王丹丹1,2, 林青2, 欧提库尔·玛合木提2, 杨红梅2, 娄恺2
1.新疆大学生命科学与技术学院, 新疆 乌鲁木齐 830046;
2.新疆农业科学院微生物应用研究所, 新疆 乌鲁木齐 830091
收稿日期：2017-09-18；修回日期：2017-12-21；网络出版日期：2018-01-08
基金项目：国家自然科学基金（31660028）
*通信作者：娄恺, E-mail:loukai@mail.tsinghua.edu.cn
摘要：[目的]采集新疆塔克拉玛干沙漠腹地和周围沙尘暴源区空气样品，对不同样点沙尘暴发生前期、中期、后期空气细菌进行群落结构解析。阐明新疆沙尘暴源区空气细菌种属特征和群落多样性动态变化规律。[方法]基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序方法，构建16S rRNA小片段文库进行测序。[结果]塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌主要分为4门37个属，Proteobacteria占67.6%、Bacteroidetes占17.6%、Actinobacteria占11.7%、Firmicutes占2.9%；在属水平上，新疆沙尘暴源区有8个不同优势属，非度量多维尺度分析表明，不同样点在不同时期的细菌群落组成差异极显著；典范对应分析表明，环境因子对沙尘暴源区空气细菌多样性的影响大小为：海拔>纬度>经度>湿度>气压>温度，且差异不显著。[结论]新疆沙尘暴源区空气细菌群落多样性和丰富度高；不同样点沙尘暴前期、中期、后期的空气细菌群落组成差异极显著；沙尘暴对5个源区固有细菌群落影响差异极显著。
关键词： 沙尘暴源区 高通量测序 细菌多样性
Diversity of airborne bacterial communities in sandstorm area of Taklimakan
Dandan Wang1,2, Qing Lin2, OTKUR·Mahmut2, Hongmei Yang2, Kai Lou2
1.College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China;
2.Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Received 18 September 2017; Revised 21 December 2017; Published online 8 January 2018
*Corresponding author: Lou Kai, E-mail:loukai@mail.tsinghua.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31660028)
Abstract: [Objective] Aimed to clarify the dynamic changes of airborne bacterial species and community diversity in sandstorm source areas in Xinjiang, we collected air samples from the dust source areas in the hinterland of Taklimakan and surroundings, and analyzed the community structure of airborne bacteria in the early, middle and late stages of sandstorm occurrence. [Methods] Based on the Illumina HiSeq sequencing platform, we constructed the 16S rRNA small fragments library by sequencing using double-end sequencing. [Results] The dust storm source bacteria belonged to 37 genera and affiliated to 4 phyla, and Proteobacteria accounted for 67.6%, Bacteroidetes accounted for 17.6%, Actinobacteria accounted for 11.7%, Firmicutes accounted for 2.9%. At genus level, there were altogether 8 different dominant genera in Xinjiang sandstorm source area, and the Non-metric Multidimensional Scaling result showed the significant differences in bacterial community composition at different sampling sites in different periods. The canonical correspondence analysis showed that the influence of airborne bacterial diversity in sandstorm area with environmental factors was as follows:altitude > latitude > longitude > humidity > air pressure > temperature with no significant difference. [Conclusion] The diversity and abundance of airborne bacterial community in the sandstorm source area in Xinjiang were very high. The differences of air bacterial community composition in the early, middle and late stages of sandstorm were significant in different areas. The influence of sandstorm on the indigenous bacterial communities in the five source areas was extremely significant.
