黄彩微, 廖映辉, 丁琼
海南大学园艺园林学院, 海南 海口 570100
收稿日期：2016-08-24；修回日期：2016-12-01；网络出版日期：2016-12-28
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金（31360107）
*通信作者：丁琼, Tel: +86-898-66273591; E-mail: dingqiong@hainu.edu.cn
摘要： 由于土壤微生物群落物种组成的高度空间异质性，混合样品（sample pooling）被广泛应用于微生物多样性与群落结构研究。在根部真菌的分子检测中，样品混合策略以及测序的克隆数或序列数均对揭示真菌群落结构的准确性有影响。[目的]为建立一套能快速准确地反映杜鹃花属植物根部真菌的物种组成与群落结构的分子检测技术平台，[方法]本研究采集锈红杜鹃和亮鳞杜鹃多份根系样品分别提取DNA，比较PCR扩增前和扩增后混合策略构建的克隆文库中真菌物种组成的差异。[结果]在2种宿主植物根系中，多份样品在PCR扩增后混合构建的克隆文库检测到的根部真菌物种丰富度、真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数均高于扩增前混合的克隆文库。高频度的根部真菌在2种克隆文库中均检测到，但低频度的真菌物种组成在2种克隆文库中完全不同。更重要的是，当采用广泛应用的真菌通用引物ITS1f和ITS4扩增根部真菌ITS序列时，PCR扩增后混合的方法能有效地减轻杜鹃花属植物ITS序列被优先扩增的现象。真菌物种累积曲线显示，当测序的真菌ITS片段克隆数达到50个左右，即能较全面地反映2种杜鹃花根部真菌物种组成。[结论]独立扩增多份根系样品DNA，再将PCR产物混合构建克隆文库的方法能更全面地揭示杜鹃花属植物根部真菌物种丰富度与物种组成。
关键词： 杜鹃花 根部真菌 样品混合 分子检测 物种多样性
Two sample pooling strategies revealed different root-associated fungal diversity of Rhododendron species
Huang Caiwei, Liao Yinghui, Ding Qiong
College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou 570100, Hainan Province, China
Received 24 August 2016; Revised 01 December 2016; Published online 28 December 2016
*Corresponding author: Qiong Ding, Tel: +86-898-66273591; E-mail: dingqiong@hainu.edu.cn
Supported by the Fund for Less Developed Regions of the National Natural Science Foundation of China (31360107)
Abstract: [Objective]Pooling of multiple samples is widely used in studying general patterns of microbial communities that are heterogeneously structured in space. Pooling strategies and the number of sequence reads generate biases in the description of diversity and community structure of root-associated fungi. Therefore, we developed a molecular toolbox for fast and accurate identification of the root-associated fungal community of Rododendron species.[Methods]Multiple root samples of R. lutescens and R. bureavii were collected for DNA extraction. Effects of two different pooling strategies, i.e. pooling samples prior to vs. post PCR, on fungal species composition were studied by comparing results within host species.[Results]Species richness and Shannon-Wiener index of fungal communities of clone library constructed by pooling samples after PCR were higher than that of pooling prior to PCR. High frequency fungal species were detected by both pooling strategies, whereas infrequent species detected by the two strategies differed. Notably, the prior to PCR pooling strategy effectively alleviated the unwanted amplification of host plant sequences when fungal specific primer ITS1f and ITS4 were used. Accumulation curves of fungal species suggested that sequencing at least 50 clones can fully reflect species composition of clone library of the two Rhododendron root-associated fungal community.[Conclusion]Clone library constructed by post PCR pooling of samples is better in providing accurate views of fungal diversity and community structure of Rhododendron species.
