刘春梅1,2, 盛荣1, 刘毅1, 谌星1,2, 魏文学1
1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 中国科学院桃源农业生态试验站, 湖南 长沙 410125;
2.中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2017-09-30；修回日期：2017-12-16；网络出版日期：2018-01-05
基金项目：国家自然科学基金项目（41330856，41501277，41301274）；中国科学院战略性先导科技专项（XDB15020200）
*通信作者：魏文学, Tel/Fax:+86-731-84615210;E-mail:wenxuewei@isa.ac.cn
摘要：[目的]从水稻土中分离筛选出一株兼性氧化亚氮还原菌，并探索其在不同条件下还原N2O的能力，为减少温室气体N2O的排放提供重要依据。[方法]通过微生物富集培养分离技术从水稻土中分离得到纯菌；利用nosZ基因和16S rRNA的测序分析鉴定菌株；通过测定菌株在不同条件下N2O的还原量，分析该菌株还原N2O的能力及调控因子。[结果]经鉴定，该菌株含有nosZ基因，属于假单胞菌属，在温度30℃、厌氧条件下还原N2O速率高达0.0219 μmol/min以上，改变不同温度和氧气浓度后其能力相对减弱，但仍具备较强的还原N2O作用。[结论]从水稻土中分离筛选得到的兼性氧化亚氮还原菌为假单胞菌，它在不同环境条件下都具备较强的还原N2O能力，该菌株可能为减少土壤N2O排放提供新途径，对保障生态环境安全具有重要的应用价值。
关键词： 氧化亚氮还原菌 假单胞菌 N2O还原能力 nosZ基因
Capability of N2O reduction of a facultative N2O reducer
Chunmei Liu1,2, Rong Sheng1, Yi Liu1, Xing Chen1,2, Wenxue Wei1
1.Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Regions, Taoyuan Station of Agro-ecology Research, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, Hunan Province, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received 30 September 2017; Revised 16 December 2017; Published online 5 January 2018
*Corresponding author: Wei Wenxue, Tel/Fax:+86-731-84615210;E-mail:wenxuewei@isa.ac.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41330856, 41501277, 41301274) and by the Special Funds for Strategic Pilot Sci-tech Projects of the Chinese Academy of Sciences (XDB15020200)
Abstract: [Objective]A nitrous oxide reducing bacterium (DJ7) was isolated from paddy soil and its ability to reduce N2O was detected under different incubation conditions. Aiming to understand the mechanisms of N2O reduction and supply theoretical basis for regulation of N2O emission.[Methods]The strain was isolated by microbial enrichment culture and identified by homogeneous analysis of its sequences of nosZ and 16S rRNA gene with the database of NCBI. The abilities of N2O-reducing of DJ7 at different temperatures and O2 concentrations were determined by measuring the amount of N2O reduction through GC.[Results]The strain was characterized as Pseudomonas and contained nosZ gene, its N2O reduction rate was more than 0.0219 μmol/min under anaerobic at 30℃. Although the increase of air O2 concentration and shifts of incubation temperature at either direction resulted decreases of the capability of N2O reduction, it maintained a certain ability in N2O reduction.[Conclusion]The strain is an active facultative N2O reducer belonging to Pseudomonas and possesses strong ability to reduce N2O, especially under anaerobic condition. This strain may provide a new idea to alleviate the N2O issue and play an active role in the ecological environment.
