朱振洪1
, 李函2, 李永泉2 1. 浙江中医药大学生命科学学院, 浙江 杭州 310053;
2. 浙江大学药物生物技术研究所, 浙江 杭州 310012
收稿日期：2018-05-24；修回日期：2018-07-16；网络出版日期：2018-08-02
基金项目：浙江省自然科学基金（LY16C010001）
*通信作者：朱振洪, Tel:+86-571-86613713, E-mail:zhenhongzhu@aliyun.com;
李永泉, Tel:+86-571-88206632, E-mail:lyq@zju.edu.cn.
摘要：[目的] 研究盐霉素生物合成基因簇上游潜在调控基因slnN的功能。[方法] 本实验利用遗传操作技术，分别对白色链霉菌出发菌株Streptomyces albus BK3-25中的slnN基因进行敲除和过表达，然后利用抑菌圈实验和发酵实验，分别检测不同衍生菌株中盐霉素生物合成产量的变化。同时利用qRT-PCR分析衍生菌株与原始出发菌株之间的结构基因表达差异。[结果] 结果表明在slnN基因缺失株（slnNDM）中，盐霉素的表达水平提高了35%左右；而在slnN基因过表达株（slnNOE）中，盐霉素产量下降达43%左右。qRT-PCR分析进一步发现slnN基因缺失，会引起slnO和slnA1基因的上调；而slnN基因过表达后，一方面会下调slnO与slnA1基因的表达，另一方面引起slnT1、slnF基因上调。[结论] 本研究证实slnN基因对盐霉素的生物合成具有明显的负调控作用，其机制有待进一步研究。
关键词：白色链霉菌盐霉素生物合成slnN基因调控功能
Regulation of slnN gene in salinomycin biosynthesis
Zhenhong Zhu1
, Han Li2, Yongquan Li2 1. College of Life Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China;
2. Institute of Pharmaceutical Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310012, Zhejiang Province, China
*Corresponding author: Zhenhong Zhu, Tel: +86-571-86613713, E-mail: zhenhongzhu@aliyun.com;
Yongquan Li, Tel: +86-571-88206632, E-mail: lyq@zju.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LY16C010001)
Abstract: [Objective] To study the potential of regulatory gene slnN upstream of salinomycin biosynthesis gene cluster. [Methods] We used genetic manipulation technique to knock out and overexpress the slnN gene in the original strain Streptomyces albus BK3-25. Then, using inhibition zone test and fermentation experiment, we detected the changes of the production of salinomycin biosynthesis in different derivative strains. At the same time, we used qRT-PCR technique to analyze the difference of the structural gene expression between the derived strains and the original strain. [Results] The production of salinomycin was increased by about 35% in the slnN gene-deleted strain (slnNDM), whereas the production of salinomycin was decreased by about 43% in the slnN gene-overexpressing strain (slnNOE). qRT-PCR analysis revealed that loss of slnN gene caused up-regulation of slnO and slnA1 genes. The slnN gene overexpression, on the one hand down-regulated the expression of slnO and slnA1 gene, on the other hand caused slnT1 and slnF gene up-regulation. [Conclusion] The slnN gene has a significant negative regulatory effect on the biosynthesis of salinomycin.