Key words: Rhododendron root-associated fungi sample pooling molecular identification species diversity
杜鹃花科 (Ericaceae) 植物与土壤真菌形成的根系共生体，能促进杜鹃花科植物幼苗定居、生长与发育，进而提高其对恶劣生境的耐受能力[1-4]。因此，研究杜鹃花科植物根部真菌 (Root-associated fungi，RAF) 的物种组成有助于揭示其环境适应性机制，对杜鹃花科植物的物种多样性保育与引种栽培有重要意义。以往关于杜鹃花科植物根部真菌的研究多采用传统的分离培养法，即通过PDA、MMN、MA等培养基分离培养根部真菌，然后根据真菌形态学特征鉴定其分类地位[5-8]。由于真菌的种类众多、个体多态性明显，因此传统的分类学指标给真菌的分类鉴定带来了一定的难度；并且传统的形态分类方法所需时间较长，依赖真菌繁殖结构的形态特征，而且常会因为研究者的认知水平与主观判断差异而影响鉴定的准确性[9-10]。此外，有研究表明，大多数RAF不能在人工培养基上生长，能培养的RAF仅占少数[11]。近期应用不依赖于培养的分子生物学技术检测根部真菌发现，担子菌门的部分真菌，如蜡壳耳目真菌能与杜鹃花科植物根系共生，而这类担子菌至今难培养成功[11-13]。因此，不依赖于培养的分子检测技术能更快速、准确、且全面地描绘根部真菌群落结构。然而，由于微生物群落结构在空间上的高度异质性，要全面地描述真菌的群落结构需要较大的样本量，这极大地限制了对真菌的生态学特征的研究[14-15]。如何从有限的样本量中获得充足的物种组成信息，是真菌群落生态学研究中常要面对的问题[14]。当前有关微生物群落的研究通常将多个样品混合后 (pooled) 提取DNA，再扩增适用于区分物种水平差异DNA条形码片段，然后通过构建克隆文库或高通量测序技术来揭示每个混合样品中的物种丰富度、物种组成、群落结构[16-17]。因为混合样品减少了DNA提取与扩增的数量，这一方法广泛应用于土壤真菌、丛枝菌根真菌、外生菌根真菌、内生真菌的生态学研究[16, 18-20]。采用混合样品的取样策略是居于如下假设：分子检测技术可以检测到混合样品中的所有真菌；所有真菌在DNA提取与扩增环节中机会均等，从而能客观、无偏地反映微生物群落结构。然而，一些研究发现，混合样品的策略将会影响观察到的微生物群落结构[15, 17, 21]。此外，每个样品测序的克隆数或高通量测序的序列数，也是影响真菌群落结构能否被全面反映的重要因素之一[21]。我国是世界杜鹃花属植物的分布中心，当前仅有少数研究报道了我国杜鹃花属植物的根部真菌多样性，并且这些研究主要采用传统的分离培养法[5, 7, 22]。建立一套适用于杜鹃花科植物根部真菌多样性研究的分子检测技术平台，是全面揭示我国杜鹃花属植物根部真菌多样性的基础。本研究以亮鳞杜鹃 (Rhododendron heliolepis) 与锈红杜鹃 (Rhododendron bureavii) 为材料，研究真菌多样性分子检测中样品混合策略、以及测序克隆数对揭示根部真菌多样性的影响，为今后全面开展杜鹃花属植物根部真菌的分子检测提供技术支持。
1 材料和方法 1.1 样品采集地 样品采集地为我国四川省会理县龙肘山 (26° 30'?27° 30' N，102° 06'?102° 04' E)，最高海拔3580 m，位于四川西南部横断山脉南段，西边邻接金沙江河谷，南边为云贵高原，是几个自然地理区的交界处；此区域还处于中国-日本植物区系与中国-喜马拉雅植物区系的交界线附近，是世界杜鹃花最大的分布中心。山体基本为南北走向，属中亚热带西部半湿润气候区，光热条件丰富，日照时数多 (年均日照达1700多小时，无霜期达300 d左右)，蒸发旺盛；雨量集中，干湿季分明 (每年的6–10月的降雨量可达全年降雨量的90%左右)。因山体垂直落差大 (最大的垂直高差达2000 m以上)，其气候的垂直变化也很大，山顶气候较为寒冷，冬季常有积雪，年平均气温在7 ℃左右[23]。
1.2 根系采集 在杜鹃花群落中，选取亮鳞杜鹃与锈红杜鹃的成年植株，去除地表的枯枝落叶，沿植株的主干追踪到末端发根 (hair root) 较多的侧根。因为真菌侵染植物根系可能存在空间自相关性，从以主杆为中心点的8个不同的方向追踪发根较多的侧根，以最大限度抽检到多样性的RAF。将从不同方位追踪到的侧根剪下后抖掉表面附着的土壤，分别置于装有75%酒精的200 mL离心管常温保存，带回实验室后置于?80 ℃冰箱中保存，直到提取根系DNA。
1.3 真菌分子检测
