乙酰化修饰降低Ku蛋白的DNA结合活性
周盈^1,2, 毕利军²
1.佛山科学技术学院, 广东 佛山 528000;
2.中国科学院生物物理研究所, 北京 100101

收稿日期：2017-08-08；修回日期：2017-09-05；网络出版日期：2017-09-21
基金项目：佛山科学技术学院科研启动项目（Gg040916）；国家自然科学基金（XDA09030308）
_*通信作者：毕利军, Tel/Fax: +86-10-64888464, E-mail: blj@sun5.ibp.ac.cn


摘要：[目的]研究乙酰化修饰对Ku蛋白活性的影响。[方法]利用耻垢分枝杆菌为表达菌株，转入Ku蛋白表达质粒，纯化具有乙酰化修饰的Ku蛋白和无乙酰化的Ku蛋白突变体，比较两类蛋白的生化活性；分析氧化压力和酸性环境下耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白乙酰化水平的变化。[结果]Ku蛋白过量表达的耻垢分枝杆菌比转入空质粒的对照菌株生长缓慢；乙酰化Ku蛋白比未发生乙酰化Ku蛋白修复断裂DNA的活性降低、DNA结合活性降低；氧化压力和酸性压力环境下，耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白数量降低，乙酰化Ku蛋白数量变化不大。[结论]乙酰化修饰能够调节Ku蛋白的DNA结合活性，从而调节非同源末端连接修复系统的活性；Ku蛋白乙酰化程度升高是耻垢分枝杆菌对不良生长环境的反应。
关键词： 乙酰化 Ku 非同源末端连接修复途径 分枝杆菌
Acetylation reduced the DNA binding activity of Ku protein
Zhou Ying^1,2, Bi Lijun²
1.Foshan University, Foshan 528000, Guangdong Province, China;
2.Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Received 8 August 2017; Revised 5 September 2017; Published online 21 September 2017
_*Corresponding author: Lijun Bi, Tel/Fax: +86-10-64888464; E-mail: blj@sun5.ibp.ac.cn
Supported by the Start-Up Research Project of Foshan University (Gg040916) and by the National Natural Science Foundation of China (XDA09030308)

Abstract: [Objective]To understand the role of acetylation modification on the activity of Ku protein.[Methods]Acetylated Ku protein and its non-acetylated mutant were expressed and purified using M smegmatis expression system, and then their biochemical activities were compared. The effect of oxidative stress and acidic environment on Ku protein acetylation level were analyzed in M. smegmatis.[Results]Ku protein over-expression M. smegmatis strain grew slower than the control strain transformed with the empty plasmid. Acetylated Ku protein had lower DNA repair activity and DNA binding activity than the non-acetylated Ku. Quantity of Ku protein in M. smegmatis cells under oxidative and acidic stress decreased, whereas there was subtle change of acetylated Ku protein.[Conclusion]Acetylation modification can regulate the DNA binding activity of Ku protein, thus regulate the activity of Non-homologous end joining system. The increase of acetylation level of Ku protein is the response of mycobacteria against the adverse growth environment.
Key words: acetylation Ku NHEJ mycobacteria
非同源末端连接修复途径(non-homologous end joining，NHEJ)是真核生物中维护基因组稳定性的重要机制，少数原核生物特别是大多数的病原微生物中也有此系统，与病原微生物在宿主中的生存以及耐药性相关。结核分枝杆菌是结核病的病原菌，结核病是全球性传染病，是单病引起死亡最多的病种，也是艾滋病感染者的首要杀手(world health organization)。结核分枝杆菌的强致病性要求该菌的研究工作在生物安全等级高的实验室进行，因此常规实验室常用其非致病性模式菌株——耻垢分枝杆菌进行细菌的基本生理代谢研究。
结核分枝杆菌具有多种途径修复DNA双链断裂，包括不依赖于RecA的单链退火途径，依赖于RecA的同源重组和NHEJ。不同生长时期不同修复途径占主导地位。Pitcher研究表明NHEJ在耻垢分枝杆菌平台生长时期是主要的DNA双链断裂修复途径，同源重组修复在对数生长时期占主导地位^[1]。Ku和LigD组成分枝杆菌最小NHEJ体系，二者在酵母中共表达能够恢复NHEJ缺陷酵母细胞50%的NHEJ功能^[2]，在大肠杆菌中共表达能够使细菌胞内的线性质粒重新环化^[3]。Ku以同源二聚体的形式结合双链DNA末端，特异性招募LigD，LigD的POL区域和Ku的C端介导两者的相互作用，随后LigD的核酸外切酶活性和连接酶活性完成断裂DNA的修复^[4]。
目前已经发现多种真核NHEJ翻译后修饰方式，包括磷酸化、泛素化和乙酰化^[5-7]，以及调节真核NHEJ的多种机制^[8-9]。除了本研究小组前期发表的研究报告，尚未发现其他原核NHEJ翻译后修饰和调控机制。以Ku蛋白为诱饵蛋白进行垂钓，我们发现Ku蛋白和去乙酰化酶蛋白Sir2有相互作用，缺失Sir2降低耻垢分枝杆菌修复断裂DNA的效率^[10]。随后通过Western blotting和质谱分析，发现Ku蛋白有乙酰化修饰，发生在多个赖氨酸位点，其中第29位赖氨酸为重要的乙酰化位点^[11]，但是乙酰化修饰对Ku蛋白活性的影响尚不清楚。本研究通过表达纯化具有乙酰化的Ku蛋白，结合定点突变和体外重组NHEJ系统，进一步分析乙酰化修饰给Ku蛋白带来的活性变化。
1 材料和方法 1.1 材料 耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis MC² 155由本实验室保存，菌株培养使用添加0.5%甘油和0.05%吐温80的LB培养基，于37 ℃培养。抗生素使用浓度为卡那霉素30 μg/mL (购自Amersco)、潮霉素50 μg/mL (购自Roche)。限制性核酸内切酶、DNA连接酶、高保真DNA聚合酶和DNA marker等购自NEB公司；DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega公司。His单克隆抗体和TAP抗体购自Sigma公司；乙酰化抗体购自Cell Signaling公司；HRP标记的小鼠和兔抗体购自Promega；RpoA多抗由本实验室制备和保存。杂交检测试剂盒和化学发光检测试剂盒购自Thermo公司。PCR引物合成、5'-biotin-dsDNA合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。研究中使用的其他质粒和菌株见表 1。
表 1. 文中所用的菌株和质粒 Table 1. Strains and plasmids used in this study