Key words: nitrous oxide reducer Pseudomonas sp. N2O-reducing ability nosZ gene
全球气候变暖受到国内外的广泛关注。氧化亚氮(N2O)是大气中主要的温室气体之一，虽然N2O对温室效应的贡献率只有5%，但其增温潜势却是CO2的约300倍[1]。此外，N2O具有较稳定的化学性质，排放后在大气驻留的时间长达150年左右，其进入臭氧层后还不断消耗臭氧，导致臭氧层受到破坏[2]。更严重的是，N2O浓度仍在以每年约0.8 ppb的速度不断升高[3]，对全球气候和环境造成巨大威胁。
目前已知的N2O排放源主要包括：化石燃料燃烧、化工生产过程、海洋、热带及温带森林、草地和土壤等。研究表明，全球人为排放的N2O主要是来自于农田土壤[4]，而农业土壤中N2O主要来源于微生物活动引起的硝化和反硝化过程[5]。目前已知的生物途径中N2O唯一的汇是反硝化过程，由nosZ基因编码的氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase，N2OR)将N2O还原成N2[6]。
一般认为nosZ基因在厌氧条件下发挥作用[7]。但近几年，随着越来越多好氧反硝化菌被分离筛选[8]，传统的生物脱氮理论正在逐步被完善。研究表明，好氧反硝化菌在有氧或纯氧的条件下依然能起作用，将硝酸盐和亚硝酸盐还原为N2或N2O等气态产物[9-11]。另外，温度是影响微生物生长和酶活性的重要因素之一。当温度适宜时，微生物生长快，相关活性和代谢产物达到较高水平。
目前微生物生态方向的研究主要集中在环境样品的群落结构及多样性上，但对纯菌的特性研究能更直观地了解微生物相关作用机制并可更好地发挥微生物的环境应用价值。目前关于纯菌的脱氮特性研究已具备一定基础，主要包括一些异养硝化-好氧反硝化菌以及好氧反硝化菌的研究。但大部分研究都主要集中在硝酸根(NO3–)和亚硝酸根(NO2–)的脱氮能力上[12]，且菌株样品主要来源于海水、污水以及一些生物反应器中[13]，对来自土壤样品中的反硝化细菌且直接探索菌株还原N2O能力的研究相对较少。
本研究以水稻土中分离富集得到的反硝化菌为基础，从中筛选出氧化亚氮还原菌，研究N2O还原能力强的菌株，为通过生物途径调控土壤N2O的排放、有效减控温室气体提供科学基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株来源: 本实验所用反硝化细菌从水稻土壤中(N: 30°38?21.6?，E: 120°46?50.9?)分离，以硝酸钾、琥珀酸为底物富集培养[14]，筛选得到的一些可高效利用硝酸盐的反硝化微生物菌群，由本实验室保存。
1.1.2 菌株的筛选: 对分离得到的细菌从中选择56株进行初步筛选，通过对这56株反硝化细菌进行nosZ基因的PCR扩增，测定菌株在反硝化培养基的生长状况(用Bioscreener C仪器测定菌株OD值)，以及还原N2O能力测定，最终筛选出一株含nosZ基因、且在反硝化培养基中生长状况良好的氧化亚氮还原菌作为试验对象，该菌株编号为DJ7。
1.1.3 培养基: (1) LB培养基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L；(2)反硝化培养基[15] (DM)：K2HPO4 0.5 g/L，NaH2PO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KNO3 2 g/L，柠檬酸三钠11.35 g/L (C/N=10)，pH 7.0，微量元素母液500 μL/L；(3)微量元素母液：Na2EDTA 50 g/L，MnCl2·4H2O 5.06 g/L，ZnSO4·7H2O 2.2 g/L，CuSO4·5H2O 1.57 g/L，CaCl2 5.5 g/L，NaMoO4·4H2O 1.1 g/L，FeSO4·7H2O 5.0 g/L，CoCl2·6H2O 1.61 g/L，pH 7.0–7.2。
1.2 菌株的鉴定
1.2.1 菌株形态观察: 参照《常见细菌系统鉴定手册》中介绍的方法，对菌株进行形态描述。将菌株培养后进行固定、脱水、脱乙醇等预处理，干燥后送样，使用场发射扫描电子显微镜(型号SU8010)观察菌株在扫描电镜下的形态特征。
1.2.2 16S rRNA基因测序及系统发育分析: 采用细菌全基因组试剂盒(天根细菌基因组DNA提取试剂盒)提取菌株DJ7的DNA，以DNA为模板扩增16S rRNA基因，正向引物8F：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492R：5′-GGWTA CCTTGTTACGACT-3′。PCR反应体系(50 μL)：上游引物(10 μmol/L) 2 μL、下游引物(10 μmol/L) 2 μL、2×PCR mix 25 μL、DNA模板量(50–100 ng/μL) 1 μL、补ddH2O至50 μL。扩增程序为：94 ℃预热3 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经切胶纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司完成基因测序分析(回收试剂盒使用天根切胶回收试剂盒)。将测序结果在NCBI基因库里进行比对分析，若相似度达到90%以上即初步认为样品和基因库菌株为同一个属。然后在库里找到其他模式菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对，基于16S rRNA序列同源性，用软件MEGA7以邻接法构建菌株DJ7与其相近序列细菌的系统发育树。