1.3.1 DNA提取: 将侧根从离心管中取出后，用流水洗净侧根表面附着的泥土，最后用无菌水清洗2遍。从侧根上不同的方位摘取长约1 cm的发根，共计20段，用去离子水清洗2遍，置于灭过菌滤纸上吸干多余的水分，转移到1.5 mL的离心管中，每管加入50 μL CTAB提取缓冲液 (1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5 mol/L EDTA pH 8.0，5 mol/L NaCl，2% CTAB (W/V))，放置于?80 ℃冰箱冷冻2 h后取出，在高通量多样品组织研磨仪 (南京先欧仪器制造有限公司，型号：TS-48) 粉碎发根组织，采用改良的CTAB法提取DNA[24]。具体步骤如下：抽取650 μL CTAB提取缓冲液加入装有DNA的离心管中，65 ℃水浴1 h (每15 min摇荡1次)。取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇 (24：1，V/V) 后摇匀，室温下12000 r/min离心8 min，吸取上清液，重复操作1次，重取上清。往抽取到的上清液中加入2倍体积的冰无水乙醇，置于?20 ℃冰箱中沉淀过夜。将过夜的离心管取出，室温下12000 r/min离心8 min，弃上清液，加75%乙醇500 μL润洗2次，将沉淀物放入60 ℃烘箱烘干，最后向DNA沉淀中加20 μL的无菌水溶解，置?20 ℃冰箱中保存。:
1.3.2 ITS扩增: 采用PCR法扩增真菌的内转录间隔区，扩增引物为TIS1f (5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′)。每25 μL PCR反应体系含有：2.5–25.0 ng模板DNA，1 μL (2.5 mmol/L) dNTPs，2.5 μL 10×PCR缓冲液 (TaKaRa，Otsu，Japan)，ITS1f与ITS4引物各1 μL (10 μmol/L)，1.5 U Taq DNA聚合酶 (TaKaRa，Otsu，Japan)。PCR反应程序：95 ℃；94 ℃，55 ℃，72 ℃ 55 s；30个循环；72。将ITS-PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪观察、拍照。PCR扩增时采用的DNA模板设两种处理：混合DNA与独立DNA模板。前者是从提取的8份DNA中各取2 μL混合后，取出1 μL为模板进行扩增；后者是从提取的8份DNA中各取1 μL分别进行扩增。:
1.3.3 PCR产物克隆及测序: 用于构建克隆文库的PCR产物有2种，一种是PCR扩增前混合DNA模板，另一种是DNA模板单独PCR扩增后混合PCR产物。将2种PCR产物分别进行电泳后切胶回收，以回收的PCR产物为外源DNA，克隆到pMD19-T Vector (TaKaRa，Otsu，Japan)，在16 ℃下连接过夜，用E. coli DH5α感受态细胞 (TaKaRa，Otsu，Japan) 进行转化。从真菌的每个克隆文库中随机挑选48个呈白斑的克隆，用引物ITS1f和ITS4扩增；PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。电泳检测呈阳性PCR产物委托上海生物工程有限公司进行测序。:
1.3.4 生物信息学分析: 在Bioedit软件中对真菌的ITS1-5.8S-ITS2全序列进行编辑和比对。ITS序列一致性 (identity)≥97%的真菌被视为同一个分类单元 (Operational Taxonomical Unit，OTU)[25]。每个OTU的参考序列与NCBI数据库中的序列进行比对，检索与之亲缘关系最近的真菌序列。: 1.4 数据分析 用软件Estimate S 9中提供的Bootstrap方法估计宿主植物根部真菌2种克隆文库的物种丰富度，计算Shannon-weiner多样性指数，并用物种累积曲线评估每一种克隆文库中检测的克隆数是否足以全面地反映克隆文库中的物种丰富度。
2 结果和分析 2.1 独立与混合DNA模板对真菌ITS-PCR扩增的影响 锈红杜鹃与亮鳞杜鹃根部真菌DNA扩增均得到了长度范围在600–800 bp的ITS片段。锈红杜鹃毛根的混合DNA模板ITS-PCR扩增效率较低，电泳检测呈弱阳性，而8份独立DNA模板中，有6份DNA模板的ITS-PCR扩增效率较高，有2份DNA模板扩增效率较低，获得的PCR产物量浓度较低。在亮鳞杜鹃中，混合与单个DNA模板扩增的差异不明显，PCR产物电泳检测均呈强阳性 (图 1)。
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| 图 1. 杜鹃花根系多份DNA混合与不混合的PCR扩增真菌ITS序列产物的电泳比较 Figure 1. Agarose gel electrophoresis of ITS-PCR products obtained from amplification of pooled and unpooled multiple DNA extractions of root-associated fungi of Rhododendron plants. Capital letters A and B represent R. heliolepis and R. bureavii, respectively; M: DL2000 DNA marker; a: pooled sample; b, 1–8: unpooled sample. |
