肖辰1,2, 陆震鸣2,4, 张晓娟2,4, 王松涛5, 李德林5, 沈才洪5, 史劲松3, 许正宏1,2,4,5
1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室 生物工程学院, 江苏 无锡 214122;
2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 江苏 无锡 214122;
3.江南大学药学院, 江苏 无锡 214122;
4.江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心, 江苏 无锡 214122;
5.国家固态酿造工程技术研究中心, 四川 泸州 646000
收稿日期：2018-03-27；修回日期：2018-04-22；网络出版日期：2018-06-22
基金项目：国家“863计划”（2012AA021301，2013AA102106，2014AA021501）；国家自然科学基金（31530055）
*通信作者：许正宏。Tel/Fax:+86-510-85918206;E-mail:zhenghxu@jiangnan.edu.cn
摘要：[目的] 考察泸型酒发酵过程中酒醅细菌群落的演替规律，探讨菌群演替与环境因素变化的相关性。[方法] 采用高通量测序技术分析泸型酒酒醅细菌群落的演替规律，并运用Mantel test分析不同发酵阶段的细菌群落演替与环境因素变化的相关性。[结果] 酒醅发酵过程中有397个属的微生物，其中Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Dysgonomonas、Comamonas以及Ruminococcaceae为优势属（相对丰度>1.0%）。通过聚类分析可将酒醅发酵过程划分为3个阶段：阶段Ⅰ（0-5 d），阶段Ⅱ（6-17 d）和阶段Ⅲ（18-40 d），且3个阶段的酒醅菌群结构差异显著（P < 0.05）。Metastats分析结果表明，与阶段Ⅰ相比，阶段Ⅱ酒醅细菌群落中Lactobacillus和unclassified Lactobacillaceae相对丰度显著升高（P < 0.05），而unclassified Bacillaceae、Staphylococcus、Bacillus、unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Pseudomonas、Thermoactinomyces、Leuconostoc、Staphylococcus相对丰度显著降低（P < 0.05）。与阶段Ⅱ相比，阶段Ⅲ酒醅细菌群落中Lactobacillus相对丰度显著增长（P < 0.05），Comamonas、Acetobacter、unclassified Bacilli、Clostridium、Bacillus、Ruminococcus、unclassified Porphyromonadaceae和unclassified Streptophyta相对丰度显著下降（P < 0.05）。结果表明，阶段Ⅰ的细菌菌群演替与酒醅温度、水分和乙醇浓度变化线性相关（P < 0.05）；阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的细菌菌群演替与酒醅温度、水分、酸度、乙醇浓度均没有相关性（P>0.05）。[结论] 泸型酒酒醅中细菌群落在不同发酵阶段结构差异显著，且温度、水分以及乙醇浓度对酒醅发酵前期（0-5 d）细菌群落演替具有重要作用。
关键词：泸型酒酒醅细菌群落演替
Bacterial community succession in fermented grains of Luzhou-flavor baijiu
Chen Xiao1,2, Zhenming Lu2,4, Xiaojuan Zhang2,4, Songtao Wang5, Delin Li5, Caihong Shen5, Jinsong Shi3, Zhenghong Xu1,2,4,5
1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
3.School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
4.Jiangsu Engineering Research Center for Bioactive Products Processing Technology, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
5.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Received 27 March 2018; Revised 22 April 2018; Published online 22 June 2018
*Corresponding author: Zhenghong Xu, Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn
Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Project) (2012AA021301, 2013AA102106, 2014AA021501) and by the National Natural Science Foundation of China (31530055)
Abstract: [Objective] This study aimed to elucidate the bacterial community succession and its underlying relevance to the environmental factors in fermented grains of Luzhou-flavor baijiu. [Methods] The 16S rRNA gene amplicon sequencing analysis was applied to reveal the succession of bacterial community in the fermented grains, and Mantel test was used to correlate bacterial community succession with environmental factors. [Results] A total of 397 bacterial genera were identified in fermented grains, including Lactobacillus, Bacillus, Weissella, Dysgonomonas, Comamonas and Ruminococcaceae (relative abundance>1.0%). Fermentation process was divided into three stages:stage Ⅰ (0-5 d), stage Ⅱ (6-17 d) and stage Ⅲ (18-40 d) according to clustering analysis, and the bacterial community structure was significantly different among these three stages. Metastats analysis demonstrated that the relative abundance of Lactobacillus and unclassified Lactobacillales in stage Ⅱ was significantly higher than that in stage Ⅰ (P < 0.05), whereas the situation of unclassified Bacillaceae, Staphylococcus, Bacillus, unclassified Enterobacteriaceae, Lactococcus, Pseudomonas, Thermoactinomyces, Leuconostoc and Staphylococcus quite the reverse (P < 0.05). Compared with stage Ⅱ, the relative abundance of Lactobacillus increased in stage Ⅲ (P < 0.05), conversely, downregulation dominated Comamonas, Acetobacter, unclassified Bacilli, Clostridium, Bacillus, Ruminococcus, unclassified Porphyromonadaceae and unclassified Streptophyta (P < 0.05). Results of Mantel test indicated that the bacterial community succession in the stage Ⅰ was correlated with the dynamics of temperature, moisture, and alcohol concentration (P < 0.05), whereas no significant correlation was observed between environmental factors and bacterial community succession in the stage Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). [Conclusion] Our work demonstrated the dramatically divergent bacterial community structure in the fermented grains of Luzhou-flavor baijiu from different brewing stages. Temperature, moisture and alcohol concentration significantly correlated with the bacterial community succession in early stage of fermentation (0-5 d).