Strains/Plasmids	Description	References/Sources
Strains
Msm	M. smegmatis MC2 155. The most commonly used M. smegmatis strain; a high-frequency transformation mutant of the M. smegmatis strain ATCC 607	Our lab
ΔKu	M. smegmatis MC2 155 derivate. The genomic Ku ORF was substituted by the hygromycin B resistance gene.	[10]
ΔSir2	M. smegmatis MC2 155 derivate. A double unmarked (MSMEG_4620 and MSMEG_5175) mutant.	[11]
ΔLigD	M. smegmatis MC2 155 derivate. The genomic LigD POL domain was substituted by the hygromycin B resistance gene.	[11]
M. smegmatis MC2 155 Ku-TAP	M. smegmatis MC2 155 derivate. TAP tag was inserted into the C terminal of genomic Ku gene.	[10]
M. smegmatis MC2 155 LigD-TAP	M. smegmatis MC2 155 derivate. TAP tag was inserted into the C terminal of genomic LigD gene.	[10]
Plasmids
pMV261	Escherichia coli-mycobacterial shuttle plasmid	Our lab
pMind	E. coli-mycobacterial shuttle plasmid	Our lab
pMind-MsKu	M. smegmatis Ku gene fused with 10*His tag was inserted into the pMind vector	This study
pMV261-MsKu	M. smegmatis Ku gene fused with 10*His tag was inserted into the pMV261 vector	[11]
pMV261-MtKu	M. tuberculosis Ku gene fused with 10*His tag was inserted into the pMV261 vector	This study
pMV261-MsKu 11-273	11-273 aa of M. smegmatis Ku fused with 10*His tag was inserted into the pMV261 vector	This study
pMV261-MsKu 11-273 K29R	K29R mutant of pMV261-MsKu 11-273	This study
pQE30-MsKu	M. smegmatis Ku gene was inserted into the pQE30 vector	[10]
pET28a-MsLigD	M. smegmatis LigD gene was inserted into the pET28a vector	[10]

