肖宇, 李河
南方人工林病虫害防控国家林草局重点实验室, 森林有害生物防控湖南省重点实验室, 经济林培育与保护教育部重点实验室, 中南林业科技大学, 湖南 长沙 410004
收稿日期：2020-03-07；修回日期：2020-04-28；网络出版日期：2020-06-15
基金项目：湖南省自然科学基金（2019JJ40531）；国家自然科学基金（31570641）
*通信作者：李河, Tel/Fax:+86-731-85623450;E-mail:csuftlihe@163.com.
摘要：[目的] 由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害，造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能，旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。[方法] 根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段，采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1；PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段，构建回补载体pYF11：：CfMKK1；采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中，荧光筛选回补菌株△Cfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株△Cfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。[结果] 与野生型和回补菌株相比，CfMKK1基因敲除突变体△Cfmkk1菌丝生长速率明显减缓；在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制，无法穿透玻璃纸，丧失了侵染寄主的能力；而且无法形成附着胞。[结论] 研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。
关键词：油茶果生炭疽菌丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1致病力
MAPKK-encoding gene CfMKK1 in Colletotrichum fructicola is required for its growth and pathogenicity
Yu Xiao, He Li
Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Control of Diseases and Pests of South Plantation, Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests, Key Laboratory for Non-Wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan Province, China
Received: 7 March 2020; Revised: 28 April 2020; Published online: 15 June 2020
*Corresponding author: He Li, Tel/Fax:+86-731-85623450;E-mail:csuftlihe@163.com.
Foundation item: Supported by the Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (2019JJ40531) and by the National Natural Science Foundation of China (31570641)
Abstract: [Objective] Colletotrichum fructicola is an important pathogen that results in yield loss of Camellia oleifera. We studied the functions of the mitogen-activated protein kinase gene CfMKK1 in C. fructicola for analyzing the pathogenic mechanism of oil-tea tree anthracnose. [Methods] The homologous recombination method was used to construct the CfMKK1 gene-deleted fragment, which was transformed into the protoplasts generated by using PEG-mediated method to obtain the mutant strain △Cfmkk1. The PCR-amplified CfMKK1 gene-containing complement of the promoter of C. fructicola was taken to construct a complementary vector pYF11::CfMKK1, then the complementary vector was transformed into the mutant protoplasts by using PEG-mediated method to screen the complementary strain △Cfmkk1-C. The biological phenotypes of the wild-type strain CFLH16, the mutant strain △Cfmkk1, and the complementary strain △Cfmkk1-C