何广正1, 韩卿卿1, 徐书景1,2, 赵宝华1, 鞠建松1
1.河北师范大学生命科学学院, 河北 石家庄 050024;
2.河北师范大学旅游学院, 河北 石家庄 050024
收稿日期：2017-08-31；修回日期：2017-10-30；网络出版日期：2017-11-14
基金项目：河北省自然科学基金（C2015205212，C2016205130）；河北省高等学校科技技术研究项目（ZD2017047）；河北师范大学研究生创新资助项目（sj2016013）
*通信作者：鞠建松, Tel:+86-311-80787573;Fax:+86-311-80789794;E-mail:jujiansong@126.com
摘要：[目的]通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。[方法]利用定点突变PCR技术构建突变体，通过亲和层析法纯化酶蛋白，采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。[结果]通过定点突变PCR成功得到8个突变体，酶学特性分析发现，A172位点突变为丝氨酸（S）后酶蛋白的相对活性有所提升，但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降；S173位点突变为天门冬氨酸（D）后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15℃，半衰期大幅延长，但相对活性明显下降。[结论]丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。
关键词： 丙氨酸消旋酶 底物通道 保守氨基酸位点 定点突变 酶学特性
Function of amino acid sites in the substrate entryway of alanine racemase TtAlr from Thermoanaerobacter tengcongensis
Guangzheng He1, Qingqing Han1, Shujing Xu1,2, Baohua Zhao1, Jiansong Ju1
1.College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei Province, China;
2.College of Tourism, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei Province, China
Received 31 August 2017; Revised 30 October 2017; Published online 14 November 2017
*Corresponding author: Jiansong Ju, Tel: +86-311-80787573; Fax: +86-311-80789794; E-mail: jujiansong@126.com
Supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2015205212, C2016205130), by the Foundation of Hebei Educational Committee (ZD2017047) and by the Science Fundation of Hebei Normal University (sj2016013)
Abstract: [Objective]In order to study the function of amino acid sites A172 and S173 in the substrate entryway of alanine racemase TtAlr from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4.[Methods]The mutant vectors were constructed by site-directed mutagenesis PCR using plasmid pET-TtAlr as the template and expressed in E. coli BL21(DE3). The enzymes were purified by affinity chromatography. D-amino acid oxidase coupling method was used to detect enzyme activity and stability of each mutant and wild type TtAlr proteins.[Results]Both TtAlr and mutant proteins were expressed and purified successfully. Results of enzymatic properties show that A172 site mutation could improve the catalytic activity of TtAlr, but the stability of enzyme proteins decreased significantly. Likewise, S173 site mutation could increase the optimal temperature of TtAlr, prolonged the half-life of the enzyme and improved its stability, but the catalytic activity of the enzyme decreased significantly.[Conclusion]A172 and S173 amino acids residues in the substrate entryway of alanine racemase TtAlr were the key sites that played a major role in the catalytic activity and stability of the enzyme protein.
