周天山
, 余有本, 肖斌, 鮑露, 高岳芳 西北农林科技大学园艺学院, 陕西 杨凌 712100
收稿日期：2016-08-19；修回日期：2016-12-01；网络出版日期：2016-12-12
基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-23）
*通信作者：周天山, Tel/Fax:+86-29-87082613;E-mail:zhoutianshan@nwsuaf.edu.cn
摘要： [目的]操纵茶树类黄酮3'-羟基化酶，生物合成B环-3'，4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。[方法]构建了4个茶树类黄酮3'-羟基化酶基因（CsF3'H）和拟南芥的P450还原酶基因（ATR）融合表达质粒：SUMO-CsF3'H[7-517]：：ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]：：ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR2[75-711]3 AA，分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21，获得12个转化菌株S1-S12；构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因CsF3'H表达质粒pYES-Dest52-CsF3'H，转化酵母菌株WAT11，得到转化菌株S13；构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因CsF3'H表达质粒pES-URA-CsF3'H，及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因AtFLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H：：AtFLS 9AA，二者共转化酵母菌株WAT11，获得转化菌株S14。[结果]转化SUMO-CsF3'H[28-517]：：ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25℃条件下发酵，转化效率最高，能将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，分别转化生成287.93 μmol/L圣草酚、131.76 μmol/L二氢槲皮素和188.62 μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，最多能转化生成734.32 μmol/L圣草酚、446.07 μmol/L二氢槲皮素和594.64 μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素，在发酵36-48 h中，最多能生成1412.16 μmol/L圣草酚、490.25 μmol/L山奈酚、445.75 μmol/L槲皮素、66.75 μmol/L二氢槲皮素和73.50 μmol/L二氢山奈酚。[结论]本研究首次将茶树类黄酮3'-羟基化酶基因应用于B环-3'，4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。
关键词： 茶树类黄酮3'-羟基化酶 B环-3', 4'-二羟基黄酮类化合物 生物合成
Engineering of a flavonoid 3'-hydroxylase from tea plant (Camellia sinensis) for biosynthesis of B-3', 4'-dihydroxylated flavones
Tianshan Zhou
, Youben Yu, Bin Xiao, Lu Bao, Yuefang Gao College of Horticulture, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China
Received 19 August 2016; Revised 01 December 2016; Published online 12 December 2016
*Corresponding author: Tianshan Zhou, Tel/Fax:+86-29-87082613;E-mail:zhoutianshan@nwsuaf.edu.cn
Supported by the earmarked fund for Modern Agro-industry Technology System (CARS-23)
Abstract: [Objective]A flavonoid 3'-hydroxylase from tea plant was engineered to synthesize B-3', 4'-dihydroxylated flavones such as eriodictyol, dihydroquercetin and quercetin.[Methods]Four articifical P450 constructs harboring both flavonoid 3'-hydroxylase gene from Camellia sinensis (CsF3'H) and P450 reductase gene from Arabidopsis thaliana (ATR1 or ATR2) were introduced into Escherichia coli strains TOP10, DH5α and BL21, resultantly engineering strains S1 to S12. The plasmid pYES-Dest52-CsF3'H harboring CsF3'H gene was introduced into yeast Saccharomyces cerevisiae WAT11 designated as strain S13. The plasmid pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9 AA was constructed through fusing flavanone 3-hydroxylase gene from Camellia sinensis (CsF3H) and flavonol synthase gene from Arabidopsis thaliana (AtFLS). Plasmid pES-URA-CsF3'H and pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9 AA were then co-introduced into yeast S. cerevisiae WAT11 designated as strain S14.[Results]Strain S6 generated highest bioconversion efficiency at 25℃ among all E. coli strains during 24 h fernentation. Supplemented with 1000 μmol/L naringenin, dihydrokaempferol and kaempferol, the maximum amounts of eriodictyol, dihydroquercetin and quercetin produced by strain S13 were 734.32 μmol/L, 446.07 μmol/L and 594.64 μmol/L respectively. Supplemented with 5 mmol/L naringenin, the maximum amounts of eriodictyol, kaempferol, quercetin, dihydroquercetin and dihydrokaempferol produced by strain S14 were 1412.16 μmol/L, 490.25 μmol/L, 445.75 μmol/L, 66.75 μmol/L and 73.50 μmol/L during 36-48 h fermentaion respectively.[Conclusion]CsF3'H was engineered for biosynthesis of B-3', 4'-dihydroxylated flavone.