were measured in vegetative growth, appressorium formation, stress response and pathogenicity. [Results] The mycelial growth rate of △Cfmkk1 was significant slowed down compared to the wild-type strain CFLH16 and the complementary strain △Cfmkk1-C, more sensitive to Congo red, lost the ability to infect hosts and was unable to form appressoria. [Conclusion] CfMkk1 is involved in regulating the growth, response to external stress and appressorium formation of C. fructicola, affecting the pathogenicity.
Keywords: Camellia oleiferaColletotrichum fructicolamitogen-activated protein kinasesCfMkk1pathogenicity
油茶(Camellia oleifera)是我国特有的木本油料树种，因其在食用和制药等方面的广泛用途而具有极高的经济价值[1]。由炭疽菌属真菌(Colletotrichum spp.)引起的炭疽病是油茶的主要病害[2]。课题组研究表明果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)是引起我国油茶炭疽病的优势流行病原菌[3-5]。
MAPK (mitogen-activated protein kinases)是一类普遍存在于真核生物中的丝/苏氨酸蛋白激酶，由激酶MAPKKK、MAPKK和MAPK组成的级联通路，它们在调控真菌的有性生殖、生长发育、细胞壁完整性和致病力等方面起着重要的作用[6-7]。植物病原真菌存在3条MAPK级联通路，分别是调节有性生殖和侵染生长的Fus3/Kss1-MAPK级联通路、调控细胞壁完整性的Slt2-MAPK级联通路和介导高渗反应的Hog1-MAPK级联通路[8]。研究发现Fus3/Kss1- MAPK级联通路MAPK蛋白激酶CfPmk1调控病原菌C. fructicola生长发育和致病性[9]；Slt2-MAPK级联通路的MAPK激酶Mps1影响稻瘟菌的致病力[10]；稻瘟菌中Hog1-MAPK级联通路的MAPK激酶OSM1，调控菌体内甘油积聚和渗透压[11]。
MAPKK通过磷酸化激活MAPK完成上游信号传递，进而激活转录因子调控相关基因的表达来应答环境胁迫[12-13]。本文拟以细胞壁完整性Slt2-MAPK级联通路的MAPKK蛋白激酶CfMkk1为对象，研究其在油茶果生炭疽菌中的生物学功能，为揭示该病菌的致病机理奠定基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 供试菌株: 在本项实验中，采用由本实验室分离保存的油茶果生炭疽菌CFLH16为野生型(wild type，WT)菌株。CfMkk1基因的敲除和回补菌株是基于野生型菌株CFLH16获得。所有菌株均在PDA培养基上于28 ℃下生长。
1.1.2 培养基: (1) PDA培养基(g/L)：马铃薯去皮200，葡萄糖20，琼脂20，pH自然。(2) MM培养基(g/L)：NaNO3 6，KCl 0.52，MgSO4·7H2O 0.152，KH2PO4 1.52，维生素B1 0.01，微量元素1 mL，葡萄糖10，琼脂15，pH为7.0。
1.2 果生炭疽菌中的CfMkk1序列分析 根据酒酿酵母(Saccharomycescerevisiae)中Mkk1蛋白的氨基酸序列(CAA99451.1)在C. fructicola基因组中进行BLASTp搜索，获得CfMkk1氨基酸序列。基于CfMkk1和其他真菌Mkk1蛋白的氨基酸序列采用MEGA 7.0软件进行系统发育分析。
1.3 果生炭疽菌中CfMKK1基因的敲除 从数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载果生炭疽菌(C. fructicola) ANPB00000000.1基因组序列，根据CfMKK1基因及侧翼序列设计引物。CfMKK1-1F/CfMKK1-2R引物从野生型菌株CFLH16的DNA中PCR扩增5′非编码区893 bp上臂片段，CfMKK1-3F/CfMKK1-4R引物从野生型菌株CFLH16的DNA中PCR扩增3′非编码区822 bp下臂片段，使用引物Hyg-F和Hyg-R扩增潮霉素抗性表达基因HPH (约1.4 kb)。使用引物CfMKK1-1F和CfMKK1-4R将这3个不同DNA片段Overlap成一个敲除载体片段。PCR扩增后，取5 μL反应混合液电泳分析验证是否扩增成功。PCR产物溶解在10 μL TE缓冲液中用于转化。
使用PEG介导法将敲除载体片段导入到果生炭疽菌的原生质体中，并在含有潮霉素的TB3培养基中培养2–3 d。使用基因内探针引物CfMKK1-7F和CfMKK1-8R以及CfMKK1-5F和H855R通过PCR验证CfMKK1基因是否敲除成功。满足引物CfMKK1-7F和CfMKK1-8R无法扩增出条带而引物CfMKK1-5F和H855R可扩增出目标条带的菌株即为CfMKK1基因敲除突变体菌株。本文涉及引物见表 1。
表 1. 本研究涉及的引物序列 Table 1. Primers used in current study
| Primer | Sequence (5′→3′) | Purpose |
| CfMKK1-1F | AATTAGCGCCCAAGCTCAAGT | Amplify CfMKK1 5′ flank sequence |
| CfMKK1-2R | TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCGGCCA GAAGATGGTTGTTGAA | Amplify CfMKK1 5′ flank sequence |