Key words: alanine racemase substrate entryway conservative amino acid sites site-directed mutagenesis enzymatic properties
丙氨酸消旋酶(Alanine racemase，Alr，EC 5.1.1.1)是以Pyridoxal 5′-phosphate (PLP)为辅酶催化L-丙氨酸和D-丙氨酸旋光结构互换的一类异构酶[1]。丙氨酸消旋酶主要分布于原核生物中，其产物D-丙氨酸参与细菌的生长代谢以及细菌孢子的形成和萌发[2-3]，且D-丙氨酸是细胞壁肽聚糖层的重要组成成分[4-5]，以D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽的形式参与细胞壁肽聚糖的形成[6]，因此，对于原核生物来说丙氨酸消旋酶是维持细菌生命活动所必需的酶蛋白之一[7-9]。由于哺乳动物细胞中不存在丙氨酸消旋酶，因此，以丙氨酸消旋酶为靶标，基于其分子机制寻找新型抗菌药物[10-11]，从而阻止细菌细胞壁形成，使细胞裂解死亡[6]，正成为抗生素药物研发的新热点而受到国内外广泛关注[3, 10-11]。
D-丙氨酸在食品、化妆品和医药等行业应用较为广泛[12]。在食品方面，D-丙氨酸主要作为甜味剂和增味剂，改善食品甜度及风味；在化妆品方面，作为主要的保湿因子，可替代传统的油脂类保湿剂，消除化妆品异味，提高质量；在医药方面，D-丙氨酸是维生素B6的前体，可用于VB6和抗生素等药物的合成和生产[12]。目前工业生产D-丙氨酸的方法较多，不过，由于化学合成法的产品产率和光学纯度比较低，后续拆分工艺繁琐；而酶法合成虽然方法简便易行，污染排放少，但筛选或改造获得稳定性好、催化活性高的酶蛋白则是当前面临的主要问题。
根据文献报道，丙氨酸消旋酶底物通道中间层和内层是由8个高度保守的氨基酸残基构成的[9-11]。同源序列比对发现，腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis) MB4中的两个丙氨酸消旋酶TtAlr (GenBank登录号AAM24437)和TtDadX (GenBank登录号AAM25327)的底物通道内分别含有两个非保守氨基酸位点(TtAlr：S173、Q360；TtDadX：S171、H359)[13-14]。前期研究发现，将TtAlr中Q360位点突变为保守的酪氨酸(Y)后，突变体Q360Y的表观二级常数(kcat/Km，4.91 s-1/(mmol/L))约为野生型的18倍，研究表明Q360位点可参与影响酶蛋白催化活性[13]；当将TtDadX中相同空间位置的氨基酸残基H359突变为酪氨酸Y后，导致酶蛋白几乎丧失了活性，进一步研究发现该位点与另一个非保守位点S171共同参与了酶蛋白与辅酶PLP的结合作用，当H359突变为Y359后，导致辅酶PLP与酶蛋白无法稳定结合，最终导致酶蛋白催化活性丧失[14]。从这些研究结果可以推测，腾冲嗜热厌氧杆菌丙氨酸消旋酶底物通道中的非保守位点大都直接或间接参与了酶蛋白催化反应。本研究基于前期的研究结果，以TtAlr及相应突变体为研究对象，通过定点突变技术构建突变体，研究其酶学特性，探究丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内A172和S173位点的作用机理，为定向改造获得高活性、高稳定性的D-丙氨酸生物合成元器件奠定理论基础。
1 材料和方法 1.1 菌株、质粒和试剂 大肠杆菌(Escherichia coli) DH10B用于基因克隆，E. coli BL21 (DE3)用于蛋白表达；质粒pET-TtAlr及其在360位点的两个突变体pET-Q360Y和pET-Q360H由本实验室构建[13]。
Pyrobest DNA polymerase、QuickCut enzyme和DNA marker购自大连宝生物公司，Plasmid extraction kit购自Omega公司，Ni-NTA agarose购自Qiagen公司，Low molecular weight standards购自生工生物工程(上海)股份有限公司，4-Aminoantipyrine、N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt (TOOS)、Peroxidase和D-amino acid oxidase购自Sigma公司；其他常用试剂均为分析纯。
1.2 定点突变所用引物 根据丙氨酸消旋酶TtAlr待突变位点及周边序列信息，利用Primer Premier 5软件设计突变引物，表 1灰色背景所示的字母为待突变的核苷酸。引物由上海杰瑞公司合成。
表 1. 本研究所用引物 Table 1. The primers used in this study
| Primers | Sequences (5'→3') | Description |
| A172S-F01 | CATTTTGCTGCCTCATCCGAAGA | GCA→TCA |