1.3 nosZ基因测序分析 同样以DNA为模板，用特异性引物去扩增nosZ基因，上游引物nosZ-2002F：5′-CGYTGTTCM TCGACAGCCAG-3′，下游引物nosZ-2002R：5′- CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA-3′。PCR反应体系(50 μL)：上游引物(10 μmol/L) 2 μL、下游引物(10 μmol/L) 2 μL、2×PCR mix 25 μL、DNA模板量(50–100 ng/μL) 1 μL、补ddH2O至50 μL。扩增程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，10个循环，每个循环退火温度降1 ℃；30个循环为94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经切胶回收纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序(回收试剂盒使用天根切胶回收试剂盒)。最后将测序结果在网站NCBI基因库里，进行比对分析。
1.4 菌株N2O还原能力的测定
1.4.1 菌株的培养: 接种菌株DJ7于有30 mL反硝化培养基的锥形瓶中进行扩大培养24 h(菌种培养条件设置：T=30 ℃，pH 7，C/N=10，转速150 r/min)。将菌液尽量摇匀，接1 mL菌液于装有30 mL培养基的100 mL培养瓶中，立即盖好瓶塞，用铝盖夹好封住后统一放入摇床内进行培养。
1.4.2 样品的采集: 培养24 h后，取出培养瓶，将菌液倒入50 mL离心管中，4000 r/min离心10 min，用无KNO3的DM培养基洗涤2次，溶于30 mL无KNO3的DM培养基后倒入100 mL培养瓶中，密封后加一个滤菌器，抽真空60 s，充入179.59 μg/L的N2O气体，再放于摇床内，培养10 min后，将瓶子取出，采集N2O气体20 mL。采用气相色谱仪(Agilent 7890A，USA)测定N2O浓度，即为反应后的N2O量。
1.4.3 不同条件下还原能力测定: 探索两个重要的环境因素对菌株还原能力的影响，包括温度和氧气浓度。反应温度设置分别为20、30和40 ℃。氧气浓度设置条件为0%、10%和21%。除了环境条件的不同，其测定菌株还原N2O能力的方法与1.4.2中所述一致。
2 结果和分析 2.1 菌株的鉴定
2.1.1 菌株形态: 菌株DJ7在LB平板上生长2 d后形成圆形菌落，菌落表面光滑，颜色为白色略微带浅黄色，无透明度，革兰氏染色呈红色说明为革兰氏阴性菌。从扫描电镜观察显示，菌株DJ7为杆菌，无鞭毛、无芽孢，长度约为1.5–2.5 μm，直径约为0.6–0.9 μm (图 1)。
 |
| 图 1 菌株DJ7的扫描电镜图(10000×) Figure 1 Scanning electron microscopy of strain DJ7 (10000×). |
| 图选项 |
2.1.2 16S rRNA基因测序及系统发育分析: 通过PCR扩增、切胶回收、测序，获得菌株DJ7的16S rRNA基因序列已提交到GenBank网站(基因库登录号为MF802245)，通过在NCBI数据库中比对，发现DJ7与Pseudomonas sp.的多株模式菌株的16S rRNA基因相似性达100%，通过检索和DJ7亲缘性相近的其他模式菌株，利用MEGA7软件，以Neighbor-joining法绘制16S rRNA系统发育树(图 2)。根据发育树结果鉴定菌株DJ7为假单胞菌属。
 |
| 图 2 菌株DJ7的16S rRNA系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of strain DJ7 based on the sequences of 16S rRNA gene. Numbers in bracket are the sequences accession number in GenBank. Numbers at the nodes indicate the bootstrap values on Neighbor-joining analysis. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches. |
| 图选项 |
2.2 nosZ基因测序结果 通过PCR扩增、切胶回收和测序，获得的菌株DJ7的nosZ基因序列已提交到GenBank网站(基因库登录号为MF802247)，通过在NCBI数据库中比对，发现DJ7与Pseudomonas sp.的多株模式菌株的nosZ基因相似性达98%以上，可确定菌株DJ7含有nosZ基因。
2.3 菌株还原N2O能力结果
2.3.1 菌株的还原N2O能力测定: 菌株在DM培养基中，30 ℃、转速为150 r/min、氧气浓度为0%的条件下，充入179.59 μg/L的N2O反应10 min后，实验组剩余32.92 μg/L的N2O，将CK组剩余N2O减去实验组剩余的N2O，即为菌株N2O还原量，结果显示菌株还原N2O效率达64.88% (图 3)，表现出较强的还原N2O能力，其反应速率为0.0219 μmol/min。
 |
| 图 3 菌株DJ7还原N2O能力结果 Figure 3 N2O-reducing ability results of strain DJ7. Data are mean±standard error of the three replicates. |
| 图选项 |
2.3.2 不同温度条件下菌株还原N2O结果: 温度的改变可能会影响细菌的氧化亚氮还原酶活性。在20、30、40 ℃条件下，根据实验组和对照组N2O消耗量的差值得出，菌株实际还原N2O效率分别是25.65%、64.88%、16.78% (图 4)，即以0.3265 μmol N2O为底物，菌株消耗N2O速率分别为0.0084、0.0212和0.0055 μmol/min。由此可以看出，3个温度中30 ℃是该菌株还原N2O的最佳温度，且该菌受温度影响较大。
 |
| 图 4 不同温度条件下菌株还原N2O效率 Figure 4 Results of reducing N2O efficiency of strain under different temperature conditions. Data are mean± standard error of the three replicates. |