Keywords: Streptomyces albussalinomycinbiosynthesisslnN generegulation function
盐霉素(Salinomycin)属典型的离子载体抗生素。其主要的抗菌机制是对细胞中的阳离子，尤其K+、Na+、Rb+的亲和力特别强，使生物所必需的阳离子通过膜上脂质屏障的浸透性增强，妨碍细胞内外阳离子的传递，从而影响渗透压，最终使细胞崩解，起到杀菌作用[1]。盐霉素已广泛作为畜禽业抗球虫剂使用，具有广谱、高效、低毒、低残留等特点。另外盐霉素还具有抑制肿瘤干细胞的活性，在实验室研究期间，其杀死小鼠身上乳腺癌干细胞的效力比普通抗癌药物紫杉醇高出100倍[2]，还具有抑制肝癌、卵巢癌及胰腺癌等多种肿瘤的生长，有希望成为新的抗肿瘤药物[3-4]。
Yurkovich等[5]通过对Streptomyces albus DSM41398盐霉素生物合成基因簇的解析，注释了3个调控基因，分别是基因簇下游的salJ基因和基因簇上游的salN、salO基因。而Jiang等[6]在S. albus XM211菌株中仅注释了一个簇内调控基因slnR，序列分析表明与salJ基因序列完全一致。在本实验所用的S. albus BK3-25菌株中[7]，序列分析表明同样存在与S. albus DSM41398序列完全一致的3个潜在的调控基因，在此统一命名为slnR、slnN和slnO[8]。其中slnR基因经研究证实为盐霉素生物合成簇内途径特异性正调控基因[9]，而slnN、slnO基因功能未知，通过NCBI Protein-Blast软件比对，发现slnN基因编码蛋白与多重耐药性转录因子(Multiple antibiotic resistance regulator，MarR)家族同源性达61%。MarR是广泛存在于细菌和古细菌中一类保守的转录调控因子，不同细菌种属的MarR同源蛋白可以响应来自环境或宿主免疫应答产生的有害因子，包括抗生素抗性、环境协迫响应、菌体毒力以及芳香族化合物代谢等[10]。本文通过对S. albus BK3-25菌株中slnN基因敲除、基因过表达，并利用荧光定量PCR技术检测衍生菌株与出发菌株之间的基因表达差异，探讨slnN基因对于盐霉素生物合成的潜在调控功能。为进一步通过转录调控水平改造盐霉素高产菌株打下基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒与引物: 如表 1、2、3所示。
表 1. 本实验所用的菌株 Table 1. List of strains used in this study
| Strains | Description | Source/Reference |
| S. albus BK3-25 | The original strain for salinomycin production | Zhejiang Shenghua Biok Biological Company (China) |
| slnNDM | slnN gene-deleted strain | This study |
| slnNOE | slnN gene-overexpressing strain | This study |
| BL21(DE3) | Strain for recombinant protein expression | Invitrogen |
| TG1 | Used for usual transformation in plasmid construction | Amersham |
| BW25113/pKD46 | Strain used for PCR-targeted mutagenesis | Chunyan Jiang et al, 2012 |
| ET12567/pUZ8002 | Non-methylating ET12567 containing non-transmissible RP4 derivative plasmid pUZ8002 | [11] |
| Bacillus subtilis | Indicator strain for salinomycin bioassays | CGMCC 1.3358 |
表选项
表 2. 本实验所用的质粒 Table 2. List of plasmids used in this study
| Plasmids | Description | Source/Reference |
| pIJ8660 | Site-specific integration vector carrying ermEp*, фC31 int, and attP | [9] |
| pIJ8661 | pIJ8660 with extra MCS including Nde I and Kpn I restriction sites | This study |