| CfMKK1-3F | CAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGTGTTTC GGTGCACTCACCATT | Amplify CfMKK1 3′ flank sequence |
| CfMKK1-4R | AAGCCCGAGGCTGAAGACAA | Amplify CfMKK1 3′ flank sequence |
| CfMKK1-5F | CGCATTTTGCCCTGAGCCAGA | Validation of CfMKK1 gene deletion |
| H855R | GCTGATCTGACCAGTTGC | Validation of CfMKK1 gene deletion |
| CfMKK1-7F | CCACCTTCGCCAAATGCAAA | Amplify CfMKK1 gene sequence |
| CfMKK1-8R | CGCACTCCTTGTTGAAACCG | Amplify CfMKK1 gene sequence |
| CfMKK1-9F | ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTG GTTGTCCATGCTTCAAGGTCGAT | Amplify complemented sequence |
| CfMKK1-10R | CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCT CACCTTGGTCTCCCAGCCCCATA | Amplify complemented sequence |
| Hyg-F | GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA | Amplify HPH sequence |
| Hyg-R | CGGTCGGCATCTACTCTATTCCTTTG | Amplify HPH sequence |
表选项
1.4 CfMKK1基因敲除突变体回补菌株的获得 为了得到突变体回补菌株，使用引物CfMKK1-9F和CfMKK1-10R从野生型CFLH16中扩增得到完整的CfMKK1基因。将扩增获得的PCR产物纯化后，与线性化的pYF11质粒载体共同转入XK-125酵母细胞[3]。使用引物CfMKK1-7F和GFP-R通过PCR对在SD-Trp培养基上生长的酵母进行验证。将验证成功的质粒转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，利用引物CfMKK1-9F和GFP-R分别进行测序。将测序正确的质粒转入?Cfmkk1突变体菌株的原生质体中，对具有博来霉素抗性的转化子进行荧光检查、PCR验证鉴定回补菌株?Cfmkk1-C，用于后续生物学表型测定。
1.5 CfMKK1基因敲除突变体的生物学表型测定
1.5.1 在不同培养基上生长测定: 将野生型CFLH16、突变体?Cfmkk1、回补菌株Cfmkk1-C的菌落边缘切取约2 mm×2 mm的菌饼分别接种于基本培养基MM及PDA培养基上，28 ℃暗培养5 d后观察菌落形态并测量菌落直径。以野生型菌株为对照，每个菌株设3个重复，试验重复3次。
1.5.2 外界胁迫敏感性测定: 在野生型菌株CFLH16、突变体菌株?Cfmkk1、回补菌株?Cfmkk1-C菌落边缘用经灭菌的打孔器(Φ=8mm)切取菌饼，分别接种于添加了200、400、600 μg/mL细胞壁胁迫因子Congo red的PDA平板中央，28 ℃暗培养4 d后测量菌落直径，并统计抑制率。每个菌株设置3个重复，试验重复3次。
1.5.3 玻璃纸穿透实验: 将灭菌的边长2.5 cm的正方形玻璃纸贴在PDA平板上，然后吸取野生型CFLH16、突变体?CfMkk1以及回补菌株?CfMkk1-C调为等浓度(1×105个/mL)的分生孢子液各取20 μL置于玻璃纸膜上，置于28 ℃恒温培养，3 d后，除去玻璃纸膜再放回培养箱培养2 d，观察培养基上菌丝的生长情况。试验重复3次。
1.5.4 致病力测定: 采摘油茶嫩叶9片，无菌水清洗干净后置于透明聚苯乙烯盒中，内衬无菌水湿润的棉花以保证盒内潮湿的环境。在培养3 d的野生型CFLH16、突变体?CfMkk1以及回补菌株?CfMkk1-C的菌落边缘，使用经灭菌的打孔器(Φ=8 mm)切取菌饼，无菌PDA培养基作为空白对照，将有菌体的一面接种在针刺的有伤叶片上。28 ℃下暗培养，观察叶片发病情况。每次实验3个重复，试验重复3次。
1.5.5 附着胞形成试验: 首先将野生型CFLH16、突变体?Cfmkk1以及回补菌株?Cfmkk1-C分别接种在PD液体培养基中，28 ℃振荡培养3 d后，从菌液中收集各菌株的分生孢子，并使用血球计数板统计产孢量。通过无菌水稀释得到等浓度(1×105个/mL)的3种菌株的分生孢子悬浮液10 μL，置于疏水玻片(fisherband)上，将载玻片放在培养皿中，28 ℃保湿暗培养，8 h后观察附着胞形成率和形态。每次实验3个重复，试验重复3次。
2 结果和分析 2.1 CfMkk1的鉴定及系统进化分析 根据酿酒酵母中ScMkk1蛋白的氨基酸序列(CAA99451.1)，在油茶果生炭疽菌全基因组中鉴定到一个同源蛋白CfMkk1。CfMKK1基因全长1723 bp，编码521个氨基酸，含有一个S_TKc结构域(图 1-A)。系统发育分析表明，该蛋白是属于Mkk型MAPKK进化枝的成员，与Pbs2型或Ste7型进化枝不同。CfMkk1氨基酸序列与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的Mkk1氨基酸序列同源性最高，而与酿酒酵母(S. cerevisiae)距离较远(图 1-B)。