表选项






1.2 蛋白的表达和纯化 表达质粒经测序验证序列正确后，电转化耻垢分枝杆菌，涂布抗性平板，37 ℃静置培养3 d长出单菌落。单菌落转接5 mL液体培养基，37 ℃ 200 r/min培养3 d。取50 μL菌液离心取沉淀，菌落PCR验证表达质粒的存在；1 mL菌液离心取沉淀，加SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮10 min，离心取上清通过Western blotting验证蛋白表达。经验证的耻垢分枝杆菌重组菌37 ℃、200 r/min培养1000 mL菌液，5000×g离心10 min收集菌体，50 mL缓冲液(20 mmol/L Tris pH 8.0，NaCl 500 mmol/L，Triton X-100 0.1%，溶菌酶1 mg/mL和5%甘油)重悬菌体，超声破碎菌体，12000×g离心30 min去除细胞碎片。上清与Ni-NTA柱材料(购自GE)孵育30 min。依次用含有不同浓度咪唑的缓冲液(20 mmol/L Tris pH 8.0，NaCl 500 mmol/L和5%甘油)洗柱材料，最后用含500 mmol/L咪唑的缓冲液洗柱材料并收集洗脱液。不含咪唑的缓冲液透析洗脱液，5 kDa浓缩管(购自GE)收集和浓缩蛋白，分装成小份后–80 ℃保存蛋白。
1.3 NHEJ体外活性测定 EcoR V酶切pET质粒获得双链断裂DNA作为DNA底物。10 μL反应体系中包含MsLigD、Ku、50 μmol/L dNTPs，1×T4连接酶缓冲液(NEB)和80 ng DNA底物。混匀后，37 ℃孵育1 h，加入protease K 65 ℃反应30 min和94℃反应10 min。2 μL反应体系转化E. coli DH5α，37 ℃过夜培养后菌落计数。5 μL反应体系作为模板，通用引物对T7 terminator和T7 promoter、2×Taq mixture (购自Genstar)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。
1.4 Pull-down检测Ku-LigD相互作用 收集平台期M. smegmatis MC² 155 LigD-TAP菌体，缓冲液(PBS，Triton X-100 0.1%，溶菌酶1 mg/mL和5%甘油)重悬细胞，超声破碎菌体，12000×g离心30 min去除细胞碎片。上清与IgG柱材料(购自碧云天)孵育30 min，PBS洗柱材料3次。柱材料分别与MsKu 11-273和其突变体蛋白孵育2 h，PBS洗柱材料3次。SDS-PAGE上样缓冲液重悬柱材料，沸水煮5 min，分别用His和TAP抗体进行Western blotting分析。
1.5 EMSA检测Ku-DNA相互作用 30 bp 5'-biotin-dsDNA、不同浓度Ku蛋白和其衍生蛋白与T4 ligase缓冲液混合，冰上孵育15 min。6% PAGE凝胶和0.5×TBE电泳缓冲液中分离DNA，转移DNA至Hybond-N⁺尼龙膜(购自GE)，2×SSC洗膜，紫外光照射尼龙膜3 min，根据杂交检测试剂盒和化学发光检测试剂盒的说明书进行尼龙膜的封闭、孵育、洗膜和显影。
1.6 T4 Ligase竞争法检测Ku与DNA末端的结合 参考Weller报道^[12]，具体步骤为MsKu 11-273和其K29R突变体蛋白分别与80 ng DNA底物和1×T4 Ligase缓冲液在冰上孵育5 min；加入T4 Ligase (0.05 μL；NEB)，37 ℃孵育1 h，加入protease K 65 ℃孵育30 min，94 ℃孵育10 min；2 μL反应产物转化E. coli DH5α，1/10细胞涂布LB平板，37 ℃过夜培养后菌落计数。
1.7 不良环境对Ku乙酰化的影响
1.7.1 H₂O₂处理: 耻垢分枝杆菌M. smegmatis MC² 155 Ku-TAP培养至平台生长时期，加入终浓度为2 mmol/L H₂O₂，继续培养并取样进行Western blotting分析。

1.7.2 酸处理: 耻垢分枝杆菌M. smegmatis MC² 155 Ku-TAP培养至平台生长时期，加入3 mol/L醋酸钠pH 5.2 (TaKaRa)至终浓度为10 mmol/L，培养基pH从7.0降至5.8左右，继续培养并取样进行Western blotting分析。
2 结果和分析 2.1 纯化Ku蛋白具有乙酰化修饰 耻垢分枝杆菌Ku蛋白(MsKu)由328个氨基酸组成，结核分枝杆菌Ku蛋白(MtKu)由273个氨基酸组成，MsKu的11–273位氨基酸与MtKu的1–268位氨基酸的序列相似性达到79%。利用大肠杆菌表达体系过量表达和纯化Ku蛋白，获得高纯度的Ku蛋白，Western blotting分析乙酰化修饰，结果呈阴性(结果未显示)。利用耻垢分枝杆菌表达体系获得的Ku蛋白，具有乙酰化修饰(图 1)。截取MsKu保守区域11–273位氨基酸在耻垢分枝杆菌中进行表达和纯化，获得的纯化蛋白具有乙酰化修饰。上述结果说明乙酰化修饰在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌Ku蛋白中保守，并且仅分枝杆菌具有对应的乙酰化修饰酶类，大肠杆菌不具备Ku蛋白乙酰化修饰需要的酶类。