Key words: flavonoid 3'-hydroxylase from Camellia sinensis B-3', 4'-dihydroxylated flavones biosynthesis
类黄酮化合物是普遍存在的植物次生代谢产物，由苯丙烷代谢途径合成[1]，其基本的化学结构为2个苯环 (A环和B环) 通过杂环吡喃 (C环) 连接，共15个碳组成[2]，主要包括黄烷酮类、黄酮类、二氢黄酮醇类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷醇类及其他类。大量的研究表明，类黄酮化合物具有广泛的生物学功能，如抗氧化、清除自由基和防止心血管疾病等[3-5]，因此类黄酮化合物已成为人类保健食品中的重要成分。从植物中提取和化学合成类黄酮化合物效率低，已无法满足日益扩张的市场需求。随着分子生物学和基因信息学的快速发展，组合生物合成 (combinatorial biosynthesis) 为类黄酮化合物的生产提供有效方式，且方法简单省去了化学合成中繁琐的步骤[6-7]。一些原核微生物和真核微生物如大肠杆菌、酵母，已用于类黄酮化合物的生产[8]。
通过清除自由基或螯合金属离子，类黄酮化合物上的功能性羟基调节着它们的抗氧化能力[9-10]。根据B环羟基化类型，类黄酮化合物可分为B环4′-单羟基化合物，B环-3′, 4′-二羟基化合物和B环-3′, 4′, 5′-三羟基化合物。B环4′-羟基来源苯丙烷途径中的对香豆酰辅酶A，而B环3′位、B环3′, 5′位羟基化分别由2个细胞色素P450酶催化，即类黄酮3′-羟化酶 (F3′H) 和类黄酮3′, 5′-羟化酶 (F3′5′H)[11-14]。在类黄酮生物合成途径中，类黄酮3′-羟化酶催化柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚的B环3′位羟基化，分别生成圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素，如图 1所示。
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| 图 1. B环-3′, 4′-二羟基黄酮类化合物生物合成途径[15] Figure 1. The biosynthetic pathway of B-3', 4'-dihydroxylated flavones. F3′H: flavonoid 3′-hydroxylase; F3H: flavanone 3-hydroxylase; FLS: flavonol synthase[15]. |
| 图选项 |
儿茶素属于黄烷醇类化合物，在茶叶中含量为12%–24% (干重)[16]，如此高的含量也预示着茶树类黄酮合成途径中的关键酶具有较强的生物学活性。因此，本试验将茶树类黄酮3'-羟基化酶基因、拟南芥的P450还原酶基因、茶树黄烷酮3-羟基化酶基因和拟南芥黄酮醇合成酶基因，以融合表达或共表达方式构建发酵菌株，尝试生物合成圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素这3种B环-3′, 4′-二羟基黄酮类化合物。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 植物材料: 茶树良种乌牛早的新梢 (一芽一叶) 采自西北农林科技大学西乡茶叶试验站种质资源圃，拟南芥叶片采自本实验室种植的Col-0生态型拟南芥植株。所采摘的叶片立即投入液氮冷冻，再放入–80 ℃冰箱保存备用。:
1.1.2 菌株: Escherichia coli TOP10、E. coli DH5α、E. coli BL21和Saccharomyces cerevisiae WAT11，质粒pYES-Dest52、pES-URA和pES-HIS为本实验室保存。:
1.1.3 主要试剂: 柚皮素[(±)-naringenin]、圣草酚[(±)-eridodictyol]、二氢山奈酚[(±)-dihydrokaempferol]、山奈酚 (kaempferol)、二氢槲皮素 (dihydroquerctin)、槲皮素 (quercetin) 购自Sigma-Aldrich公司 (USA)。: 1.2 基因克隆 按照TaKaRa RNAiso Plus Total RNA试剂盒操作说明，分别从拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和茶树 (Camellia sinensis) 叶片中提取总RNA，采用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent kit合成cDNA第一链。
根据NCBI登录的拟南芥细胞色素P450还原酶基因 (ATR)、黄酮醇合成酶基因 (FLS) 序列和茶树的类黄酮3’-羟基化酶基因 (F3′H)、黄烷酮3-羟基化酶基因 (F3H) 的序列，设计PCR引物 (表 1)。50 μL PCR反应体系含10 μL 5×HF PCR缓冲液、4 μL dNTPs (浓度为10 mmol/L)、2.5 μL上、下游引物 (浓度为10 μmol/L)、4 μL cDNA (浓度为50 ng/ μL)、0.5 μL Phusion? High-Fidelity DNA聚合酶和26.5 μL ddH2O。PCR反应程序为：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s，63 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，35个循环；68 ℃ 5 min；反应产物4 ℃保存。