| 图选项 |
2.2 两种杜鹃花不同混合克隆文库的阳性克隆比较 亮鳞杜鹃2种克隆文库的阳性克隆所占比例都高达95%左右。锈红杜鹃PCR扩增后混合样品克隆文库的阳性克隆比例有85%，高于PCR扩增前混合的克隆文库69% (表 1)。2种克隆文库检测到的ITS片段长度均在600–800 bp之间，且2种杜鹃属植物的根系共生体的ITS片段长度多态性在PCR扩增后混合的克隆文库中均高于PCR扩增前混合样品克隆文库 (图 2)。
表 1. 亮鳞杜鹃和锈红杜鹃根部真菌ITS序列与GenBank数据库最相似的序列，以及各种真菌在采用PCR扩增前与PCR扩增后混合策略构建的克隆文库中检测到的序列数 Table 1. Phylogenetic affinity of Rhododendron root-associated fungi inferred from closest matches of ITS sequences of GenBank database, and a comparison of the number of sequences of fungi detected in clone libraries constructed by prior to PCR and post PCR pooling of samples
| OTU | name | Closest BLAST match | Identity | GenBank accession No. | No. of clones | |||
| R. bureavii | R. heliolepis | |||||||
| Prior to PCR pooling | Post PCR pooling | Prior to PCR pooling | Post PCR pooling | |||||
| 1 | Ascomycota sp1 | Ascomycota sp. (HF947897) | 393/463 (85%) | KX765310 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | Ascomycota sp2 | Ascomycota sp. (JQ272357) | 484/519 (93%) | KX765311 | 3 | 3 | 0 | 0 |
| 3 | Ascomycota sp3 | Talaromyces emodensis (NR_137077) | 173/188 (92%) | KX765312 | 0 | 4 | 0 | 0 |
| 4 | Basidiomycota sp. | Basidiomycota sp. (KF385378) | 419/445 (94%) | KX765313 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | Dothideomycetes sp. | Dothideomycetes sp. (JQ347004) | 478/482 (99%) | KX765314 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 6 | Helotiales sp1 | Helotiales sp. (FJ827178) | 550/553 (99%) | KX765315 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 7 | Helotiales sp2 | Helotiales sp. (HF947858) | 334/379 (88%) | KX765316 | 0 | 5 | 0 | 0 |
| 8 | Helotiales sp3 | Helotiales sp. (LC131016) | 518/527 (98%) | KX765317 | 5 | 14 | 0 | 0 |
| 9 | Hyaloscypha daedaleae | Hyaloscypha daedaleae (AY789416) | 465/481 (97%) | KX765318 | 4 | 0 | 0 | 0 |