图 1 纯化Ku蛋白的乙酰化 Figure 1 Acetylation of purified Ku proteins. A: C-terminal 10×His-tagged Ku proteins from cell lysates of the M. smegmatis recombinant strains were concentrated by Ni-agarose, purified and analysed by SDS-PAGE. MsKu, M. smegmatis Ku-10×His protein; MtKu, M. tuberculosis Ku-10×His protein; MsKuC, M. smegmatis Ku residues 11–273 fused with a 10×His tag. Positions and sizes (kDa) of marker proteins are shown on the left. B: Western blotting of purified proteins from M. smegmatis with an antibody specific to acetylated lysine.

图选项

2.2 Ku蛋白过量表达影响细菌生长 分枝杆菌表达质粒pMV261利用Hsp60启动子组成型表达插入基因，并且在42 ℃热诱导条件下能够更高量地表达插入基因。比较重组菌Msm/ pMV261-MsKu、Msm/pMV261-MsKu 11-273和对照菌Msm/pMV261在37 ℃和42 ℃的生长(图 2-A)，42 ℃培养的LB培养基上对照菌Msm/pMV261在培养第3天长出，Msm/pMV261-Ku 11-273在培养的第6天长出，Msm/pMV261-Ku在培养的6 d内一直未长出；42 ℃培养的7H10培养基上对照菌在培养第4天长出，Msm/pMV261-Ku 11-273和Msm/pMV261-Ku一直未长出。42 ℃时对照菌Msm/pMV261在LB培养基上比在7H10培养基上生长速度快，说明LB培养基更有利于耻垢分枝杆菌的生长，因此42 ℃培养6 d时Msm/pMV261-Ku 11-273在LB培养基上形成菌落而7H10培养基上无菌落的原因是生长速度的差异。将Msm/pMV261-Ku和Msm/pMV261培养菌液进行系列稀释后分别滴在LB培养基上，分析Msm/pMV261-Ku在42 ℃培养条件时是否完全不生长。结果如图 2-B和2-C，42 ℃培养时仅未经稀释的Msm/pMV261-Ku培养菌液能够长出菌落，比Msm/pMV261的菌落数低10倍，说明42 ℃培养时Msm/pMV261-Ku生长受到了抑制作用而非杀菌作用。

图 2 野生菌中过量表达MsKu蛋白抑制细菌生长 Figure 2 Growth of MsKu over-expression M. smegmatis MC2 155 was restrained. Cells were streaked on LB or 7H10 (Difco) plates with kanamycin, and kept at 37 ℃ or 42 ℃ for 3–6 d (A), 5 μL Log (B) and Stationary (C) cells of M. smegmatis MC2 155/pMV261 and M. smegmatis MC2 155/pMV261-MsKu were diluted 10–1–10–6 on 37 ℃ or 100–10–2 on 42 ℃ LB plates. Experiments were repeated three times and representative results are shown. Intact MsKu and its truncated mutant (11–273 aa) were expressed in M. smegmatis MC2 155 using the pMV261 plasmid.

图选项

Ku和LigD组成了分枝杆菌的最小非同源末端连接体系，Ku蛋白识别并结合断裂DNA，随后招募LigD对DNA末端进行酶切和连接反应，目前尚未发现细菌Ku蛋白具有其他生理活性。为了探讨上述MsKu过量表达抑制细菌生长的表型是否与NHEJ活性相关，在LigD功能丧失的缺陷菌中观察MsKu过表达菌的生长表型。分枝杆菌pMind表达质粒能在诱导剂四环素的作用下表达插入基因，并且插入基因的表达量与诱导剂的使用浓度成正相关。如图 3所示，对照菌ΔLigD/pMind在四环素浓度为0、20、200 ng/mL的生长差异不大，而ΔLigD/pMind-MsKu的生长随四环素浓度增加而菌落数减少，说明Ku过量表达抑制细菌生长的表型与NHEJ活性不相关。大肠杆菌基因组中无NHEJ基因，不具有NHEJ体系。在大肠杆菌中过量表达Ku蛋白，菌株BL21/pQE30-MsKu培养菌液系列稀释后滴加在含有诱导剂IPTG的培养基上，37 ℃或者30 ℃诱导过夜后，也表现为在含有IPTG的培养基上仅培养菌液的原液能生长，其他稀释浓度不能生长，而不含有IPTG的培养基上培养菌液和稀释菌液均能生长(数据未显示)，该结果也支持Ku过量表达抑制细菌生长与NHEJ活性不相关。