表 1. 用于基因克隆的引物 Table 1. Primers used for cloning process
| Access Nos. | Primers | Sequences (5′→3′) |
| KT180309 | CsF3′H pENTR F | CACCATGACTTCCTTAGCTTTTGTTC |
| CsF3′H pENTR R | TTAGGCCCGATACACATGGGGTG | |
| U84260.1 | AtFLS pENTR F | CACCATGGAGGTCGAAAGAGTCC |
| AtFLS pENTR R | TCAATCCAGAGGAAGTTTATTGAG | |
| AY641730.1 | CsF3H pENTR F | CACCATGGCGCCAACAACAACGC |
| CsF3H pENTR R | TCAAGCAAAAATCTCATCAGTGC | |
| NM 118585.3 | ATR1 pENTR F | CACCATGACTTCTGCTTTGTATGCTTCCG |
| ATR1 pENTR R | TCACCAGACATCTCTGAGGTATCTTCC | |
| NM 119167.3 | ATR2 pENTR F | CACCATGTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCAAC |
| ATR2 pENTR R | TTACCATACATCTCTAAGATATCTTCCAC | |
| Underlined sequence indicates the 4 base pair sequences necessary for directional cloning on the 5′ end of the forward primer. | ||
表选项
扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，按照天根DNA回收试剂盒操作说明回收PCR产物，再采用Invitrogen INC公司的TOPO cloning kit将PCR产物连接到pENTR载体上，接着转化E. coli TOP10感受态细胞，37 ℃倒置培养12–16 h。菌液PCR筛选阳性克隆，由天根质粒提取试剂盒提取质粒，送华大基因测序验证。
1.3 表达载体构建 ExpressoTM T7 sumo cloning kit (Lucigen) 被用来构建表达质粒，1.2中经测序确认的pENTR质粒被用作DNA模板。
表 2. 用于构建表达质粒的引物 Table 2. The primers used for constructing expression plasmids
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| CsF3′H[7—517] sumo F | CGCGAACAGATTGGAGGTGCAACTCTATTTCTCACA |
| CsF3′H [28—517] sumo F | CGCGAACAGATTGGAGGTCGTCGCAACCGCAGCCAC |
| CsF3′H[7/28—517]::ATR1 mid R | ATCCGCCGTCGTTTTACCCGAACCACCCGACCCGAGTCC |
| CsF3′H::ATR1[49—688] mid F | GGACTCGGGTCGGGTGGTTCGGGTAAAACGACGGCGGAT |
| ATR1 [49—688] sumo R | GTGGCGGCCGCTCTATTACCAGACATCTCTGAGGTATCTTCC |
| CsF3′H [7/28—517]::ATR2 mid R | ATTCCCAGAACCGGAACCCGAACCACCCGACCCGAGTCC |
| CsF3′H::ATR2[75—711] mid F | GGACTCGGGTCGGGTGGTTCGGGTTCCGGTTCTGGGAAT |
| ATR2[75—711] sumo R | GTGGCGGCCGCTCTATTACCATACATCTCTAAGATATCTTCC |
| CsF3H sumo F | CGCGAACAGATTGGAGGTGCGCCAACAACAACGCTTACG |
| CsF3H::AtFLS mid 9 AA R | GACTCTTTCGACCTCACCACCGGAGCCACCAGAGCCACCGCTAGCAAAAATCTCATC |
| CsF3H::AtFLS mid 9 AA F | GATGAGATTTTTGCTAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCCGGTGGTGAGGTCGAAAGAGTC |
| AtFLS sumo R | GTGGCGGCCGCTCTATTATCAATCCAGAGGAAGTTTATT |
| CsF3′H EcoR I F | GAATTCATGACTTCCTTAGCTTTTGTTC |
| CsF3′H Spe I R | ACTAGTTTAGGCCCGATACACATGGGGTG |
| CsF3H::AtFLS EcoR I F | GAATTCGCGCCAACAACAACGCTTACG |
| CsF3H::AtFLS Spe I R | ACTAGTTTCAATCCAGAGGAAGTTTATT |