Key words: sand storm source area high throughput sequencing diversity of bacteria
空气微生物指悬浮在空气中的细菌、真菌、病毒和真菌孢子等，主要来源于土壤、水体表面、动植物表面。随着空气污染的日益严重，悬浮在空气中的固体颗粒污染物也随之增多。空气悬浮物中微生物的多样性和丰富度与温度、空气湿度、气候、海拔、紫外线指数、CO2浓度等环境因子有关。空气属于寡营养环境，不利于微生物的生长、代谢和繁殖。2016年Smets等的研究表明，空气中存在一定量的微生物，且代谢能力强，主要是一类非病原性腐生菌；空气微生物不仅具有生态效益，还与空气质量和人类疾病密切相关[1-4]。沙尘暴多发生在干旱或半干旱地区，可根据能见度分为浮尘、扬沙、沙尘暴、强沙尘暴，全球沙尘暴源区每年可向大气中投放3亿t沙子[5]。
新疆塔克拉玛干沙漠位于新疆南部塔里木盆地中心，是中国第一大沙漠和世界第二大流动性沙漠，面积33.76万km2，每年春秋两季，沙漠周围地区及腹地沙尘天气平均多达90 d，对当地以及沙尘暴所到区域的环境、农业生产及居民健康造成了不可评估的影响[6-7]。传统生物技术研究空气微生物多样性存在许多局限性。传统的限制性末端分析技术在引物、限制性酶的选择和易形成假末端限制性片段而导致过多地估计了沙尘空气细菌的多样性。因此本研究利用二代测序技术[8-9]，通过构建16S rRNA小片段基因文库，对新疆沙尘暴源区空气细菌进行深度测序，以塔克拉玛干沙尘暴源区(尉犁、若羌、且末、民丰和塔中地区)为研究对象，采集沙尘暴发生前期、中期、后期空气样品。沙尘暴是一类流动性较强的生境，因此本研究采集5个样点沙尘的不同时期空气样品，比较不同时期和不同样点空气细菌群落的动态变化特征。并结合前人研究结果，解析塔克拉玛干沙漠腹地和周边沙尘暴空气细菌群落多样性，为沙尘暴灾害的预警和沙尘暴空气细菌的区域性研究提供基础数据。
1 材料和方法 1.1 材料 液体撞击式空气气溶胶采样器；采样管；恒温水浴锅；EP管；离心机；PBS缓冲液(配方：NaCl 135 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，KH2PO4 1.5 mmol/L，K2HPO4 8 mmol/L，pH 7.2，121 ℃灭菌30 min)；GTE buffer(配方：Tris Cl 5 mmol/L，EDTA mmol/L，蔗糖0.075 mmol/L，pH 8.0，115 ℃灭菌15 min)；30% SDS；3% CTAB；10 mg/mL蛋白酶K；酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)；预冷70%乙醇。
1.2 空气微生物样品的采集 2017年3月30日至4月6日为沙尘天气高发期，采集新疆塔克拉玛干沙漠周围及腹地5个地区沙尘天气前、中、后期空气样品。利用液体撞击式气溶胶采样器[10]，将20 mL PBS缓冲液装入玻璃采样管中，调节空气流量11 L/min，设置计时采样时间为20 min，采集塔克拉玛干沙漠南缘地区尉犁、若羌、且末、民丰和腹地塔中沙尘天气发生不同时期空气微生物样品各80 mL。采集后的样品置于–20 ℃下保存备用。采样地信息和采样位点分布图见表 1。
表 1. 采样点环境信息 Table 1. Environment information of sampling spots
| Regions | Longitude | Latitude | Sampling weather | Humidity/% | T/℃ | Altitude/m |
| YL | 08°18.145′ | 40°44.497′ | Dust-storm | 14 | 20 | 851 |
| RQ | 088°09.925′ | 39°01.104′ | Sandstorm | 16 | 24 | 908 |
| MF | 085°31.968′ | 38°08.410′ | Sandstorm | 23 | 21 | 1265 |
| QM | 083°11.442′ | 37°20.054′ | Sandstorm | 8 | 16 | 1365 |
| TZ | 083°37.753′ | 39°02.206′ | Dust-storm | 22 | 16 | 1115 |
| YL-Yuli(尉犁); RQ-Ruoqiang(若羌); MF-Minfeng(民丰); QM-Qiemo(且末); TZ-Tazhong(塔中). | ||||||
表选项
1.3 CTAB法提取总DNA及PCR扩增 将采集到的空气PBS缓冲液解冻后用0.22 μm滤膜进行过滤，用GTE Buffer洗脱后提取总DNA并检测纯度[11-12]。扩增体系如下：Phusion Master Mix (2×) 15 μL；Primer (2 μmol) 3 μL；模板DNA 0.1 μL；H2O 2 μL (模板DNA：总DNA样品溶液，加dd H2O水稀释到1 ng/L；引物：使用16S rRNA V4区Barcode序列(ACAGCAGA, TTCACGCA)的特异引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、806R：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。反应程序：98 ℃ 60 s；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min，得到PCR产物后进行质量检测。