图 3 LigD缺陷菌中过量表达MsKu蛋白抑制细菌生长 Figure 3 Growth of MsKu over-expression LigD deficient strain was restrained. Log and Stationary phase cells of ΔLigD/pMind-MsKu were diluted 10–3, 10–4, 10–5, and then 5 μL cell samples were cultured on hygromycin plates with different inducer (tetracycline) concentrations (0 ng/mL, 20 ng/mL and 200 ng/mL). ΔLigD/pMind was used as the control. This experiment was repeated three times and representative results are shown.

图选项

为了分析第29位赖氨酸发生乙酰化修饰对MsKu活性的影响，拟从耻垢分枝杆菌中表达和纯化MsKu蛋白和其K29R突变体蛋白。将氨基酸K替换成R通常在蛋白质乙酰化修饰研究中用来模拟非乙酰化修饰时的蛋白^[13]。尝试在耻垢分枝杆菌的野生型菌株、Ku缺陷菌和去乙酰化酶Sir2缺陷菌中表达蛋白，MsKu表达质粒在Ku缺陷菌和Sir2缺陷菌中无法表达MsKu蛋白，MsKu K29R表达质粒在野生型菌株中无法表达MsKu K29R蛋白。这些重组菌无法表达相应蛋白，可能与前述现象原因一致，都是由于Ku过量表达引起了细菌生长受阻。MsKu截短体蛋白Ku 11–273和其K29R突变体表达质粒能够在野生型菌株和Ku缺陷菌中表达对应蛋白，将用来分析第29位氨基酸发生乙酰化修饰对Ku活性的影响。
2.3 MsKu 11-273和其突变体的NHEJ活性有差异 从耻垢分枝杆菌中纯化截短体蛋白MsKu 11-273和其R29突变体(图 4-A)，Western blotting分析两者的乙酰化差异，如图 4-B所示MsKu 11-273 K29R的乙酰化抗体杂交条带很弱，曝光时间长达60 s时才出现微弱的杂交条带，而相应曝光时间下MsKu 11-273出现很强的乙酰化抗体杂交条带，说明第29位氨基酸由K突变为R后MsKu 11-273的乙酰化修饰基本消除。

图 4 MsKu 11-273和MsLigD修复双链断裂DNA Figure 4 Joining of blunt-ended DSBs by MsKu 11-273 and MsLigD. A: MsKu 11-273 (K29) and its R29 mutant (Lys-29 substituted with Arg) were purified from M. smegmatis using a Ni-NTA system. Purified proteins were analysed by SDS-PAGE (kDa). B: Western blotting of MsKu 11-273 (K29) and its R29 mutant purified from M. smegmatis with His-Ab and AcLys-Ab. C: Plasmid DNA cut by EcoR V was incubated with increasing amounts (10 ng, 40 ng and 200 ng) of MsKu 11-273 (K29) or its mutant (R29). NHEJ in these reactions was assessed by PCR (C) or by counting E. coli transformant colonies (D). The positions and sizes (bp) of marker DNA are shown on the left. Error bars represent the standard deviation based on triplicate experiments. ** 400 bp PCR fragment generated by NHEJ.