| 图选项 |
2.3.3 不同氧气浓度下菌株还原N2O结果: 其他条件保持一致、改变不同氧气浓度，在0%、10%、21%氧气浓度条件下，根据实验组和对照组N2O消耗量的差值得出，菌株实际还原N2O效率分别是62.78%、16.34%、8.89% (图 5)，以0.3265 μmol N2O为底物，菌株消耗N2O速率分别为0.0205、0.0053、0.0029 μmol/min。结果表明，虽然该菌株在厌氧条件下具有最高的还原N2O效率，但在兼性厌氧和好氧条件下也仍具有较强的还原能力。
 |
| 图 5 不同氧气浓度下菌株还原N2O效率结果 Figure 5 Results of reducing N2O efficiency under different oxygen concentrations. Data are mean± standard error of the three replicates. |
| 图选项 |
3 讨论 20世纪80年代，Robertson等最先发现并报道了好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系的存在，随着研究者对好氧反硝化菌研究的不断深入，越来越多具有较强脱氮能力的好氧反硝化菌从不同的生态环境中被分离筛选。目前报道的好氧反硝化细菌主要种类有芽孢菌属(Bacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、假单胞菌属(Pseudomonas)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Eubacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、芽生杆菌属(Blastobacter)、盐杆菌属(Halobacterium)和根瘤菌属(Rhizobium)等[16]。通过生理生化和16S rRNA序列鉴定，本文菌株DJ7为假单胞菌属，属于γ-变形菌门。假单胞菌属也是目前研究较典型的好氧反硝化菌。Miyahara[11]等研究了Pseudomonas stutzeri TR2在污水处理过程中在有氧条件下仍表现出较强的还原N2O能力。Ikeda-Ohtsubo等[13]将Pseudomonas stutzeri添加到污水处理生物反应器中同样证明了该菌的强N2O还原能力。有研究通过分离培养及菌种鉴定的方法发现Pseudomonas是玉米农田土壤中的优势菌种且与N2O的排放存在较强相关性[17]。其中，氧化亚氮还原菌直接参与反硝化作用的最后一步，对温室气体减排效应起着重要作用。目前直接对这一类还原菌的研究还相对较少，Gao等[18]在农田土壤中筛选得到一些既能减少N2O排放又能促进作物生长的氧化亚氮还原菌，包括Azospirillum和Herbaspirillum属。本文菌株DJ7是从稻田土壤中通过以硝酸钾和琥珀酸为底物在好氧条件下富集培养分离得到的兼性氧化亚氮还原菌，且对其不同环境条件下菌株还原N2O能力强弱进行研究，这对将氧化亚氮还原菌应用于N2O的减排效应中具有重要参考意义。
通过对该菌株的还原N2O特性研究发现，菌株在20 ℃、30 ℃和40 ℃的条件下，还原N2O效率分别是25.65%、64.88%和16.78%。可以看出该菌虽在30 ℃还原效率最高，但随温度降低或温度升高仍具有较强的还原能力，这可能意味着该菌对温度的改变具有较强适应性。亚热带地区水稻田的土表平均温度在6–33 ℃[19]，这代表着除了在冬季外，该菌株可能在稻田土壤中都能保持较强的N2O还原能力。此外，菌株DJ7在厌氧、兼性厌氧和好氧的条件下，菌株的还原N2O效率分别是62.78%、16.34%和8.89%，这说明菌株在厌氧条件下还原能力最强，但在有氧条件下同样能还原N2O，表明氧气浓度不会完全抑制该菌的氧化亚氮还原酶活性，若将菌株接种到有氧的环境中仍能起到减少N2O的作用。目前受到认可的好氧反硝化菌的作用机理主要是反硝化还原酶理论和微环境理论[20]，而该菌受氧气浓度的影响机理还需进一步证实。综上可以得出，该菌株具有适应性强、生长速度快、生长条件温和及能高效还原N2O等特点。对该菌株的研究为在好氧条件下进行反硝化作用提供理论支撑，为利用氧化亚氮还原菌应用于N2O的减排效应提供一个新思路。
除了nosZ基因的功能验证，菌株在硝化和反硝化过程中具备何种功能特点同样值得探究。利用相关特异性引物，通过PCR扩增技术对菌株DJ7中是否含有编码反硝化过程系列酶的基因，如narG/napA、nirK/nirS和cnorB/qnorB做了初步验证，结果发现其具有narG、nirS和cnorB基因，即该菌含有全套的反硝化过程基因，能将NO3-彻底还原成N2。根据好氧反硝化机理，DJ7含有narG基因而不是周质还原酶基因napA，表明该菌在好氧条件下仍能进行反硝化作用的机理可能更倾向于微环境理论。当然这只是初步结果，该菌株的作用机理还需进一步的探索和验证。今后，可从以下几方面对该类菌进行深入研究。(1)对反应后菌液样品进行nosZ基因的RNA提取和定量分析，从nosZ基因的表达量上来更直观地验证还原能力的强弱。(2)以更多株不同属的菌株作为实验对象，比较不同菌株之间还原N2O能力的差异和对不同环境条件的响应，对含nosZ基因的微生物进行更全面的了解。(3)不止关注nosZ基因与还原N2O，还可验证菌株在反硝化过程中的其他基因，以及与N2O排放关系，考虑对该菌株进行全基因组测序，更全面地分析该菌株不同途径的相关基因与相互作用关系。(4)虽然对纯菌的脱氮特性进行研究会比较清晰地分析相关现象和机理，但要将菌株应用到解决生态问题中，还需将菌株接种于土壤环境样品中后的响应进行深入研究，这样对菌株的应用才更具参考价值。
References