| 15D8 | Fosmid carrying the slnN gene | This study |
| pIJ8661-slnN | pIJ8661 with a 984 bp Nde I/Kpn I DNA fragment | This study |
表选项
表 3. 本文所用的PCR扩增及荧光定量PCR引物 Table 3. List of PCR primers and fluorescence quantitative PCR primers used in this study
| Primer names Sequences (5′→3′) | |
| Ntar-F | GGCGACGGCAGGGCAACGGCCGGAGGAGGAAGGCGGATGATTCCGGGGATCCGTCGACC |
| Ntar-R | GCAAAAGCCGTGGCCGCGCGCCCCGGTGGACCGGGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
| JDN-F | AGTCGCCCGATCCCTGTCCCATGC |
| JDN-R | TGCCCGAGCTTCGCCTTCCGT |
| GN-F | GGAATTCCATATGCACGGCTATACGCACTTGCG |
| GN-R | GGGGTACCTCAGGAGAGCAGGTCGAGTACGGAG |
| HN-F | GCCAACTCCCCTGCCTGGTGCGGTT |
| HN-R | TCAGGAGAGCAGGTCGAGTACGGAG |
| N-F | CGGGATCCATGCACGGCTATACGCACTTGCG |
| N-R | CGGAATTCTCAGGAGAGCAGGTCGAGTACGGAG |
| Tsr-F | TTGGACACCATCGCAAATC |
| Tsr-R | AAACCGAGGCGGAAGACG |
| qhrdB-F | AGGACGACGCCCCCGCACAG |
| qhrdB-R | CCGGCCTCGATCCGCTTGGCG |
| qN-F | CCCACCGCCTGCATGCCCGA |
| qN-R | CGCTCCACCACCGGCTGCCA |
| qA1-F | ACCTCGCTCTCGCCGGAGGC |
| qA1-R | CCGTCGGCCCGCTCGTCGAA |
| qF-F | CGGCCACGAGACCACCGCGA |
| qF-R | CCCGGTGCCGAGCGGGATGT |
| qT1-F | AACGCGGTGGCCGAGGGCAA |
| qT1-R | CGGGGGCGTCGCCGTAGTGG |
| qC-F | GGCGCGCACCGCCTCTACCT |
| qC-R | TGGCGGCGCACCACCCAGTC |
| qB3-F | CTGCCCACGCCGGCCGATCC |
| qB3-R | CTCGTGCCCCAATAGGCCCGCA |
| qR-F | CGGGCACCCAGGCCGACGAG |
| qR-R | GCGGTCGGCGTGGTCGGTGT |
| ermE*P-F | AAGCTTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC |
| F stands for forward primer, and R stands for reverse primer. | |
表选项
1.1.2 培养基: 大肠杆菌采用LB培养基和SOB培养基；链霉菌平板培养采用ISP4固体培养基；盐霉素生产菌的发酵种子培养基为：3.0% TSB；发酵培养基为YMG培养基：酵母提取物0.4%，麦芽提取物1.0%，葡萄糖0.4%，CaCO3 0.2%，用10 mol/L NaCl调至pH 7.2，接种前另加10%的灭菌大豆油。
1.1.3 主要试剂: 本实验所用的内切酶、连接酶均购自TaKaRa公司，KOD高保真DNA聚合酶购自TOYOBO公司。DNA marker和rTaq酶均购自TaKaRa公司。PCR产物回收纯化试剂盒、DNA质粒抽提试剂盒购自Axygen公司。RNA抽提试剂盒、荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa公司产品。盐霉素检测用显色剂4-二甲氨基苯甲醛和本实验所用的抗生素均为Sigma公司产品。
1.2 slnN基因敲除株和回补株的构建 利用前期构建的BK3-25菌株的基因组Fosmid文库，利用PCR技术筛选到含slnN基因的fosmid 15D8。首先将15D8转入大肠杆菌BW25113 (pKD46)中，再利用Ntar-F/Ntar-R为引物，以pIJ773 (经Hind +EcoR I双酶切)作模板，PCR扩增并割胶回收1.38 kb左右条带。采用PCR-targeting技术和抗性平板[含氯霉素(chl)、阿泊拉霉素(Apra)]筛选，获得用于双交换的质粒pSL2 (图 1)。