1.4 信息分析步骤 通过Hiseq 2500平台进行测序(诺禾致源生物信息科技有限公司，天津)。测序得到的原始数据进行：(1) Tags截取(默认质量阈值为9)碱基数(默认长度值为3)的第一个，(2)得到的Tags数据集进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。利用Uparse v7.0.1001进行操作分类单元OTUs (定义97%一致性)的聚类和物种分类分析。使用Qiime软件1.7.0中的blast方法与Unit数据库(http://unite.ut.ee/)进行物种注释分析和物种的α多样性指数和β多样性指数分析。使用R软件2.15.3绘制NMDS图和CCA图[13-15]。
2 结果和分析 2.1 16S rRNA序列及OTUs分析 序列分析得到14个样品16S rRNA原始序列共计1296886；进行数据优化后得到14个样品有效序列共计1200503，有效序列比例为92.57%，有效OTUs为1447。将≥97%的序列一致性定义为一个OTU，表明空气微生物样品序列数量在3500时，稀释曲线趋于平缓，说明沙尘暴空气微生物的取样基本合理，14个样品测序相关数据如表 2所示，样品有效序列比例均高于90%，认为测序结果可靠合理，能较为真实地反映出沙尘暴空气细菌的群落组成[16]。
表 2. 14个样品测序数据统计表 Table 2. Sequencing data statistics of 14 samples
| Sample name | OTU numbers | Total sequence numbers | Effective sequence numbers | Effective sequence ratio/% |
| TZ1 | 109 | 109448 | 101891 | 93.10 |
| TZ2 | 118 | 98183 | 88496 | 90.13 |
| TZ3 | 104 | 64555 | 59766 | 92.6 |
| MF1 | 97 | 74289 | 68943 | 92.8 |
| MF2 | 109 | 114556 | 106474 | 92.94 |
| MF3 | 112 | 112417 | 104459 | 92.92 |
| QM1 | 102 | 103607 | 97072 | 93.64 |
| QM2 | 109 | 96481 | 90043 | 93.33 |
| QM3 | 102 | 113052 | 105185 | 93.04 |
| YL1 | 105 | 104416 | 95394 | 91.36 |
| YL2 | 128 | 62343 | 58127 | 93.24 |
| YL3 | 113 | 108601 | 100793 | 92.81 |
| RQ2 | 67 | 67997 | 60476 | 93.04 |
| RQ3 | 72 | 69875 | 63374 | 90.70 |
| 1, 2, 3 represent the early, middle and late stage. | ||||
表选项
结合14个样本的OTU注释结果进行总体分析，采用GraPhlAn[17]方法绘制沙尘暴空气细菌的群落组成和物种分类树(图 1)。图 1表明，沙尘暴源区空气细菌群落包括海洋杆菌属(Pontibacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠-志贺氏杆菌属(Escherichia-Shigella)、微杆菌属(Microbacterium)等37个属。其中8个优势属为微杆菌属(Microbacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海洋杆菌属(Pontibacter)和根瘤菌属(Rhizobium)。
 |
| 图 1 基于OTUs注释结果的空气细菌群落等级树图 Figure 1 Airborne bacterial community tree based on OTUs annotation results. The circles in the picture represent different classification levels from inside to outside. The size of the circles is directly proportional to the abundance of the species. Pink circle-Proteobacteria; Blue circle-Bacteroidetes; Orange circle-Actinobacteria; Purple circle-Firmicutes. |
| 图选项 |