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| 图 1 CfMkk1结构域预测以及系统发育分析 Figure 1 Domain prediction and phylogenetic analysis of CfMkk1. A: The structure of CfMkk1. S_TKc: Serine/Threonine domain, the number represents the serial number of the amino acid; B: The neighbour-joining phylogenetic tree. The number after each reference taxon is GenBank accession number of amino acid sequence orthologous to CfMkk1. |
| 图选项 |
2.2 CfMKK1基因敲除突变体及回补菌株的获得 为了阐明CfMkk1的生物学功能，根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段，敲除策略参考文献[14]所描述的方法。综合CfMKK1-7F/ CfMKK1-8R和CfMKK1-5F/H855R两对引物的检测结果，成功获得Cfmkk1基因敲除突变体菌株?Cfmkk1。对具有博来霉素抗性的转化子进行荧光筛选和PCR验证，成功获得回补菌株?Cfmkk1-C。
2.3 CfMKK1参与调控果生炭疽菌的营养生长 为了研究CfMKK1基因对油茶果生炭疽菌营养生长的影响，我们将野生型菌株CFLH16、突变体菌株?Cfmkk1、回补菌株Cfmkk1-C分别接种于PDA、MM培养基上，观察菌落形态，测量菌落直径。结果表明，突变体菌落大小无论是在PDA培养基上还是在MM培养基上，均小于野生型及回补菌株，且其生长速率也远小于野生型及回补菌株(图 2-A，图 2-B)。纵切之后，可以明显观察到突变体的气生菌丝比野生型及回补菌株少(图 2-C)。结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的菌丝生长过程。
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| 图 2 突变体?CfMkk1在培养基上的菌落形态 Figure 2 The colony morphology of the mutant ?CfMkk1 on culture medium. A: The wild-type CFLH16, the mutant ?Cfmkk1 and the supplementary strain Cfmkk1-C inoculating on PDA and MM media at 28 ℃ in the dark (5 days); B: Statistical analysis of differences in colony diameter. Error bars indicate standard deviation and different capital letters represent significant difference on P < 0.05; C: Aerial hyphae reduced significant in the mutant. |
| 图选项 |
2.4 CfMKK1基因参与病菌细胞壁对外界胁迫应答 将野生型菌株CFLH16、突变体菌株?Cfmkk1、回补菌株Cfmkk1-C分别接种于含有不同浓度细胞壁胁迫因子刚果红(200、400、600 μg/mL Congo red)的培养基中，培养4 d后统计抑制率。结果显示，突变体在添加了细胞壁胁迫因子Congo Red的培养基中生长抑制率较野生型和回补菌株显著提高，耐受性明显下降(图 3)，表明CfMKK1基因参与调控果生炭疽菌细胞壁对外界胁迫的应答过程。
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| 图 3 突变体?Cfmkk1对细胞壁胁迫因子敏感性测定 Figure 3 Sensitivity test to the cell wall stress factor CR of the mutant ?Cfmkk1. A: Fungal colonies growing on PDA media containing 200, 400, 600 μg/mL Congo red in dark at 28 ℃ (4 days); B: Statistical analysis of inhibition rate at different concentrations of Congo red. Error bars indicate standard deviation and different lowercases represent significant difference on P < 0.01. |
| 图选项 |
2.5 玻璃纸穿透试验 玻璃纸的成分类似于植物细胞壁，用玻璃纸模拟植物细胞壁研究病菌穿透状况，以此推断病原菌是否对寄主具有致病性[3, 15-16]。玻璃纸穿透试验结果表明，野生型及回补菌株在揭掉玻璃纸后，继续培养2 d后长出了菌落，说明它们能够穿透玻璃纸，而突变体菌株则未长出新的菌落，说明突变体不能穿透玻璃纸(图 4)。试验结果表明，CfMKK1基因的缺失使果生炭疽菌穿透能力丧失，以此推断其致病力可能会受到影响。
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| 图 4 玻璃纸穿透试验 Figure 4 Penetration of mutant into cellophane membrane. Before: Fungal colonies of wild-type strain CFLH16, mutant strain ΔCfmkk1 and complementary strain Cfmkk1-C growing on cellophane membranes at a constant temperature of 28 ℃ under dark conditions (3 days); After: the plates culturing at a constant temperature of 28 ℃ under dark conditions (2 days). |