| A172S-R01 | TCTTCGGATGAGGCAGCAAAATG | TGC→TGA |
| S173D-F01 | TGCTGCCGCAGACGAAGATGAT | TCC→GAC |
| S173D-R01 | ATCATCTTCGTCTGCGGCAGCA | GGA→GTC |
| The mutated sites are grey backgroud. | ||
表选项
1.3 突变体构建 按照Site-directed mutagenesis kit技术流程，以质粒pET-TtAlr及相应突变质粒为模板，PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，16个循环；72 ℃ 10 min。
PCR产物用限制性内切酶Dpn Ⅰ 37 ℃孵育酶切后，以化学转化法将其转入E. coli DH10B感受态细胞中，培养于LB固体琼脂培养基(Kana+)上；随机挑取菌落，通过菌落PCR法筛选阳性克隆，并送样测序验证。
1.4 酶蛋白的表达和纯化 将质粒pET-TtAlr或含突变基因的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中，于LB液体培养基(Kana+)中扩培至OD600为0.5左右，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于30 ℃诱导培养5 h，离心收集菌体。
将菌体重悬于细胞裂解缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Imidazole)中，采用超声波破碎法破碎细胞，4 ℃ 8000 r/min离心10 min，将上清通过Ni-NTA亲和层析柱分离、纯化酶蛋白，通过透析法去除高浓度的咪唑和NaCl后分装保存于-80 ℃。采用12.5%的SDS-PAGE检测蛋白表达和纯化情况，采用BCA protein assay kit (TaKaRa)测定蛋白浓度。
1.5 酶学特性分析 丙氨酸消旋酶的活性分析采用消旋和氧化(D-氨基酸)两步反应法进行测定[15-16]。
消旋反应：在200 μL反应体系中加入终浓度为50 mmol/L L-丙氨酸、10 μmol/L PLP、50 mmol/L Phosphate buffer (pH 7.4)以及20μL酶液，于37 ℃反应10 min。加入25 μL 2 mol/L HCl中止反应，随即以25 μL 2 mol/L NaOH中和多余的酸，14000 r/min 4 ℃高速离心10 min后，取上清待用。以相同体积的缓冲液代替酶蛋白进行消旋反应作为空白对照。
氧化反应：在200 μL反应体系中加入终浓度为200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 mg/mL 4-Aminoantipyrine、0.1 mg/mL TOOS、2 units Peroxidase、0.1 unit D-amino acid oxidase以及100 μL消旋反应上清，于37 ℃孵育20 min，采用微孔板分光光度计(BioTek，USA)测定OD550。一个酶活力单位(unit)定义为1 min内转化生成1 μmoL D-丙氨酸所需的酶量。
1.5.1 突变蛋白的相对活性: 按照丙氨酸消旋酶活性分析方法，以L-丙氨酸为底物对丙氨酸消旋酶TtAlr以及突变酶蛋白进行催化活力分析。首先确定各消旋酶蛋白的浓度，分别在反应体系中加入同等量的消旋酶蛋白进行催化反应，检测反应生成的产物量并判断TtAlr与突变消旋酶的相对催化活力。设定野生型蛋白TtAlr的相对活力为100%，比较其他几种突变消旋酶的催化活力，以变性失活的酶蛋白作为空白对照。
1.5.2 突变蛋白的稳定性: 将丙氨酸消旋酶TtAlr和突变酶蛋白分别置于Britton-Robinson缓冲溶液(pH 10.38)中，65 ℃孵育不同时间，待热处理结束，向热处理的消旋酶中，加入L-丙氨酸(终浓度50 mmol/L)和PLP (终浓度10 μmol/L)混合液开始消旋反应。通过测定不同热处理时间的丙氨酸消旋酶的活性，确定各酶蛋白在pH 10.38 (BR buffer) 65 ℃条件下的热稳定性情况。空白组以不做热处理的酶蛋白的催化活力为100%。
2 结果和分析 2.1 同源序列比对及突变位点确定 Cou?ago等通过解析来自Bacillus anthracis (Ames)的丙氨酸消旋酶AlrBax三维结构发现，该酶的底物通道中间层和内层由8个高度保守的氨基酸残基构成[10]。利用ClustalX和在线软件ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)对腾冲嗜热厌氧菌(T. tengcongensis MB4)中丙氨酸消旋酶(TtAlr、TtDadX)、Bacillus anthracis (Ames)的BaxAlr、Pseudomonas aeruginosa的PaoDadX和Bacillus pseudofirmus OF4的OF4DadX进行同源序列比对并分析其底物通道氨基酸位点的保守性发现，TtAlr的底物通道内有6个氨基酸残基严格保守(A172、Y268、Y287、R293、R313、I358)，存在2个非保守的氨基酸位点(S173和Q360)[13]，TtDadX同样存在着2个非保守氨基酸残基(S171和H359)[14]，其余6个位点(D172、Y267、Y286、R292、R312、I357)严格保守(图 1)。