| 10 | Hyaloscyphaceae sp. | Hyaloscyphaceae sp. (GU393951) | 491/510 (96%) | KX765319 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 11 | Lachnum sp. | Lachnum sp. (FJ440910) | 501/509 (98%) | KX765320 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 12 | Leotiaceae sp. | Pezoloma ericae (JQ272407) | 452/476 (95%) | KX765321 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 13 | Leotiomycetes sp. | Leotiomycetes sp. (HM230865) | 504/506 (99%) | KX765322 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 14 | Mycena alnetorum | Mycena alnetorum (JF908426) | 634/647 (98%) | KX765323 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 15 | Oidiodendron sp. | Oidiodendron sp. (JQ272359) | 505/512 (99%) | KX765324 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| 16 | Phialocephala fortinii | Phialocephala fortinii (JQ272457) | 502/518 (97%) | KX765325 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| 17 | Sebacinaceae sp. | Sebacina sp. (JQ420967) | 584/624 (94%) | KX765326 | 0 | 0 | 0 | 8 |
| 18 | Sebacinales sp. | Sebacinales sp. (EF127237) | 620/627 (99%) | KX765327 | 0 | 0 | 1 | 13 |
| 19 | Xenasmataceae sp. | Xenasmataceae sp. (JQ272394) | 552/577 (96%) | KX765328 | 4 | 0 | 0 | 0 |
| 20 | Rhododendron bureavii | Rhododendron bureavii(JF978214) | 627/627 (100%) | KX765329 | 14 | 13 | 0 | 0 |
| 21 | Rhododendron heliolepis | Rhododendron heliolepis (KM605838) | 688/688 (100%) | KX765330 | 0 | 0 | 44 | 5 |
| Total | Positive clones/False positive clones | 33/15 | 43/5 | 46/2 | 47/1 | |||
表选项
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| 图 2. PCR扩增前与PCR扩增后混合样品构建的克隆文库ITS片段长度多态性 Figure 2. Fragment length polymorphism of PCR amplifications of fungal ITS region of clone libraries constructed by post PCR pooling of multiple DNA extractions of replicate root samples and prior to PCR pooling replicates. Capital letters A and B represent R. heliolepis and R. bureavii, respectively; M: DL2000 DNA marker; 1: post PCR pooling replicates; 2: prior to PCR pooling replicates. |
| 图选项 |
