致病过程。本研究拓展了对地毯草黄单胞菌致病机制的认识，为深入了解该细菌的调控网络提供了线索。
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