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图 1 基于丙氨酸消旋酶二级结构的氨基酸序列比对 Figure 1 Structural-based amino acid sequences alignment of alanine racemases. Amino acid sequences of alanine racemase from Bacillus anthracis (Ames) (BaxAlr), Pseudomonas aeruginosa (PaoDadX), and Bacillus pseudofirmus OF4 (OF4DadX) are aligned with TtAlr and TtDadX from T. tengcongensis MB4. Amino acids are numbered and secondary structures are labeled, the eight strictly conserved amino acids are marked with an arrow ( |
| 图选项 |
研究发现，蛋白TtAlr中Q360位点突变为酪氨酸(Y，保守氨基酸)或组氨酸(H，模拟TtDadX中非保守位点H359)后突变体的催化活性得到了大幅提升[13]，而对TtDadX中相同空间位置的H359进行研究发现，该位点与非保守位点S171协同参与稳定酶蛋白与辅酶PLP的结合[14]，而S171位点在空间位置上与TtAlr底物通道内保守的A172位点相对应，TtDadX中发挥协同作用的S171和H359都为非保守氨基酸，而TtAlr中A172为保守氨基酸残基，同时发现A172位点附近的S173位点为非保守氨基酸，推测TtAlr中A172和S173位点可能都与Q360位点存在相互作用。为了验证上述推论，选取TtAlr中与S171空间位置相对应的保守位点A172和其附近非保守的S173位点作为研究对象，利用定点突变技术，将上述A172和S173位点分别突变为丝氨酸(S，模拟S171位点)和天门冬氨酸(D，保守氨基酸)，通过TtAlr中A172和S173两位点与Q360位点相结合，检测突变体的催化活性，探究A172、S173及Q360三者之间的相互作用情况，以确定TtAlr底物通道内A172和S173位点的作用机理。
通过定点突变PCR、去甲基化、双酶切以及序列测定等实验，成功构建了8个突变质粒：pET-A172S、pET-A172S Q360Y、pET-A172S Q360H、pET-A172S S173D Q360Y、pET-A172S S173D Q360H、pET-S173D、pET-S173D Q360Y、pET-S173D Q360H。
2.2 丙氨酸消旋酶的诱导表达和纯化 将pET-TtAlr、pET-Q360Y、pET-Q360H以及上述8个突变质粒转入E. coli BL21 (DE3)感受态细胞中，经扩培、IPTG诱导、菌体收集、超声波破碎后离心取上清，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化、脱盐，获得了TtAlr、Q360Y、Q360H及S173D等共11个酶蛋白。经12.5%的SDS-PAGE检测，所有酶蛋白均在45.0-66.2 kDa之间有单一且清晰的条带，约55 kDa (图 2)，与理论分子量基本一致。
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| 图 2 丙氨酸消旋酶蛋白纯化后SDS-PAGE检测 Figure 2 SDS-PAGE identification for purification of alanine racemases. Lane 1: A172S; lane 2: A172S&Q360Y; lane 3: A172S&Q360H; lane 4: S173D; lane 5: S173D&Q360Y; lane 6: S173D&Q360H; lane 7: A172S&S173D&Q360Y; lane 8: A172S&S173D&Q360H; lane 9: Q360Y; lane 10: Q360H; lane 11: TtAlr; M: Low molecular weight standards. |
| 图选项 |
2.3 酶学特性分析