| Underlined sequence indicates the sequences necessary for performing enzyme-free cloning. The linker sequences of the fusion cDNA are indicated in italic. Boldface indicates restriction enzyme cleavage site. | |
表选项
CsF3'H与ATR1融合：采用两轮PCR的方法，将CsF3'H和ATR1融合在一起，连接序列为编码3个氨基酸 (Gly-Ser-Gly) 的基因序列，引物如表 2所示。第1轮PCR中，引物CsF3′H[7—517] sumo F与CsF3′H[7/28—517]::ATR1 mid R配合，或引物CsF3′H[28—517] sumo F与CsF3′H[7/28—517]::ATR1 mid R配合，扩增CsF3′H；引物CsF3′H::ATR1[49—688] mid F与ATR1[49—688] sumo R配合扩增ATR1。第2轮PCR中，混合第1轮PCR中的2个产物作为DNA模板，引物CsF3′H[7—517] sumo F和ATR1[49—688] sumo R配合，或引物CsF3′H[28—517] sumo F和ATR1[49—688] sumo R配合，扩增融合的CsF3′H::ATR1 3 AA，融合的PCR产物按试剂盒说明连接到SUMO载体上，得到重组质粒SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49—688] 3 AA和SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA。采用相同的方法，将CsF3'H与ATR2融合，获得重组质粒SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA和SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA。另外还扩增了通过编码9个氨基酸 (Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly) 基因片段连接的CsF3H::AtFLS融合cDNA，并插入到SUMO质粒中，得到重组质粒SUMO-CsF3H::AtFLS 9 AA。
按Invitrogen公司LR Clonase? Ⅱ Plus Enzyme Mix试剂盒说明，通过LR交换反应，将克隆质粒pENTR上的目的基因转移到载体pYES-Dest52上，获得酵母表达质粒pYES-Dest52-CsF3′H。
为将CsF3′H和CsF3H::AtFLS 9 AA分别连接到酵母共表达载体pES-URA和pES-HIS上，引入了EcoRⅠ和SpeⅠ两个酶切位点，再分别以pENTR-CsF3′H和SUMO-F3H::FLS 9 AA为模板，构建了表达质粒pES-URA-CsF3′H和pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9AA。
E. coli BL21、TOP10、DH5α和S. cerevisiae WAT11被用作表达菌株，分别转化以上不同质粒，其中酵母转化采用ZYMO RESEARCH公司的Frozen-EZ Yeast Transformation ⅡTM试剂盒。再由不同的抗生素或营养缺陷培养基筛选获得不同生物发酵菌株 (表 3)，所有菌株都经测序验证。
表 3. 所构建的生物发酵菌株 Table 3. Construction of strains used for fermentation
| No. | Expressing plasmids | Transformed strains |
| S1 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli BL21 |
| S2 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli BL21 |
| S3 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli BL21 |
| S4 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli BL21 |
| S5 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli Top10 |
| S6 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli Top10 |
| S7 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli Top10 |
| S8 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli Top10 |
| S9 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli DH5α |
| S10 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA | E. coli DH5α |
| S11 | SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli DH5α |