| [1] | Regan K, Kammann C, Hartung K, Lenhart K, Müller C, Philippot L, Kandeler E, Marhan S. Can differences in microbial abundances help explain enhanced N2O emissions in a permanent grassland under elevated atmospheric CO2?. Global Change Biology, 2011, 17(10): 3176-3186. DOI:10.1111/gcb.2011.17.issue-10 |
| [2] | Ravishankara AR, Daniel JS, Portmann RW. Nitrous oxide (N2O):the dominant ozone-depleting substance emitted in the 21st century. Science, 2009, 326(5949): 123-125. DOI:10.1126/science.1176985 |
| [3] | Hofmann DJ, Butler JH, Dlugokencky EJ, Elkins JW, Masarie K, Montzka SA, Tans P. The role of carbon dioxide in climate forcing from 1979 to 2004:introduction of the Annual Greenhouse Gas Index. Tellus B Chemical and Physical Meteorology, 2006, 58(5): 614-619. DOI:10.1111/j.1600-0889.2006.00201.x |
| [4] | Minamikawa K, Nishimura S, Sawamoto T, Nakajima Y, Yagi K. Annual emissions of dissolved CO2, CH4, and N2O in the subsurface drainage from three cropping systems. Global Change Biology, 2010, 16(2): 796-809. DOI:10.1111/gcb.2010.16.issue-2 |
| [5] | Abbasi MK, Adams WA. Gaseous N emission during simultaneous nitrification-denitrification associated with mineral N fertilization to a grassland soil under field conditions. Soil Biology and Biochemistry, 2000, 32(8/9): 1251-1259. |
| [6] | Fernandes SO, Bharathi PAL, Bonin PC, Michotey VD. Denitrification:an important pathway for nitrous oxide production in tropical mangrove sediments (Goa, India). Journal of Environmental Quality, 2010, 39(4): 1507-1516. DOI:10.2134/jeq2009.0477 |
| [7] | Tallec G, Garnier J, Billen G, Gousailles M. Nitrous oxide emissions from secondary activated sludge in nitrifying conditions of urban wastewater treatment plants:effect of oxygenation level. Water Research, 2006, 40(15): 2972-2980. DOI:10.1016/j.watres.2006.05.037 |
| [8] | Sun XM, Li QF, Zhang Y, Liu HD, Zhao J, Qu KM. Phylogenetic analysis and nitrogen removal characteristics of a heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria strain from marine environment. Acta Microbiologica Sinica, 2012, 52(6): 687-695. (in Chinese) 孙雪梅, 李秋芬, 张艳, 刘淮德, 赵俊, 曲克明. 一株海水异养硝化-好氧反硝化菌系统发育及脱氮特性. 微生物学报, 2012, 52(6): 687-695. |
| [9] | Liu Y, Ai GM, Miao LL, Liu ZP. Marinobacter strain NNA5, a newly isolated and highly efficient aerobic denitrifier with zero N2O emission. Bioresource Technology, 2016, 206: 9-15. DOI:10.1016/j.biortech.2016.01.066 |
| [10] | Jin RF, Liu TQ, Liu GF, Zhou JT, Huang JY, Wang AJ. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the marine origin bacterium Pseudomonas sp. ADN-42. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015, 175(4): 2000-2011. DOI:10.1007/s12010-014-1406-0 |