Keywords: Luzhou-flavor baijiufermented grainsbacterial communitysuccession
泸型酒是我国浓香型白酒的典型代表，具有独特的风味，深受人民群众喜爱[1-2]。泸型酒的生产以高粱为主要原料，以中温大曲为发酵剂，并通过固态发酵工艺产生丰富的白酒风味物质，包括酵母、霉菌、细菌在内的多种微生物类群参与了风味物质的合成[1-3]。
细菌在泸型酒酿造酒醅、窖泥等生产环境中广泛存在，是泸型酒酒醅发酵过程中主要的产香动力[1, 3]。近年来，研究人员已采用微生物纯培养技术对酒醅发酵过程中细菌的多样性进行了研究，分离鉴定了多种具有耐酸、耐乙醇、产己酸等特性的细菌[4-6]，但是目前对于泸型酒固态发酵全过程的细菌群落演替规律及其影响因素尚缺少深入研究[7-9]。本文采用高通量测序技术，对泸型酒酒醅发酵过程中细菌群落的演替规律进行分析，并探讨细菌群落演替与酒醅环境因素变化的相关性，为进一步阐明泸型酒发酵过程微生物酿造机理奠定研究基础。
1 材料与方法 1.1 样本采集 选取正常连续生产(30年左右)窖池，取不同发酵时间(第0、1、2、3、4、5、6、7、8、11、17、20、25、30、35和40天)，在窖池中心位置附近取样(3个平行样)，装入灭菌的塑封袋中混匀后置于-80 ℃冰箱中保存。
1.2 酒醅环境因素分析 温度测定：采用数显温度计对窖池内酒醅温度进行测定；
酒醅水分和酸度的测定：具体步骤参照沈怡方[1]固体发酵酒醅分析方法；
酒醅乙醇浓度的测定：取100 g酒醅至500 mL玻璃蒸馏器中，加蒸馏水200 mL，收集馏出液100 mL，采用DMA 35便携式密度计测定酒醅中乙醇的含量。
1.3 酒醅宏基因组提取 称取5.0 g酒醅至灭菌的陶瓷研钵中，加入液氮研磨，使酒醅呈粉末状。准确取1.0 g酒醅粉末至灭菌50 mL离心管中，加入1 mL CTAB抽提液[CTAB 2% (W/V)，NaCl 1.4 mol/L，EDTA 20 mmol/L，Tris-HCl 100 mmol/L，pH 8.0]和20 μL巯基乙醇，65 ℃恒温混匀仪振荡30 min，加入5 μL蛋白酶K (20 mg/mL)，37 ℃条件下220 r/min振荡30 min，室温6000×g离心10 min，收集上清。加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000 r/min离心10 min，取上清；加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，12000 r/min离心10 min，取上清，重复操作2次；最后向上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇-20 ℃沉淀1 h，12000 r/min离心10 min，小心倒掉液体。沉淀用预冷70%乙醇洗涤数次，12000 r/min离心10 min，收集沉淀，将洗涤后的DNA吹干，然后用100 μL TE缓冲溶液溶解，-80 ℃保存。
1.4 16S rRNA基因序列扩增及高通量测序 采用细菌通用引物P1/P2扩增酒醅中细菌16S rRNA基因V1/V3高变区(大肠杆菌16S rRNA基因位点5–534)[10]，并进行PCR产物纯化、文库建立以及上机测序[10]。
1.5 数据处理与分析 采用Mothur[11](version 1.22)对测序数据进行分析。序列质检标准：小于150 bp、平均质量得分小于20、包含模糊碱基及包含8个以上连续相同碱基。根据barcode对样本序列归类，并去除barcode以及引物，最终得到有效序列。使用UCLUST算法按照97%相似度对序列进行OTU (operational taxonomic units，可操作分类学单元)划分，并利用Greengenes数据库对各OTU进行分类学注释，并计算Shannon指数、Ace指数、Chao1指数及文库覆盖率(Coverage)。计算Bray-Curtis相异性指数并对不同样本间进行聚类分析和Metastats分析(http://metastats.cbcb.umd.edu/)。采用R (version 3.4.0) vegan软件包中(version2.4-4) Mantel test[12]分析酒醅环境因素变化与细菌群落演替的相关性。