2.3 PCR扩增前与PCR扩增后2种混合策略克隆文库的共生真菌多样性比较 从锈红杜鹃与亮鳞杜鹃根系的ITS片段的2种克隆文库中共挑出192个呈白斑的克隆，PCR检测呈阳性的169个，经测序及序列分析，最终划分成21个OTUs，其中有2个OTUs为宿主植物序列 (表 1)。在19个真菌OTUs中，锈红杜鹃根部真菌的PCR扩增前与扩增后2种混合克隆文库分别检测到的真菌物种数为6和7种；香农维纳指数 (Shannon-Wiener index) 分别为1.49和1.83。而亮鳞杜鹃根系的PCR扩增前混合样品的克隆文库中只检测到2种真菌，丰富度远远小于扩增后混合样品的克隆文库检测到的8种真菌，且PCR扩增前混合样品的克隆文库Shannon-Wiener index为2.45，而扩增后混合克隆文库只有0.23 (图 3)。从锈红杜鹃根系中检测到的根部真菌中，频度最高的2种真菌在2种不同混合策略构建的克隆文库中均被检测到，而频度相对较低的真菌只出现在其中的一个克隆文库中；相似地，亮鳞杜鹃根系共生菌中，被高频检测到的2种真菌同时出现在2种混合策略构建的克隆文库，而低频真菌只出现在PCR扩增后混合样品的克隆文库中 (表 1)。
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| 图 3. 采用PCR扩增前与PCR扩增后混合策略构建的克隆文库检测到的根部真菌物种丰富度与多样性比较 Figure 3. Comparison of the effects of prior to PCR and post PCR pooling strategies in affecting the Bootstrap estimated spices richness (A) and diversity (B) of root associated fungal clone libraries of R. bureavii and R. heliolepis. |
| 图选项 |
2.4 PCR扩增前与PCR扩增后混合策略对引物ITS1f与ITS4扩增ITS片段影响 序列分析的结果表明：当采用根系-真菌共生体提取的总DNA为模板时，真菌特异性引物ITS1f与ITS4能同时扩增宿主植物与真菌的ITS区。然而不同的样品混合策略会影响真菌及植物ITS序列与引物的竞争性结合。从PCR扩增后混合样品克隆文库中检测到真菌的ITS片段相对于植物的比值 (2.30) 远高于PCR扩增前混合样品的克隆文库 (1.36)。对亮鳞杜鹃而言，PCR扩增后混合策略检测到的真菌ITS序列数是植物序列数的8.4倍，而PCR扩增前混合策略中真菌的ITS序列数远低于植物的序列数，二者比值仅有0.05 (图 4)。
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| 图 4. PCR扩增前与PCR扩增后混合策略对引物ITS1f与ITS4扩增到的真菌与植物ITS序列数比值的影响 Figure 4. Effect of prior to PCR and post PCR pooling of samples on the ratio of fungal to plant sequence numbers when primers ITS1f and ITS4 were used. A: R.bureavii; b: R. heliolepis. |
| 图选项 |
2.5 根系ITS片段的物种累积曲线 2种杜鹃花根系DNA不同混合样品克隆文库的ITS片段物种累积曲线显示，随着检测的ITS片段克隆数增加，被检测到的物种数增加。然而，在锈红杜鹃的2种克隆文库以及亮鳞杜鹃的PCR扩增后混合样品的克隆文库中，当检测的ITS片段克隆数达到30个以上，物种数增加的趋势减缓。而亮鳞杜鹃PCR扩增前混合样品克隆文库中，当检测的ITS片段克隆数达到3个以上，物种数增加的趋势变平缓。可见，本研究检测48个真菌克隆，已能够较全面地反映2种杜鹃花根系DNA不同克隆文库的物种组成 (图 5)。
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| 图 5. 两种混合样品策略构建的杜鹃花根部真菌克隆文库的物种累积曲线 Figure 5. Accumulation curves of Rhododendron root-associated fungal species of clone libraries constructed by two pooling strategies. |
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3 讨论 微生物群落生态学研究中，由于微生物在空间分布上的高度异质性，需要采集大量样品才能全面反映微生物群落的物种丰富度与多样性。为了减少需要处理的样品数，混合样本的方法被普遍用于微生物如土壤真菌、丛枝与外生菌根真菌、内生真菌多样性检测[16, 18-20]。然而应用传统与二代测序技术的群落生态学研究结果均表明，分子生态学研究中混合样品法对揭示微生物群落结构存在偏差[15, 17, 21]。目前尚未有关于混合样品是否会影响杜鹃花属植物根部真菌群落物种组成的报道。本研究以锈红杜鹃与亮鳞杜鹃根系为材料，比较了PCR扩增前与扩增后2种混合策略、以及检测的克隆数对揭示根部真菌群落物种组成的影响。