图选项

经典NHEJ体外活性测定是利用Ku和LigD在合适的反应条件下将2个断裂DNA重新连接，连接产物既可以用PCR方法检测断裂DNA是否修补达到设计长度，也可以检测修复断裂质粒形成抗性菌落，或者利用电泳检测同位素标记的DNA底物。本研究采用前两种检测方法分析NHEJ修复产物。如图 4-C所示，含有200 ng MsKu 11-273的体外NHEJ体系修复DNA为模板进行PCR反应，产生明显的PCR扩增产物，10 ng MsKu 11-273 K29R突变体产生相似的PCR扩增条带。随着MsKu 11-273 K29R增加到40 ng，PCR产物亮度略有增加，但是MsKu 11-273 K29R增加到200 ng时，PCR产物的亮度与40 ng MsKu 11-273 K29R样品相似，比阳性对照T4 Ligase的PCR产物亮度低，说明200 ng MsKu 11-273 K29R未完成所有DNA底物的修复，修复DNA底物数量用PCR产物亮度只能定性而不能定量比较。断裂的质粒DNA经NHEJ修复后，转化大肠杆菌，1个修复产物理论上产生1个菌落，比较各反应产生的菌落数(图 4-D)，MsKu 11-273 K29R在10、40、200 ng 3个浓度梯度产生的菌落数逐渐升高，其中40 ng MsKu 11-273 K29R产生的菌落数与200 ng MsKu 11-273产生的菌落数相似。以上结果表明MsKu 11-273 K29R的NHEJ活性比MsKu 11-273高。
2.4 MsKu 11-273和其突变体的稳定性以及与LigD互作无显著差异 MsKu 11-273 K29R的NHEJ活性比MsKu 11-273高，其原因是什么？尝试从蛋白的稳定性和NHEJ组成蛋白质之间的相互作用两个方面比较MsKu 11-273 K29R和MsKu 11-273蛋白的生化活性。如图 5-A所示，体外重组NHEJ反应体系中MsKu 11-273 K29R、MsKu 11-273、MsKu三种蛋白的稳定性相似，均为37 ℃孵育60 min和30 min两个时间点的蛋白量相似，比0 min时间点的蛋白量略低。

图 5 MsKu突变体的稳定性和招募LigD Figure 5 Protein stability and LigD interaction of MsKu derivates. A: Protein stability of MsKu 11-273 (K29) and its K29R mutant (R29) in T4 ligase buffer. 1 μg 10×His-tagged proteins were incubated at 37 ℃ for 0 min, 30 min or 60 min in 1×T4 ligase buffer (NEB), and then electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and Western blotting with His-Ab. B: LigD interaction activity of MsKu 11-273. MsKu 11-273 (K29) and its K29R mutant (R29) (20 μg) were incubated separately with MsLigD-TAP-bound beads for 2 h. After equilibrating with the wash buffer, all proteins bound to the beads were analyzed by immunoblotting with antibodies specific to the His tag or TAP tag.

图选项

耻垢分枝杆菌基因组的LigD基因C端融合表达TAP标签，利用TAP标签与Ig G柱材料的亲和性固定LigD，pull down其互作蛋白。如图 5-B所示LigD pull down结果，前3个泳道作为阴性对照排除了IgG beads非特异吸附Ku蛋白的可能性，保证后续检测的蛋白质之间的相互作用是特异性的；随后的两个泳道作为阳性对照，验证体系中MsKu 11-273 K29R和MsKu 11-273蛋白稳定存在；以LigD为诱饵，垂钓的MsKu 11-273 K29R和MsKu 11-273蛋白的杂交条带仅有微弱差异，说明MsKu 11-273 K29R和MsKu 11-273蛋白分别与LigD的相互作用无显著差异。
2.5 MsKu 11-273和其突变体蛋白的DNA结合活性有差异 Ku蛋白在NHEJ体系中最重要的功能是识别并结合到断裂DNA末端，从而开启NHEJ修复途径。利用EMSA方法可比较MsKu蛋白和其突变体蛋白的DNA结合活性。目前对于原核Ku蛋白结合DNA需要的最小DNA长度未知，MtKu与33 bp dsDNA形成一条迁移带^[14]，因此设计将30 bp 5'-biotin-dsDNA与50 pmol或100 pmol MsKu11-273和其突变体蛋白孵育。如图 6-A所示，50 pmol和100 pmol MsKu 11-273 K29R突变体与30 bp DNA底物形成迁移条带，无biotin标记的DNA底物作为竞争物加入孵育体系能使迁移条带消失，说明该迁移带为MsKu 11-273 K29R结合DNA底物形成的复合物。相同条件下，50 pmol和100 pmol MsKu 11-273与30 bp DNA底物均无迁移带产生。未加蛋白的对照孔有相同量的5'-biotin-dsDNA (3 fmol)，但无显影条带，猜测游离DNA在电泳过程中发生扩散，使得胶上局部DNA浓度过低而超出检测阈值。增加DNA用量至6 fmol (图 6-B)，未加蛋白的对照孔出现显影条带，说明提高DNA浓度能够使胶上游离DNA被检测。100 pmol MsKu 11-273 K29R与3 fmol DNA底物形成单一的迁移条带，与6 fmol DNA底物形成的迁移条带呈弥散性拖尾，说明提高反应体系中DNA浓度会引起蛋白-DNA复合物的稳定性降低而在胶上呈现出非单一的迁移条带。与6 fmol DNA底物对照孔相比，100 pmol MsKu 11-273样品中的DNA底物有少量弥散性拖尾，而DNA竞争物能够消除这种拖尾，说明该弥散性拖尾为MsKu 11-273与DNA底物结合而使DNA发生迁移，但是形成的蛋白-DNA复合物的数量和稳定性都很低，仅能使DNA发生少量拖尾。MsKu与MsKu 11-273 K29R形成相似的迁移条带。以上结果都说明MsKu 11-273比MsKu 11-273 K29R的DNA结合活性低，MsKu 11-273截短体是全长MsKu的DNA结合力降低的突变体。