| [11] | Miyahara M, Kim SW, Fushinobu S, Takaki K, Yamada T, Watanabe A, Miyauchi K, Endo G, Wakagi T, Shoun H. Potential of aerobic denitrification by Pseudomonas stutzeri TR2 to reduce nitrous oxide emissions from wastewater treatment plants. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(14): 4619-4625. DOI:10.1128/AEM.01983-09 |
| [12] | Yang XL, Li WM, Chen Y, Cao YS. Identification and denitrification of an aerobic bacterium. Acta Microbiologica Sinica, 2011, 51(8): 1062-1070. (in Chinese) 杨小龙, 李文明, 陈燕, 曹郁生. 一株好氧反硝化菌的分离鉴定及其除氮特性. 微生物学报, 2011, 51(8): 1062-1070. |
| [13] | Ikeda-Ohtsubo W, Miyahara M, Kim SW, Yamada T, Matsuoka M, Watanabe A, Fushinobu S, Wakagi T, Shoun H, Miyauchi K, Endo G. Bioaugmentation of a wastewater bioreactor system with the nitrous oxide-reducing denitrifier Pseudomonas stutzeri strain TR2. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 115(1): 37-42. DOI:10.1016/j.jbiosc.2012.08.015 |
| [14] | Brierley EDR, Wood M. Heterotrophic nitrification in an acid forest soil:isolation and characterisation of a nitrifying bacterium. Soil Biology and Biochemistry, 2001, 33(10): 1403-1409. DOI:10.1016/S0038-0717(01)00045-1 |
| [15] | Wen Y, Wei CH. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacterium isolated from anaerobic/anoxic/oxic treatment system. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(36): 6985-6990. |
| [16] | Fang JJ, Ma CM, Liu CF. The advance of study on denitrifying bacteria. Environmental Science & Technology, 2010, 33(6E): 206-210, 264. (in Chinese) 方晶晶, 马传明, 刘存富. 反硝化细菌研究进展. 环境科学与技术, 2010, 33(6E): 206-210, 264. |
| [17] | Nie YX, Li L, Isoda R, Wang MC, Hatano R, Hashidoko Y. Physiological and genotypic characteristics of nitrous oxide (N2O)-emitting Pseudomonas species isolated from dent corn andisol farmland in Hokkaido, Japan. Microbes and Environments, 2016, 31(2): 93-103. DOI:10.1264/jsme2.ME15155 |
| [18] | Gao N, Shen WS, Camargo E, Shiratori Y, Nishizawa T, Isobe K, He XH, Senoo K. Nitrous oxide (N2O)-reducing denitrifier-inoculated organic fertilizer mitigates N2O emissions from agricultural soils. Biology and Fertility of Soils, 2017, 53(8): 885-898. DOI:10.1007/s00374-017-1231-z |
| [19] | Lin S, Iqbal J, Hu RG, Ruan LL, Wu JS, Zhao JS, Wang PJ. Differences in nitrous oxide fluxes from red soil under different land uses in mid-subtropical China. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2012, 146(1): 168-178. |
| [20] | Li M. Research progress of aerobic denitrifying biological denitrification technique. Guangdong Chemical Industry, 2015, 42(13): 119-120. (in Chinese) 李美. 好氧反硝化生物脱氮技术研究进展. 广东化工, 2015, 42(13): 119-120. DOI:10.3969/j.issn.1007-1865.2015.13.052 |