2.3.1 最适反应温度和pH: 在不同pH (7.0-12.0)或不同温度(50-90 ℃)条件下测定TtAlr和突变体蛋白的相对活性，如图 3所示，野生型蛋白TtAlr和5个突变体蛋白(Q360Y、Q360H、A172S、A172S&Q360Y和A172S&Q360H)在不同温度或pH下的相对活性趋势基本一致，最适反应pH和温度均为10.38和65 ℃；而其余5个突变体S173D、A172S&S173D&Q360Y、A172S&S173D&Q360H、S173D&Q360Y和S173D&Q360H的最适反应pH及温度则为11.20和80 ℃ (图 3-A，B)。图 3结果显示含有S173位点突变的酶蛋白最适反应温度均比野生型TtAlr提高15 ℃，说明该位点可能是影响酶蛋白最适反应温度的关键位点。
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| 图 3 突变消旋酶的酶学特性 Figure 3 Enzymatic properties of mutated proteins. A: Optimal pH; B: Optimal temperature. SY: A172S&Q360Y; SH: A172S&Q360H; DY: S173D&Q360Y; DH: S173D&Q360H; SDY: A172S&S173D&Q360Y; SDH: A172S&S173D&Q360H. The data were presented as the mean ± SD, and the experiments were performed in triplicates with similar results using three independent purified proteins. |
| 图选项 |
2.3.2 突变消旋酶的相对活性: 经BCA试剂盒测定各蛋白浓度后，以野生型TtAlr为标准，取等量蛋白测定其相对活性，结果如图 4所示。野生型蛋白TtAlr的相对活性为100.00%，单点突变体Q360Y的相对活性较高(210.58%)，其次是Q360H (164.74%)和A172S (154.72%)，而突变体S173D的相对活性最低，仅为野生型的24.44%；当172位点由丙氨酸(A)突变丝氨酸(S)后导致突变体酶蛋白的相对活性均有所提高，如A172S (154.72%)、A172S&Q360Y (218.76%)和A172S&Q360H (179.65%)；当将173位点的丝氨酸(S)突变为天冬氨酸(D)后则导致突变体酶蛋白的相对活性均大幅下降，如S173D (24.44%)、S173D&Q360Y (169.85%)、S173D&Q360H (123.79%)、S173D&A172S&Q360Y (172.19%)和S173D&A172S&Q360H (131.49%) (图 4)。这些结果说明，172、173以及360位点均可能是影响酶蛋白催化活性的关键位点。
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| 图 4 突变消旋酶的相对活性 Figure 4 Relative activity of mutated alanine racemases. SY: A172S&Q360Y; SH: A172S&Q360H; DY: S173D&Q360Y; DH: S173D&Q360H; SDY: A172S&S173D&Q360Y; SDH: A172S&S173D&Q360H. The data were presented as the mean ± SD, and the experiments were performed in triplicates with similar results using three independent purified proteins. |
| 图选项 |
2.4 突变消旋酶的稳定性 通过测定在65 ℃下处理不同时间后各蛋白的相对活性确定酶蛋白的半衰期，即热稳定性。从图 5可以看出，野生型TtAlr的半衰期为2.5 h，突变体Q360Y的半衰期为3 h，Q360H的半衰期为1.5 h，以及A172S的半衰期为30 min；而突变体A172S&Q360H的半衰期仅为4.5 min，其次是A172S&S173D&Q360H，其半衰期为9 min；突变体A172S&Q360Y和A172S&S173D&Q360Y的半衰期也有所增加，分别为45 min和67 min。从这些结果可以看出，当172位点由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)时酶蛋白的半衰期急剧下降，如A172S&Q360H和A172S&Q360Y的半衰期均比Q360H和Q360Y的半衰期显著缩短；而当173位点由丝氨酸(S)突变为天门冬氨酸(D)后，突变体蛋白的半衰期则有所延长，如A172S&S173D&Q360H的半衰期是A172S&Q360H的1倍，A172S&S173D&Q360Y的半衰期则比A172S&Q360Y的半衰期长了近20 min。由于突变体S173D、S173D&Q360Y、S173D&Q360H这3个酶蛋白较为稳定，在65 ℃下处理7 h，其酶蛋白活性仍保持在83.6%、76.1%和78.1%，蛋白稳定性与野生型TtAlr、Q360Y、Q360H及其他突变体相比得到了显著提高(结果未显示)。