图 6 EMSA分析MsKu突变体蛋白的DNA结合活性 Figure 6 DNA binding activity of MsKu derivates. Reaction mixtures contained T4 Ligase buffer, 3 fmol (A) and 6 fmol (B) 30 bp 5'-biotin-dsDNA and increasing quantity (pmol) of MsKu derivates. C: T4 Ligase was incubated with increasing amounts (500, 900 and 1800 ng) of MsKu 11-273 (MsKuC) or its mutant (K29R). The ligation product was transformed into E. coli, and colonies were counted after overnight culture. Error bars represent the standard deviation based on triplicate experiments. MsKu 11-273, MsKuC and K29. MsKu 11-273 K29R, MsKuC K29R and R29.

图选项

Ku蛋白结合DNA底物后，能够在DNA链上滑动，最终发挥NHEJ作用的位点是位于断裂DNA的末端，而EMSA不能分辨蛋白结合DNA位点是位于DNA中间或者末端。T4 Ligase直接连接2个DNA末端3'-hydroxyl和5'-phosphoryl，如果DNA末端被其他蛋白占据，需要T4 Ligase竞争DNA末端才能进行连接反应，T4 Ligase的连接酶活性将降低，因此T4 Ligase竞争法能够分析位于DNA末端的蛋白结合^[14]。如图 6-C所示，随着体系中MsKu 11-273浓度的增加，T4 Ligase连接断裂质粒DNA而产生的抗性菌落数量降低，含有MsKu 11-273 K29R反应体系比含有MsKu 11-273反应体系产生的菌落数更少，说明MsKu 11-273 K29R结合DNA末端的活性比MsKu 11-273高。
2.6 Ku蛋白乙酰化修饰是分枝杆菌对不良环境的反应 前面研究发现耻垢分枝杆菌Ku蛋白乙酰化修饰水平在对数期比平台生长时期低^[11]。与对数期细菌相比，平台期细菌的生存环境更差，猜测Ku蛋白的乙酰化修饰水平可能与生存环境相关。分析耻垢分枝杆菌在氧化压力和酸性培养条件时，Ku蛋白的乙酰化修饰水平变化，结果如图 7所示，在双氧水产生的氧化压力培养条件下，Ku蛋白在耻垢分枝杆菌细胞内的数量随时间逐渐降低，4 h时Ku蛋白杂交条带的强度比2 h的杂交条带强度明显降低，而4 h时乙酰化Ku蛋白与2 h时乙酰化Ku蛋白的杂交条带强度相似，说明4 h时Ku蛋白的乙酰化程度更高。酸性培养条件下，4 h时Ku蛋白杂交条带很弱，2 h和1 h时Ku蛋白杂交条带强度相似，而3个取样时间点时乙酰化Ku蛋白的杂交条带强度相似，说明4 h时Ku蛋白的乙酰化程度更高。

图 7 氧化压力和酸性培养条件时Ku蛋白的乙酰化 Figure 7 Acetylation of Ku in M. smegmatis under environment stress. M. smegmatis MC2 155 Ku-TAP was treated with H2O2 (2 mmol/L) and NaAc pH 5.2 (10 mmol/L), and bacterial cells were collected at 1 h, 2 h and 4 h. Total cell lysates were Western blotted with TAP-tag antibody and acetylated lysine antibody. RpoA was set as loading control.