| 图选项 |
2.6 致病力测定 为了探究CfMKK1基因对致病力的影响，我们采用菌丝块有伤接种油茶离体叶片进行测定。结果表明，在有伤条件下，5 d后野生型菌株CFLH16、回补菌株Cfmkk1-C均引起发病，且产生明显的病斑，而突变体只能在针尖部分形成无法扩展的小斑点(图 5)。结果表明CfMKK1基因影响果生炭疽菌的致病力。
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| 图 5 突变体ΔCfmkk1的致病力测定 Figure 5 Testing of mutant ΔCfmkk1 pathogenicity. A: Wild type strain CFLH16, mutant strain ?Cfmkk1 and complementary strain Cfmkk1-C inoculating on the injured leaves. CK: PDA medium; B: Statistical analysis of lesion radius of injured leaves. Error bars indicate standard deviation and different lowercases represent significant difference on P < 0.01. |
| 图选项 |
2.7 CfMKK1基因参与调控附着胞的形成 附着胞是果生炭疽菌侵染寄主的过程中至关重要的结构。本试验对CfMKK1基因是否影响附着胞的形成进行了试验，结果表明，野生型CFLH16、突变体?Cfmkk1、回补菌株Cfmkk1-C都能萌发形成芽管，且差别不大。野生型及回补附着胞正常形成，但突变体无法形成附着胞(图 6)。说明CfMKK1参与调控油茶果生炭疽菌分生孢子附着胞的形成。
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| 图 6 突变体?Cfmkk1附着胞观察 Figure 6 Observation of mutant ?Cfmkk1 appressoria. A: The mutant ?Cfmkk1 not forming appressoria; B: Statistical analysis of the rate of appressorium formation. Error bars indicate standard deviation and different lowercases represent significant difference on P < 0.01. |
| 图选项 |
3 讨论 油茶炭疽病是我国油茶产区的主要病害。该病害是由多种炭疽菌侵染所致，病原菌种类主要有果生炭疽菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、山茶炭疽菌和卡斯特炭疽菌等，其中果生炭疽菌分离频率最高(70%左右)，分布在全国90%以上的油茶种植区，且对油茶叶的致病力最强[3-5]。本试验研究了油茶果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白(MAP)激酶基因CfMKK1在病菌生长发育、外界胁迫、附着胞及致病力等方面的生物学功能，对阐明其作用的分子机制提供了依据。
本研究中的蛋白激酶CfMkk1是一个MAPKK蛋白，是丝裂原活化蛋白激酶MAPK三级联信号途径中的中间蛋白，受到上一级蛋白激酶MAPKKK的激活后磷酸化下游的MAPK蛋白激酶[17-18]。酵母菌中含有Ste7、Mkk和Pbs2等3个MAPKK蛋白，其中Ste7从真菌到人类中具有高度保守的位点，而在Pbs2和Mkk1/Mkk2中则没有类似的保守位点，这说明3个MAPKK蛋白可能执行着不同的生物学功能[19]。
本试验对突变体?Cfmkk1和野生型CFLH16以及回补菌株Cfmkk1-C营养生长情况进行了对比，发现突变体菌株菌丝生长速率及气生菌丝体数量明显低于野生型及回补菌株，说明CfMKK1基因影响果生炭疽菌的生长状况。对外界胁迫的应答能力也是病原菌致病力的重要衡量标准，病原菌侵染寄主，首先要在外界各种胁迫环境中存活下来。我们进一步对突变体对外界胁迫的敏感性进行了测定，发现突变体对细胞壁胁迫因子Congo red的耐受性显著降低，表明CfMkk1参与调控果生炭疽菌细胞壁对外界胁迫应答过程。在模式生物酿酒酵母中的Slt2-MAPK通路中的Rom2感知外界信号并传递给Pkc1和Bck1-Mkk- Slt2级联途进而调控真菌细胞壁的完整性[20-24]。
附着胞是病原菌侵染寄主的重要结构，在病原菌侵染植物过程中起着非常重要的作用。有研究发现在Fus3/Kss1-MAPK级联通路中，在玉米小斑病菌中MAPKK蛋白基因STE7敲除突变体无法形成附着胞，致病力显著减弱[25]；果生炭疽菌的CfPMK1基因缺失导致油茶果生炭疽病菌不能形成附着胞，完全丧失了致病力[26]。在Slt2-MAPK级联通路中，稻瘟菌中MAPK激酶MPS1基因敲除突变体可以形成附着胞，但对植物没有致病力[10]。Mycosphaerella graminicola的MgSlt2突变菌株能正常穿透小麦气孔，但侵染菌丝不能在植物组织内生长扩展，毒力下降[27]。在C. orbiculare中的一个Slt2同源基因MAF1，其缺失突变体芽管变长，不能形成附着胞[28]。在本研究中，CfMkk1是Slt2-MAPK级联通路中的一个MAPKK激酶同源蛋白，通过磷酸化MAPK激酶传递信号。CfMKK1基因敲除突变体不能形成附着胞，无法穿透玻璃纸，在有伤的叶片中菌丝不能侵染生长，这可能是CfMKK1基因敲除突变体致病力丧失的主要原因。
本研究从油茶炭疽病优势致病菌果生炭疽菌中，鉴定出一个丝裂原活化蛋白激酶基因，命名为CfMKK1。研究发现CfMKK1参与调控果生炭疽菌的营养生长、侵染生长、附着胞形成和致病力。本文研究结果可为理解果生炭疽菌致病分子机理和以CfMKK1基因为潜在靶标开发新型杀菌剂提供理论依据。
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