 |
| 图 1 slnN基因敲除株的构建示意图 Figure 1 Construction sketch of slnN gene knockout strain. |
| 图选项 |
再将pSL2质粒转入大肠杆菌ET12567 (pUZ8002)中，利用链霉菌–E. coli属间接合转导实验，通过含Apra的抗性平板筛选，获得抗性接合子，然后挑取抗性接合子松弛二代培养后，利用slnN基因两侧同源臂引物JDN-F/JDN-R，采用PCR方法验证获得slnN基因缺失的双交换突变株，命名为slnNDM。
为验证slnNDM表型是由于slnN基因突变引起的，同时又构建了slnNDM株的回补株。采用Wt基因组为模板，以特异性引物HN-F/HN-R扩增1560 bp的序列(含slnN基因及可能的启动子序列576 bp)，该片段与pIJ8600相连接后，转入大肠杆菌ET12567 (pUZ8002)中，与slnNDM菌株进行接合转导，经过Apra+Tsr双抗性筛选，并提取基因组DNA验证，最终获得回补株，命名为slnNCOM。
1.3 slnN基因高表达株的构建 设计特异性引物(GN-F/GN-R)扩增完整的slnN基因(984 bp)，然后该基因经过Nde I/Kpn I双酶切并割胶回收，然后与Nde I/Kpn I双酶切后的pIJ8661质粒相连接，使该基因在ermEp*强启动子控制之下，构建整合型重组质粒pIJ8661-slnN。该质粒转化ET12567/pUZ8002菌，与BK3-25菌株进行接合转导，Apra抗性平板筛选，PCR验证ermEp*启动子序列是否整合到染色体基因组上(引物分别为：ermE*P-F/JDN-R)。将获得的高表达菌株命名为slnNOE。
1.4 盐霉素产生菌的发酵实验 在超净台中，挖取1 cm2大小的BK3-25菌落(已在ISP4固体培养基上培养1周)，放入已灭菌的装有30 mL 3% TSB培养基的锥形瓶中(含18颗小玻璃珠)，置于33 ℃、240 r/min的恒温摇床中培养26–30 h。然后将培养好的种子液按10%比例接种到40 mL YMG发酵培养液中(含10%的大豆油，含18颗玻璃珠)，用10层纱布封口，置于33 ℃、240 r/min恒温摇床培养4 d，补加5%的大豆油，继续培养4 d，最后将发酵液收至50 mL离心管。发酵期间每日取1–2 mL发酵液进行盐霉素产量的检测。
1.5 盐霉素发酵产物的分光光度法检测 发酵液第1步用无水乙醇稀释定容后，超声波提取20 min，过滤，取滤液1 mL至10 mL容量瓶用无水乙醇定容；再准确吸取第2步稀释液0.5 mL于具塞试管中，加入无水乙醇4.5 mL，显色剂5 mL。对照液：准确吸取0.5 mL、100 μg/mL对照液于具塞试管中加入无水乙醇4.5 mL，显色剂5 mL，摇匀。把试样液和对照液同时放入70 ℃恒温水浴20 min，冷却后用紫外分光光度计，在OD600以无水乙醇为空白，测定对照液和试样液的吸光值。对照品测2次，绝对差值小于0.01。
 | 公式(1) |
1.6 盐霉素发酵产物的HPLC检测 取发酵液2 mL，按1:9的比例加入甲醇，超声20 min；12000×g离心10 min，取上清；利用有机滤膜将上清过滤后，取200 μL进行HPLC检测。检测条件为：A：超纯水；B：乙腈；A:B=9:91；流速为0.4 mL/min；进样量：10 μL；样品检测时间：45 min；色谱柱：Angilent XDB C18 4.6 mm×150 mm，3.5 mm。
1.7 盐霉素产生菌的生物指示实验 先挑取枯草芽孢杆菌单菌落，在5 mL Media Number 51 (MN51)培养基中培养，30 ℃、245 r/min培养16–18 h。然后在超净台中，取菌液100 mL在MN51平板中涂布均匀，正放30 min。30 min以后在平板上做好标记，用蓝色枪头取培养白色链霉菌的培养基，必要时可用镊子取下，正放在平板上并稍稍按下。完成后正放在4 ℃冰箱过夜(至少14 h以上)，30 ℃培养12 h左右，观察抑菌圈的形成并拍照。
1.8 白色链霉菌的RNA提取、DNA消解及反转录实验 RNA提取采用EASY spin Plus细菌RNA快速提取试剂盒(北京艾莱德生物科技有限公司)抽提，操作方法见试剂盒说明书。基因组DNA消解过程：Total RNA 40 mg；10×buffer 10 μL；rDNase I 4 μL；RNase Inhibitor 1 μL；加DEPC H2O补充至100 μL，37 ℃，45 min。然后加等体积的苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，最后加25 μL ddH2O (RNase free)溶解沉淀，–80 ℃冻存。反转录实验：本实验采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV反转录试剂盒，具体操作见产品说明书。