2.2 α多样性指数分析 α多样性指数指示了5个不同沙尘暴源区生境内物种多样性，使用Qiime软件计算(表 3)。沙尘暴源区空气细菌群落chao1指数平均值为115.65，Shannon指数平均值为3.76。不同样品采集地细菌群落多样性，均匀度和丰富度等方面存在差异，塔中地区细菌多样性和丰度平均值最高，尉犁地区、民丰地区、且末地区次之，若羌地区最低[18-22]。
表 3. 不同样品的α多样性指数表 Table 3. Table of index of diversity of different samples
| Sample name | Shannon index | Simpson index | Chao1 index | ACE index | Goods-coverage |
| TZ1 | 4.282 | 0.920 | 121.667 | 122.033 | 1 |
| TZ2 | 4.524 | 0.932 | 131.364 | 134.449 | 1 |
| TZ3 | 3.798 | 0.882 | 114.111 | 113.690 | 1 |
| MF1 | 3.455 | 0.855 | 104.000 | 107.801 | 1 |
| MF2 | 3.615 | 0.859 | 125.000 | 132.401 | 0.999 |
| MF3 | 3.732 | 0.875 | 123.059 | 128.605 | 1 |
| QM1 | 3.600 | 0.879 | 120.100 | 121.066 | 1 |
| QM2 | 3.765 | 0.882 | 145.000 | 129.303 | 0.999 |
| QM3 | 3.044 | 0.753 | 114.400 | 119.617 | 1 |
| YL1 | 4.344 | 0.982 | 110.000 | 111.576 | 1 |
| YL2 | 3.522 | 0.851 | 133.250 | 138.761 | 1 |
| YL3 | 3.520 | 0.832 | 134.000 | 131.261 | 0.999 |
| RQ2 | 3.569 | 0.850 | 67.111 | 67.882 | 1 |
| RQ3 | 3.756 | 0.893 | 76.000 | 75.722 | 1 |
表选项
2.3 β多样性指数分析 β多样性分析是结合加权距离和非加权距离两个指标来衡量两个样品间的相异系数，其值的高低反映两个样品在物种多样性方面差异的大小。用Qiime软件计算基于加权距离并绘制Heat-map表明(图 2)，若羌地区、民丰地区、且末地区、尉犁地区、塔中地区差异系数平均值分别为0.1823、0.2990、0.2680、0.3240、0.2280。沙尘暴前期、中期、后期差异系数平均值分别为0.2244、0.3053、0.2844。结果表明，尉犁地区和沙尘暴中期空气细菌平均差异系数最大。
 |
| 图 2 β多样性指数热图 Figure 2 Beta diversity index heat map. |
| 图选项 |
2.3.1 不同采样地物种丰富度: 在不同的分类水平上，不同地区物种的组成和丰度存在差异。使用R软件对各地区样品在门水平上的组成类群(图 3)表明，塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌群落共有10门，主要为Proteobacteria (67.6%)、Bacteroidetes (17.6%)、Actinobacteria (11.7%)、Firmicutes (2.9%)，Proteobacteria为新疆沙尘源区优势菌群。不同采样地区在属水平上的物种组成(图 4)表明，5个样点在前期、中期和后期优势菌群和细菌群落组成不同。塔中前期和后期优势属为不动杆菌属(Acinetobacter)和叶杆菌属(Phyllobacterium)；MF1、MF3优势属分别为短波单胞属(Breundimonas)和微杆菌属(Microbacterium)；QM1、QM3优势菌属分别为微杆菌属(Microbacterium)和柄杆菌属(Caulobacter)；YL1、YL3优势菌群为海洋杆菌属(Pontibacter)和短波单胞属(Breundimonas)，不同样点不同采样时期共有9个优势属。5个样点在沙尘暴中期优势细菌不同，沙尘暴显著影响沙尘源区空气固有的细菌群落。
 |
| 图 3 不同样品在门水平上的物种相对丰度 Figure 3 The relative abundance of species at the phylum level of different samples. |
| 图选项 |
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| 图 4 不同样品在属水平上的物种相对丰度 Figure 4 The relative abundance of species at the genus level of different samples. The others representatives represent the sum of the relative abundances of all the other doors that are outside the 10 gates of the graph. |
| 图选项 |