2 结果和分析 2.1 酒醅环境因素的变化规律 泸型酒酒醅发酵过程中温度、水分、酸度和乙醇浓度的变化如图 1所示。酒醅温度随着发酵进行缓慢升高，在17 d达到29.5 ℃并维持8 d左右，25 d之后温度逐渐下降，呈现“前缓，中挺，后缓落”趋势。酒醅水分随着发酵时间持续增加，在30 d时达到最大(63.2%)，随后略有下降，这可能与泸型酒酿造后期采取的滴窖和舀黄水操作有关(将酒醅中的黄浆水滴出并排走，避免黄水味从母糟带入酒中，为后期蒸馏操作和下排发酵创造一个较好的环境)。酒醅酸度在0–20 d缓慢上升至0.18 mmol/g，随后在15 d内升高至0.27 mmol/g，随后略有下降，可能与酸类物质作为底物进一步被微生物利用，或者与乙醇进一步反应转为酯类物质有关。酒醅乙醇浓度在发酵前7 d增长缓慢，7–30 d迅速增加至3.9%，随后有所下降。
 |
| 图 1 酒醅环境因素发酵变化 Figure 1 Dynamics of environmental factors in fermented grains through fermentation. |
| 图选项 |
2.2 细菌菌群测序数据统计 通过高通量测序，在整个发酵过程样品中共获得95881条有效序列，每个样本中的有效序列见表 1。如表 1所示，发酵过程中酒醅样本中OTUs的数目为44–1127个，Ace指数为123.1–2606.8，Chao1指数为65.4–2038.7，Shannon指数为2.1–5.8。文库覆盖率(Coverage)反映测序深度是否能覆盖整个微生物群落，是否能代表样本中所有微生物的真实情况，Coverage越接近1，则表示测序数据越能完整地反映出样本中微生物群落的组成。本研究中，所有测序样本的Coverage为90.0%–99.6%，说明测序结果能基本反映泸型酒酒醅菌群组成信息。
表 1. 酒醅细菌群落测序数据统计分析 Table 1. Sequencing data of bacterial community in fermented grains
| Day | OTUs | Ace | Chao1 | Shannon | Coverage/% |
| 0 | 369 | 760.6 | 598.0 | 3.4 | 97.0 |
| 1 | 407 | 1029.5 | 711.5 | 3.5 | 96.6 |
| 2 | 1127 | 2606.8 | 2038.7 | 5.8 | 90.0 |
| 3 | 777 | 1770.2 | 1260.2 | 5.1 | 90.8 |
| 4 | 419 | 1183.7 | 791.9 | 3.7 | 95.0 |
| 5 | 751 | 1885.2 | 1264.3 | 5.0 | 92.0 |
| 6 | 395 | 1312.0 | 888.3 | 3.6 | 95.0 |
| 7 | 576 | 1514.4 | 1066.6 | 4.0 | 95.0 |
| 8 | 434 | 1018.6 | 785.0 | 3.5 | 96.9 |
| 11 | 782 | 1888.3 | 1386.7 | 4.3 | 94.8 |
| 17 | 856 | 1790.5 | 1342.6 | 3.9 | 97.0 |
| 20 | 270 | 976.5 | 604.0 | 3.0 | 96.3 |
| 25 | 596 | 1729.5 | 1192.5 | 4.4 | 92.7 |
| 30 | 462 | 1207.8 | 878.2 | 3.5 | 95.9 |
| 35 | 452 | 1328.9 | 959.0 | 3.3 | 95.5 |
| 40 | 44 | 123.1 | 65.4 | 2.1 | 99.6 |
表选项
2.3 细菌群落的发酵演替规律 泸型酒酒醅发酵过程中细菌群落(属水平)的演替规律如图 2所示。整个发酵过程中，共检测到30个细菌门类，其中以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes及Actinobacteria为优势门类，分别占总序数的75.5%、12.7%、8.2%、1.7%。
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| 图 2 酒醅发酵过程中细菌群落属水平分布 Figure 2 Genus-level distribution of bacterial community during fermentation process of fermented grains. Bacterial sequences that were not identified into greengenes database were 'unclassified' (abbreviation 'uncl'); rare groups shown as 'Others' which relative abundance of taxon was less 0.5%. |
| 图选项 |