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| 图 5 丙氨酸消旋酶及突变体的稳定性 Figure 5 The stability of mutanted alanine racemases. SH: A172S&Q360H; SDH: A172S&S173D&Q360H; SY: A172S&Q360Y; SDY: A172S&S173D&Q360Y. The data of every spots were presented as the mean ± SD, and the experiments were performed in triplicates with similar results using three independent purified proteins. |
| 图选项 |
3 讨论 丙氨酸消旋酶可分为两类：生物合成型(Alr)和分解代谢型(DadX/B)，前者参与细胞壁肽聚糖层D-Ala的合成，后者参与L-Ala分解代谢。由于该基因是细菌细胞壁合成所必需的基因之一[17]，而在高等生物体内尚未发现丙氨酸消旋酶，因此可以将丙氨酸消旋酶作为抗菌药物筛选的靶标[10]。
本实验研究的腾冲嗜热厌氧菌(T. tengcongensis MB4)中含有分解型和合成型两种消旋酶(TtDadX、TtAlr)，通过同源序列比对发现这两个丙氨酸消旋酶的底物通道内分别含有2个非保守的氨基酸位点(TtDadX：S171、H359；TtAlr：S173、Q360)[13]。Patrick等研究Geobacillus stearothermophilus中丙氨酸消旋酶底物通道内氨基酸位点Y354时，发现该Y354位点参与调控底物特异性[18]；Sun等将TtAlr中Q360突变为保守的酪氨酸(Y)后，突变体Q360Y的表观二级常数比野生型提高了18倍[13]，说明该位点也可能是影响酶蛋白催化活性的关键位点。Xue等通过定点突变技术探究了TtDadX底物通道内层两个非保守的氨基酸位点(S171和H359)之间的相互作用，发现2个位点相互协同参与稳定酶蛋白与辅酶的结合[14]。Wu等研究了E. coli中丙氨酸消旋酶(EcAlr)底物通道中间层氨基酸位点D164的作用机理，发现该位点与底物通道外层的E165以及2个带正电的氨基酸位点R280和R300一起在底物定位中起着重要作用[5]。这些研究说明底物通道中间层和内层各氨基酸位点对于酶蛋白的催化作用是必不可少的，它们分别起着或大或小的作用。
本研究通过定点突变将TtAlr中的173位点由丝氨酸(S)突变为天门冬氨酸(D)后，尽管突变体S173D的相对活性仅为野生型的24.44%，但该突变体蛋白的最适反应温度比野生型提高15 ℃，且含有该位点突变的突变蛋白A172S&S173D&Q360H (半衰期为9 min)和A172S&S173D&Q360Y (半衰期为67 min)的热稳定性均相应地比A172S&Q360H (半衰期为4.5 min)及A172S&Q360Y (半衰期为45 min)有所提高。同样，含有S173D突变的酶蛋白S173D、S173D&Q360Y、S173D&Q360H与TtAlr、Q360Y、Q360H相比，尽管酶活力下降，但其热稳定性大幅提升(65 ℃处理7 h后，相对酶活仍然超过80%)，这可能是因为S173位点突变为D后，该位点的侧链由羟基基团变为羧基基团，增加了一个氢键受体，增强了该位点与周边各分子间的相互作用力，提高了酶蛋白的稳定性。Im等通过解析来自Streptococcus pneumoniae的丙氨酸消旋酶SpAlr的三维结构，发现了该蛋白中与TtAlr的S173相对应的氨基酸位点D170通过氢键与周边的水分子及Y263、Y282′、R288′、R307′、Y352共同作用形成一个六边形氢键网络结构，作者认为该结构与酶蛋白的结构稳定性、底物移动或质子转移相关，参与影响酶蛋白的结构稳定性或催化活性[11]。这个发现与将TtAlr中S173突变为D后导致突变体蛋白的稳定性和催化活性都发生改变的结果相吻合。而当将TtAlr中的172位点由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)后，突变体蛋白的相对酶活有所提高，但该位点突变后导致其半衰期大幅下降(图 5)。陈路清等认为丝氨酸和苏氨酸通常通过氢键和蛋白质周围的水分子发生相互作用，结合的水分子在高温下释放出来导致蛋白质和水分子结合的局部结构不稳定从而导致整个蛋白不稳定[19]。在TtAlr酶蛋白中，由A172位点参与的突变(S172)，导致突变酶蛋白催化活力提高，热稳定性大幅下降；而S173位点参与的突变(D173)，提高突变酶蛋白的最适反应温度和热稳定性，降低其催化活性；总之，丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内A172和S173两位点都是影响酶蛋白的催化活性和稳定性的关键位点。
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