2.3.2 样品间物种丰度聚类: 根据每个样品在目水平的物种注释及丰度信息，选取差异显著(P < 0.05)的目进行聚类(图 5)，表明不同样点优势目不同，其中尉犁地区有显著差异的物种丰富度最高，主要有Oneanospirllales、Bacteroidales、Thermales、Rhodocyclales等，占沙尘暴源区细菌差异物种的50%；塔中地区次之，主要有Sphingomonadales、Enterobacteriales等，占沙尘暴源区细菌差异物种的20%；若羌地区最低，Sphingobacteriales、Micrococcales和Cytophagales，仅占沙尘暴源区细菌差异物种的6.7%。
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| 图 5 物种丰富度聚类热图 Figure 5 Species richness clustering heat map. |
| 图选项 |
2.3.3 无度量多维标定法(NMDS): NMDS统计是一种适用于生态学研究的非线性模型的排序方法，它克服了线性模型的缺点，更好地反映生态学数据的非线性结构。在NMDS分析时，通过点与点间的距离反映样本的组间和组内差异，其中距离越远，物种组成差异越大。基于塔克拉玛干沙尘暴发生前期、中期、后期OTUs水平的NMDS分析散点(图 6)表明，5个样点在前期、中期和后期空气细菌组成差异极显著。塔中、民丰和且末3个地区之间沙尘暴中期空气细菌群落差异显著；若羌和尉犁地区之间细菌群落差异极显著。沙尘暴对5个源区固有空气细菌群落影响差异极显著。结合采样位点周围城市分布密度及周围人口密度，若羌和尉犁地区相对较大，因此细菌群落差异较大[23]。
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| 图 6 不同样品NMDS分析图 Figure 6 NMDS analysis diagram of different samples. |
| 图选项 |
2.4 环境因子关联分析 典范对应分析(CCA)是结合采样地环境因子信息，阐述环境因子对沙尘暴空气细菌群落多样性的影响。图 7表明，不同环境因子对塔克拉玛干沙尘暴源区空气微生物多样性影响的大小为海拔 > 纬度 > 经度 > 湿度 > 气压 > 温度。海拔和纬度与沙尘暴空气细菌群落多样性负相关。温度、湿度、气压和经度与沙尘暴空气细菌多样性正相关，这与空气微生物的空间垂直分布规律相吻合。6类环境因子对沙尘暴空气细菌群落多样性的影响差异不显著(P=0.102 > 0.05)。
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| 图 7 不同样品的典范对应分析图 Figure 7 Canonical correspondence analysis diagram of different samples. |
| 图选项 |
3 讨论 本研究结果表明新疆沙尘源区主要有Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Firmicutes，优势门为Proteobacteria；沙尘暴前期、中期、后期空气细菌优势菌群不同，在细菌群落组成结构上差异极显著；5个样点之间优势物种组成差异显著。前人[24-25]采用限制性末端分析(T-RFLP)方法，研究新疆塔克拉玛干沙尘暴空气微生物多样性和伽师县沙尘天气过程中空气微生物群落多样性结果基本一致，其中空气细菌类群主要为4个门，其他相关研究表明在青岛市秋季空气和PM2.5，PM10颗粒物中Proteobacteria中的Acinetobacter均为细菌群落组成中的主要菌群，差别为大气PM2.5、PM10中细菌多样性和丰富度均低[26-28]。在比较空气、沙尘暴和大气颗粒污染物空气细菌在多样性和丰富度上依次降低，这可能与沙尘暴和大气颗粒污染物的极端环境因子有关。在沙尘暴过程中，强大的风力作用伴随沙尘使细菌大量悬浮在空中，使得源区固有空气细菌群落结构和优势菌群发生改变，并影响沙尘暴后源区空气细菌群落的结构。但目前尚没有研究表明沙尘暴对空气微生物群落的影响能够持续多久，但在沙尘暴优势菌中发现在一类细菌在细胞结构上有特殊的结构，其中Proteobacteria中有些类群利用鞭毛运动，也有一些独特的黏细菌，能够聚集成细胞群形成子实体。
本研究解析沙尘暴空气细菌存在不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)，这类细菌中包含一些病原菌或条件致病菌，在一定程度上能够引起呼吸道感染和尿道感染等临床表现特征[29-30]。苟欢歌[31]等研究空气TSP和PM10中微生物的群落特征表明，依附在大气污染的固体颗粒物上有弧菌属(Vibrio)、沙门氏菌属(Salmonella)等病原菌，同时也出现在本研究沙尘暴空气细菌中。高金霞[6]进一步对西北沙漠毒理性和风沙尘肺调查表明，长期暴露在风沙中患“尘肺病”的概率增大。目前，采用免培养实验方法尚不能确定沙尘暴携带的病原菌具体的毒理效应。提高沙尘暴空气细菌可培养的措施，研发新型培养基，结合可培养实验方法，对细菌进行分离，纯化后对其理化性质和毒理性进行更深入的研究。
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