在酒醅发酵过程中一共检测到397个属的细菌，主要为Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Dysgonomonas、Comamonas和Ruminococcus (相对丰度 > 1.0%) (图 2)。Lactobacillus的相对丰度从初始的2.1% (0 d)迅速提高至77.0% (4 d)，随后有所波动，30 d后其相对丰度保持在70.0%以上；Weissella的相对丰度从初始的46.5% (0 d)快速下降至0.4% (3 d)，并在发酵后期保持在一个较低的水平(相对丰度 < 1.0%)；Bacillus的相对丰度从初始的6.3% (0 d)迅速增长至58.6% (1 d)，随后快速降低并在发酵6 d后保持在0.5%以下，这可能与发酵过程中环境因素的变化有关，因为随着发酵进行，窖池逐渐进入厌氧和高渗环境，该环境对芽孢杆菌的生长有抑制作用；Comamonas和Ruminococcus的相对丰度在发酵第3天达到最大值(2.4%和1.5%)，并在发酵后期保持在较低水平(相对丰度 < 1.0%)；Dysgonomonas在初始阶段几乎检测不到，随发酵进行到第5天，其相对丰度达到12.5%，随后快速下降并在0.5%–4.0%变动。
2.4 细菌群落演替的聚类分析 沈怡方等[1]依据固态法酿造特点把整个白酒发酵过程划分为3个阶段：(1)主发酵期；(2)产酸期；(3)产酯期，其中主发酵期的特点是边糖化边发酵。本研究中，通过计算细菌群落的Bray-Curtis相异性指数，可将不同发酵时间的酒醅样本进行聚类，并根据聚类结果将发酵过程划分为3个阶段：阶段Ⅰ (0–5 d)，阶段Ⅱ (6–17 d)和阶段Ⅲ (18–40 d) (图 3)。通过分子方差分析(AMOVA)，所得结果表明阶段Ⅰ-阶段Ⅱ-阶段Ⅲ之间差异极其显著(P < 0.001)，阶段Ⅰ-阶段Ⅱ、阶段Ⅰ-阶段Ⅲ以及阶段Ⅱ-阶段Ⅲ之间差异非常显著(P=0.015、P=0.005、P < 0.001)。通过Metastats分析，获得各阶段酒醅细菌群落中的差异微生物(OTU水平)信息：与阶段Ⅰ相比，阶段Ⅱ酒醅细菌群落中Lactobacillus和unclassified Lactobacillaceae相对丰度显著升高(P < 0.05)，而unclassified Bacillaceae、Staphylococcus、Bacillus、unclassified Enterobacteriaceae、Lactococcus、Pseudomonas、Thermoactinomyces、Leuconostoc、Staphylococcus相对丰度显著降低(P < 0.05)。与阶段Ⅱ相比，阶段Ⅲ酒醅细菌群落中Lactobacillus相对丰度显著增长(P < 0.05)，Comamonas、Acetobacter、unclassified Bacilli、Clostridium、Bacillus、Ruminococcus、unclassified Porphyromonadaceae和unclassified Streptophyta相对丰度显著下降(P < 0.05)。
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| 图 3 基于Bray-Curtis相异性指数的发酵酒醅样本聚类分析 Figure 3 Clustering analysis of samples of fermented grains based on the Bray-Curtis dissimilarity. |
| 图选项 |
2.5 细菌群落演替与环境因素变化的相关性 不同阶段环境因素与微生物群落结构之间相关性的结果如表 2所示。
表 2. 细菌群落演替与环境因素变化的相关性 Table 2. Correlation between environmental factor dynamics and bacterial community succession in fermented grains
| Environmental factors | Bacteria a (stage Ⅰ) | Bacteria (stage Ⅱ) | Bacteria (stage Ⅲ) | |||
| r | P | r | P | r | P | |
| Temperature | 0.63 | 0.011 | –0.21 | 0.720 | –0.12 | 0.558 |
| Moisture | 0.78 | 0.004 | –0.20 | 0.675 | 0.21 | 0.283 |
| Titratable acidity | 0.36 | 0.092 | –0.20 | 0.675 | 0.09 | 0.358 |
| Alcohol concentration | 0.75 | 0.006 | –0.18 | 0.675 | –0.19 | 0.583 |
| a r, Spearman correlation coefficient; P < 0.05 indicates a significant correlation. Stage Ⅰ, 0 d to 5 d; Stage Ⅱ, 6 d to 17 d; Stage Ⅲ, 18 d to 40 d. | ||||||
表选项
阶段Ⅰ的细菌菌群演替与酒醅温度、水分和乙醇浓度变化线性相关(P < 0.05)。酒醅发酵阶段Ⅰ中，大量微生物快速繁殖和代谢，能够提高酒醅温度、改变酒醅含水量，进而又影响酒醅中不适应温度和水分变化的微生物生长代谢，影响微生物群落结构的变化。另一方面，酿酒功能微生物能够利用淀粉、蛋白等原料代谢产生有机酸、乙醇等代谢物，从而改变了酒醅酸度、乙醇浓度等环境变量，并影响了对酸度和酒精度变化敏感的微生物生长和代谢。另外，发酵阶段Ⅰ的窖池内氧气逐渐耗尽并形成厌氧环境，会对微生物生长和代谢产生重要影响，其中氧气浓度变化与菌群演替的相关性尚需要进一步研究。
阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的细菌菌群演替与酒醅温度、水分、酸度、乙醇均没有显著相关性(P > 0.05)。这可能与Mantel test属于线性分析模型相关，而本研究中发酵阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的细菌菌群演替和环境因素变化的相关性可能不是简单的线性关系。例如，发酵中后期酒醅中微生物代谢生成的有机酸、乙醇等物质会发生酯化反应，酒醅中代谢物的合成与转化分解同时存在。因此，泸型酒发酵中后期细菌群落演替与环境因素的关系较为复杂，尚需要深入研究。
3 讨论 酒醅中的微生物群落对泸型酒主体风味物质的形成具有重要作用。在前期研究中，窦晓和王涛等采用纯培养方法从泸型酒酒醅中获得103种(35个属)的细菌菌株[13-14]，Zhang等采用PCR-DGGE以及克隆文库的方法获得了泸型酒酒醅中12个属的细菌信息[15-16]，本研究采用高通量测序方法在泸型酒酒醅发酵过程中共发现397个属的细菌，进一步丰富了我们对泸型酒细菌群落组成多样性的认识。
在发酵阶段Ⅰ (0–5 d)，酒醅细菌群落主要由Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Dysgonomonas、Comamonas和Ruminococcus组成，随着发酵进行(6–40 d)，Lactobacillus逐渐成为优势微生物(相对丰度 > 70%)，这与前期研究结果一致[13-14, 16]。Lactobacillus也是酱香型白酒酒醅以及清香型白酒酒醅中的主要细菌[17-18]。芽孢杆菌(Bacillus)作为发酵阶段Ⅰ (0–5 d)主要的细菌菌群，而在发酵中后期相对丰度在0.5%以下，这与向文良等[19]和Zhang等[16]采用微生物免培养法的研究结果基本一致，而与窦晓等采用微生物纯培养方法[13]的研究结果并不一致，这可能是由于芽孢杆菌较容易分离培养，而发酵后期的乳酸菌在MRS培养基及好氧条件下较难培养有关。Weissella作为另一类主要的广泛存在于传统发酵食品中的乳酸菌[20]，主要出现在酒醅发酵的前期(0–5 d)，而在发酵后期已经很少或者检测不到，且Weissella在中温大曲中含量较高[21]，推测其可能来自大曲，而在酒醅发酵过程中逐渐减少。具有降解木质素、纤维素功能的Comamonas[22]、Dysgonomonas[23]、Ruminococcus[24]有利于降解发酵过程中谷物原料，为其他微生物提供碳源。其他在酒醅发酵过程中的菌群，Clostridium[16]的微生物能够分解有机物为有机酸、醇类物质、CO2/H2等，并且还具有生成丁酸、己酸的能力，而这些都是泸型酒的典型风味物质。因此，浓香型酒醅中细菌的多样性以及群落的组成是泸型酒风味形成的重要因素。
通过分析泸型酒酒醅发酵过程中细菌群落演替规律，发现细菌群落结构的变化具有阶段性，因此结合沈怡方等[1]对固态酿造白酒的生产实践总结，我们将酒醅发酵过程分为3个阶段(0–5 d、6–17 d和18–40 d)。前期研究发现，酸度、乙醇含量、水分含量是影响泸型酒酒醅微生物群落结构组成的主要环境因素[25]，但是对于这些环境因素在3个酿造阶段中对菌群演替的影响尚不明确。本研究结果表明温度、水分和乙醇浓度在发酵阶段Ⅰ (0–5 d)与细菌群落演替具有显著的线性相关性(P < 0.05)，其原因可能是酒醅进入窖池后细菌生长旺盛，导致酒醅温度、水分和乙醇浓度上升，因此在泸型酒生成过程中对于酒窖中温度、水分等因素的控制具有重要意义，能够直接影响白酒的产量与品质[26-27]。在阶段Ⅱ (6–17 d)和阶段Ⅲ (18–40 d)，4种环境因素变化与细菌群落演替均没有显著线性相关性(P> 0.05)，这可能与Mantel test属于线性分析模型，而本研究中发酵阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的细菌菌群演替和环境因子变化的相关性具有非线性有关。同时，发酵中后期酒醅中微生物代谢生成的有机酸、乙醇等物质会发生酯化反应，酒醅中代谢物的合成与转化分解同时存在[28]，因此酒醅酸度、乙醇浓度等环境因子的变化与细菌的生长代谢可能存在非线性相关性。另外，由于酒醅内微生物的生长代谢，窖池内氧气逐渐耗尽并形成厌氧环境，会对酒醅中微生物群落造成重要影响，因此氧气浓度变化与菌群演替的相关性需要进一步的研究。
本文利用高通量测序技术研究泸型酒发酵过程中酒醅细菌群落结构，揭示了发酵过程中酒醅丰富多样的细菌类群，并分阶段分析了与细菌群落演替具有相关性的环境因素，发现温度、水分以及乙醇浓度可能是影响前期细菌群落结构的重要环境因素，为进一步阐明泸型酒发酵过程微生物酿造机理奠定研究基础。
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