1.9 荧光定量PCR(qRT-PCR)实验 采用反转录后的cDNA作为模板，利用TaKaRa公司的2×SYBR premix Ex Taq试剂进行荧光定量PCR实验。以hrdB基因为参比基因，采用表 3中的引物(首字母含q的引物)，分别对slnN、slnA1、slnF、slnT1、slnC、slnB3、slnR基因进行荧光定量分析，mRNA相对表达量的变化计算方法为F=2–△△Ct法。
2 结果和分析 2.1 slnN基因突变株的筛选与鉴定 为了探讨slnN基因与盐霉素产量的关系，我们用图 1中的方法将原始出发菌中的slnN基因(984 bp)序列置换为Apra抗性基因(1.38 kb)，筛选并获得双交换菌株slnNDM。利用同源臂引物JDN-F/JDN-R对slnNDM双交换菌株进行PCR验证(图 2)，从图 2中可以看出，以原始出发菌(S. albus BK3-25)基因组为模板扩增的条带大小为1.2 kb左右，而以突变株slnNDM为模板扩增的条带大小为1.6 kb左右。slnNDM菌株回补株的验证，采用扩增硫链丝菌素基因的引物(Tsr-F/Tsr-R)和扩增slnN基因的引物(N-F/N-R)进行PCR鉴定，结果分别能扩增出0.7 kb的Tsr抗性片段和1 kb左右的目的基因条带(DNA电泳图略)。
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| 图 2 slnN基因缺失突变株的PCR鉴定 Figure 2 PCR identification of deletion mutant of slnN gene. M: DNA marker; lane 1: Amplification by using the WT genome as a template; lane 2–5: Amplification by using the slnNDM genome as a template. |
| 图选项 |
2.2 slnN基因高表达株的构建与筛选 利用整合型质粒pIJ8661，使slnN基因处于ermEp*强启动子控制之下，构建整合型重组质粒pIJ8661-slnN。该质粒转化ET12567/pUZ8002菌，与原始出发菌株进行接合转导，Apra抗性平板筛选，PCR验证ermEp*启动子序列是否整合到染色体基因组上(图 3)。发现从WT基因组中扩不出条带，而在slnNOE菌株基因组中可以扩出1000 bp左右条带，说明ermEp*启动子已经融合到染色体上。
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| 图 3 slnN基因高表达株的PCR鉴定 Figure 3 Identification of slnN gene over-expression strain by PCR. M: DNA marker; lane 1–2: Amplification by using the WT genome as a template; lane 3–4: Amplification by using the slnNOE genome as a template. |
| 图选项 |
2.3 不同slnN基因突变株的抑菌实验 采用生物指示试验(枯草芽孢杆菌)，检测白色链霉菌出发菌(WT)与slnNDM、slnNCOM、slnNOE三种突变菌株之间抑菌效果的比较。结果发现slnNDM菌株的抑菌圈比WT明显增加(图 4)，而在slnN基因高表达后，slnNOE菌株中抑菌圈比WT明显减小。回补株slnNCOM的抑菌圈与WT接近。上述实验现象表明：slnN基因可能是一个负调控基因，其高表达对盐霉素的生物合成有一定的抑制作用，但不会完全抑制；而slnN基因缺失后会明显增加盐霉素的生物合成，说明slnN基因的缺失可以解除其对某些靶基因的阻遏作用。
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| 图 4 WT与slnN基因不同突变株之间的抑菌圈比较 Figure 4 Comparison of inhibition zones between WT and slnN gene mutants. A: WT; B: slnNDM; C: slnNOE; D: slnNCOM. |
| 图选项 |
2.4 不同菌株的发酵实验 从摇瓶发酵实验结果可以看出，slnN基因缺失株(slnNDM)的盐霉素产量明显比出发菌的产量要高，产量提高约35%左右；而slnN基因高表达株(slnNOE)中，发现与出发菌株的产量相比是明显降低的，盐霉素产量下降最大达43%左右(如图 5所示)。其发酵结果与抑菌圈实验结果相符，说明slnN基因可能属于一个负调控基因，其对盐霉素的产生具有某种程度的抑制作用，但又不会完全抑制。