图选项

3 讨论 早期研究发现耻垢分枝杆菌随生长时间提高自身Ku蛋白的乙酰化水平，同时耻垢分枝杆菌NHEJ活性逐渐降低^[10]，推测Ku乙酰化修饰可能与细菌NHEJ活性相关。本研究通过表达纯化不同乙酰化状态的Ku蛋白，体外重组NHEJ体系，比较了不同乙酰化状态Ku蛋白的NHEJ活性差异，蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作分析比较了不同乙酰化状态Ku蛋白与大分子相互作用的差异，发现乙酰化水平较高的Ku蛋白具有较低的NHEJ活性以及较低的DNA结合活性，表明Ku蛋白通过乙酰化修饰降低其DNA结合活性，从而降低NHEJ体系的活性，首次证明了原核生物Ku蛋白的活性调控机制。
蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰是一种可逆的翻译后修饰，在真核生物和原核生物中发挥着重要的调控作用，越来越多的证据表明赖氨酸乙酰化修饰可能在结核分枝杆菌引起结核病中起重要作用。例如Liu等^[15]发现临床结核病人T淋巴细胞对结核分枝杆菌免疫原蛋白HspX的62–91位氨基酸组成的肽段有免疫反应，而对乙酰化的该肽段的免疫反应非常微弱。Lange等^[16]发现乙酰化干扰结核菌毒力相关复合物ESAT-6/CFP-10的形成。前期我们测定耻垢分枝杆菌在生长周期的不同时间点的NHEJ活性，首次发现平台期细菌比对数期细菌的NHEJ活性低，这种变化的调控机制尚不清楚，此外我们还检测到平台期细菌的Ku蛋白乙酰化水平比对数期高^[11]。本研究发现乙酰化修饰调节Ku蛋白与DNA的结合力，能够解释上述NHEJ活性变化的现象，即对数期细菌的Ku蛋白乙酰化水平低、DNA结合力较高、NHEJ活性较高，进入平台期Ku蛋白乙酰化程度逐渐升高、DNA结合力降低，从而降低NHEJ活性。
乙酰化修饰是如何调节Ku蛋白与DNA的相互作用呢？我们试图从乙酰化修饰重要位点的空间位置切入。尽管目前尚无原核生物Ku蛋白的晶体结构，其真核同源蛋白的结构已经获得解析。原核生物Ku蛋白与真核生物Ku蛋白的β桶结构域和螺旋臂结构域相似，两者的主要差别是真核生物Ku蛋白N端多了α/β结构域^{[14, 17]}。β桶结构域是DNA结合域，由7个反向平行β片层组成，桶中部的两个β片层之间插入一段70个氨基酸序列形成桥梁状结构(β-bridge)，DNA从β-bridge穿过。β-bridge含有带正电荷的氨基酸，与DNA负电荷互补，形成稳定的DNA-蛋白相互作用。螺旋臂结构域是二聚化区域，原核生物Ku蛋白是由2个Ku蛋白组成的同源二聚体，真核生物Ku蛋白是由结构相似的2个亚基组成的异源二聚体。第29位赖氨酸是重要的乙酰化位点，该位点突变引起分枝杆菌细胞内Ku蛋白表达量和乙酰化水平的变化^[11]以及Ku蛋白DNA结合力的变化(图 6)，该位点对应于真核生物Ku蛋白的第279位赖氨酸，位于真核生物Ku蛋白DNA结合域的β-bridge区域^[18]。因此MsKu 11-273的第29位为赖氨酸时比为精氨酸时DNA结合活性低，可能是赖氨酸或者精氨酸携带的正电荷能够稳定蛋白与带负电荷DNA的相互作用，赖氨酸发生乙酰化修饰中和了正电荷，精氨酸不能发生乙酰化修饰，造成MsKu 11-273蛋白比其K29R突变体的DNA结合力低。
结合本研究(图 7)和早期研究^[11]的实验数据，我们发现耻垢分枝杆菌在三种生理条件下提高自身Ku蛋白乙酰化水平，即进入平台生长时期，面对氧化压力和酸性培养条件，三种生理条件的共性是均不利于细菌生长。我们也发现Ku蛋白的过量表达会造成细菌生长被抑制(图 2)，该表型与NHEJ活性无关(图 3)，与Ku蛋白自身乙酰化水平的低(对数生长时期)或者高(平台生长时期)无关，降低Ku蛋白的DNA结合力(突变体MsKu 11-273)能够消除这种抑制表型。因此猜测Ku蛋白影响细菌生长的工作模型可能是Ku蛋白的DNA结合活性与细菌生长相关，过量的Ku-DNA互作不利于细菌生长，细菌生长被抑制负反馈Ku-DNA互作，Ku-DNA互作的调节机制之一是Ku蛋白的乙酰化修饰，另外一种调节机制是降低Ku蛋白的数量。综上所述，本研究证明Ku蛋白乙酰化修饰的生理功能是调节Ku-DNA相互作用，此外本研究提出了Ku-DNA互作调节细菌生长的工作模型，为深入研究Ku蛋白功能提供新的思路。

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