结果表明，对2种杜鹃花宿主植物而言，独立扩增多份根系共生体的DNA后再将PCR产物混合构建克隆文库的方法检测到的根部真菌物种丰富度、共生真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数均高于PCR扩增前混合样品的克隆文库。Avis等用已知的真菌构建人工群落来研究样品的不同混合策略对揭示真菌群落物种组成的影响，发现观察到的真菌物种丰富度、物种组成随样品混合方式不同而存在差异[15]。我们的研究结果表明，在锈红杜鹃与亮鳞杜鹃根系中被高频检测到的真菌种类在2种克隆文库中均检测到，如Helotiales sp3 (OTU8) 和Phialocephala fortinii (OTU16)，但是低频度检测到的真菌物种组成在两种克隆文库中不同，如Helotiales sp2 (OTU7) 与Dothideomycetes sp. (OTU5) 等11种真菌只出现PCR扩增后混合样品克隆文库中，而Ascomycota sp1 (OTU1) 与Hyaloscyphaceae sp. (OTU10) 等4种真菌只出现在PCR扩增前混合样品的克隆文库中。这一结果可能是因为PCR扩增前混合样品的方法降低了一些真菌 (尤其是低频度的真菌) 的DNA模板浓度，在PCR过程中，各种真菌的DNA模板与引物非对等的竞争性结合，高浓度的优势真菌更容易与引物相结合而被检测出来，而DNA浓度相对较低的真菌与引物结合处于竞争性弱势而被掩盖，导致揭示的真菌群落物种丰富度较低。因此，独立扩增多份根系DNA后，再将PCR产物混合构建克隆文库的方法容易检测到更多的偶见种真菌，更能全面地反映杜鹃花属植物根部真菌物种丰富度与物种组成。此外，本研究发现，2种混合策略的克隆文库均检测到杜鹃花植物的ITS序列。真菌通用引物ITS1f与ITS4常用于环境样品的真菌群落物种多样性、群落结构研究[24, 26]。虽然对于裸子植物的根系共生体而言，这对引物能优先扩增真菌的ITS序列，而在被子植物根系共生体中，ITS1f与ITS4引物可能会同时扩增植物与真菌的ITS序列[24]。本研究结果也表明，当采用杜鹃花属植物的根系-真菌共生体提取的总DNA为模板时，真菌特异性引物ITS1f与ITS4能同时扩增宿主植物与真菌的ITS区。此外本研究发现，将多个不同的DNA样品混合后，进行PCR再测序的方法会过多地增加植物的扩增子，而减少真菌的扩增子。这一现象可能是由于PCR前混合样品使一些真菌与植物的核酸相对浓度降低，因而优先扩增植物序列。假设在同一植株的4个 (本研究是8个) 不同的位置 (a，b，c，d) 采集侧根，在每份侧根提取的总DNA中，假设植物核酸浓度为Np，真菌核酸浓度在4份样品中分别为：Nfa、Nfb、Nfc、Nfd，其中N代表核酸 (Nuclear acid)，f代表真菌 (fungi)，P代表植物 (Plant)。因此，在扩增前不混合的样品中，植物与真菌的核酸浓度可以表达为如下公式：Np+Nfa，或Np+Nfb，或Np+Nfc，或Np+Nfd，而当PCR扩增前混合4份毛根的总DNA时，植物与真菌的核酸浓度可以用如下公式计算：(Np+Nfa+Np+Nfb+Np+Nfc+Np+Nfd)/4=Np+Nfa/4+Nfb/4+Nfc/4+Nf4/4，可以看出，在2种混合样品策略中，植物的核酸浓度基本不变，而在扩增前混合的PCR体系中，每种真菌的浓度只有原浓度的1/4。由于PCR前混合样品使每种真菌与植物的核酸相对浓度降低，因而优先扩增植物序列。因此，诸如杜鹃花属之类的被子植物根部真菌研究中，有必要采用独立扩增多份根系DNA模板后再将PCR产物进行混合，可以避免每份样品中特定类群真菌DNA的相对浓度降低，从而提高各类真菌的DNA模板与引物结合的概率。
此外，每个样品测序的克隆数或高通量测序的序列数，也是影响真菌群落结构能否被全面反映的重要因素之一[27]。Avis等检测了由已知的2–20种真菌混合后构建的人工群落，结果表明测序的真菌克隆数达92个时，能检测到人工群落中的90%左右的物种，而当测序32个克隆时只能检测到40%的物种[15]。本研究的锈红杜鹃与亮鳞杜鹃根部真菌的物种累积曲线表明，检测50个左右的真菌克隆已能够较全面地反映2种杜鹃花属植物根部真菌克隆文库的物种组成。值得注意的是，本研究中2种杜鹃花的根部真菌克隆文库的物种组成相似性极低，没有共有的真菌。因此，多样性的宿主植物可能是共生真菌多样性的重要驱动因子之一，更广泛地开展杜鹃花属植物根部真菌分子检测，才能全面反映其共生真菌多样性。本研究建立的适用于杜鹃花科植物根部真菌多样性研究的分子检测技术平台，为全面揭示我国杜鹃花属植物根部真菌多样性奠定基础。
致谢: 感谢美国佛罗里达国际大学的刘虹教授对本稿的英文摘要作了全面细致的校对与修改。
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