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| 图 5 WT与slnNDM、slnNOE菌株之间的盐霉素产量比较 Figure 5 Comparison of salinomycin production between WT, slnNOE and slnNDM strains. |
| 图选项 |
2.5 slnN基因敲除株与过表达株的qRT-PCR分析 在前期对slnN基因的Protein BLAST比对分析发现，该基因属于Mar家族的调控基因，但是MarR家族调控基因既可以是正向调控，又可以负向调控。本研究通过前面的基因敲除和基因过表达实验验证，发现其对盐霉素的生物合成实际起负调控作用。为了进一步研究SlnN蛋白的调控机制，本实验提取WT和slnNDM两种菌株的发酵菌丝总RNA，以hrdB基因为参比基因，采用qRT-PCR的方法，研究盐霉素合成基因簇中结构基因的转录差异。结果表明，在slnN基因缺失株(slnNDM)中，发现slnO和slnA1基因的表达水平明显上调，而其他基因表达水平基本无影响。说明slnN基因的缺失可能对slnO和slnA1有较大影响(图 6)，其中slnA1是盐霉素分子骨架第一个关键的合成酶基因，并且与后续8个合成基因(slnA2–slnA9)进行共转录，该基因的表达上调意味着盐霉素骨架的合成速度将会加快。而slnO基因从生物信息学上分析其实也属于MarR家族的调节基因，其调节功能尚需进一步实验证实。
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| 图 6 WT与slnNDM菌株之间的qRT-PCR分析 Figure 6 Analysis of transcriptional level of genes involved in biosynthesis of salinomycin between WT and slnNDM strains. The relative expression level of each gene in WT was set to 1. |
| 图选项 |
而在slnN基因过表达菌株中(图 7)，qRT-PCR分析发现一方面slnO基因、slnA1基因表达水平明显降低，而slnF、slnT1的表达水平显著上调。MarR家族调节蛋白本身就是负责多药耐药表型，而本实验中slnN基因表达后既可以减慢盐霉素的生物合成速度，又可以促进盐霉素的外排，可能与菌体自身的多药耐药性有关。
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| 图 7 WT与slnNOE菌株之间的qRT-PCR分析 Figure 7 Analysis of transcriptional level of genes involved in biosynthesis of salinomycin between WT and slnNOE strains. The relative expression level of each gene in WT was set to 1. |
| 图选项 |
3 分析和讨论 SlnN属MarR家族调控因子，该家族调控因子主要与链霉菌的代谢途径、应激反应、毒力和抗生素的降解及排出有关，通常调控包括毒力在内的许多与细菌生理相关的通路[10]。MarR家族转录调控因子既可以是激活剂又可以是抑制剂，为链霉菌中单组分的响应因子，目前已有的文献对MarR家族的调控机制报道有限，且大多数MarR家族蛋白的自然配体未知[12]。本文通过slnN基因敲除实验和过表达实验，证实slnN基因对盐霉素的生物合成起负调控作用。qRT-PCR分析发现slnN基因缺失会引起slnO和slnA1基因的上调，从而加快了盐霉素的生物合成速度。而slnN基因过表达会下调slnO与slnA1基因表达，减慢盐霉素的生物合成速度。结合MarR家族调控因子的特点，推测slnN基因受其他信号物质的刺激后调控盐霉素的生物合成速度、加快盐霉素的外排，防止盐霉素过多对菌体自身的影响，但其具体的负调控机制有待进一步解析。
对于抗生素产生菌的遗传改造，在充分了解抗生素的生物合成途径与调控机制基础上，一方面可以通过增加关键结构基因的拷贝数，或对关键酶基因进行定点突变，优化酶活力，提高产物合成速率[13-14]；另一方面也可以通过对正调控基因高表达，或对负调控基因进行敲除，从而达到提高抗生素产量的目的[15]。本实验通过对slnN基因调控功能的初步研究，为下一步盐霉素高产菌株的遗传改造打下良好的基础。
致谢
特别感谢上海交通大学微生物代谢国家重点实验室白林泉教授和姜春艳博士在本实验基因组序列分析和遗传操作技术方面的指导。
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