| S12 | SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA | E. coli DH5α |
| S13 | pYES-Dest52-CsF3′H | S. cerevisiae WAT11 |
| S14 | pES-URA-CsF3′H、pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9AA | S. cerevisiae WAT11 |
表选项
1.4 生物发酵 大肠杆菌发酵：将转化菌株S1-S12，分别接入带有相应的抗生素LB液体培养基中，37 ℃培养过夜；第2天，取若干份50 mL加有抗生素的LB液体培养基，分别接入转化菌株S1-S12的种液1 mL，37 ℃培养至OD600达到0.6时，向其中添加IPTG至终浓度0.5 mmol/L，转入25 ℃或30 ℃振荡培养；诱导2 h后，向菌液中加入相应的底物 (柚皮素或二氢山奈酚或山奈酚)，所有底物都用DMSO溶解。
酵母发酵：将转化菌株S13 (或S14)，接入15 mL SD-Urail (或SD-Urail-His) 液体培养基中，30 ℃振荡培养24 h；再将以上菌液全部转入50 mL含20 g/L葡萄糖的SD-Urail液体培养基中，30 ℃振荡培养24 h；1600×g、5 min离心收集酵母细胞，弃去上清，细胞沉淀用20 mL含20 g/L半乳糖的SD-Urail (或SD-Urail-His) 液体培养基重新悬浮；1600×g、5 min离心再次收集酵母细胞，弃去上清，细胞沉淀用含20 g/L半乳糖的SD-Urail (或SD-Urail-His) 液体培养基悬浮，并将OD600调至0.4左右；以上悬浮液16 ℃振荡培养12 h后，向菌液中加入相应的底物 (柚皮素或二氢山奈酚或山奈酚)。
1.5 发酵产物提取与分析 添加底物后的2、4、6、8、10、12、24、36、48和60 h，分别取1 mL发酵菌液，加入1 mL 100%的甲醇，涡旋振荡提取5 min，再13500×g离心10 min，取出上清，经0.2 μm膜过滤，上液相分析。
液相分析条件：选用SHIMADZU公司LC-20AT液相色谱，SPD-M20A检测器，色谱柱为Gl Sciences Inc公司的Wondasil C18，5 μm，4.6 mm×150 mm。分析条件为：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱，A相在10 min内由10%增至40%，再在5 min内由40%上升至60%，而后在2 min内降至10%；流速1.0 mL/min，柱温保持在25 ℃；检测波长280 nm。定性与定量方法：以标品的保留时间和UV吸收光谱进行定性；以标品的标准曲线进行定量。
2 结果和分析 2.1 圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素生物合成
2.1.1 大肠杆菌发酵: CsF3′H属于细胞色素P450酶[15]，其N端有一段与细胞膜结合区域，这将影响其在E. coli中的表达，同样拟南芥细胞色素P450还原酶 (ATR) 也存在这样的膜结合区域，因此为使它们在E. coli中表达出活性，就需删去这一部分序列。根据TMHMM软件预测并参照文献[17]，构建4个CsF3'H::ATR基因融合表达质粒，如图 2所示。:
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| 图 2. CsF3’H与ATR基因融合表达质粒构建 Figure 2. Constructing plasmid of fusion gene CsF3'H::ATR. A: SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA; B: SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA; C: SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA; D: SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA. SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA indicates construction of gene ensembles encoding CsF3′H[7—517] and ATR1[49—688]. Numbers correspond to the amino acids encoded by the first and last codons of the gene sequences. The other plasmids can be deduced by analogy. |
| 图选项 |
将图 2所示的4个重组质粒，分别转入E. coli TOP10、E. coli DH5α和E. coli BL21菌株中。培养至菌液OD600达到0.6时，加入IPTG诱导。2 h后，分别喂食底物柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，设定25 ℃和30 ℃两组温度振荡发酵，24 h后液相检测其相应的产物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素生成情况。结果发现，转化E. coli BL21所有的菌株 (S1–S4) 都没有发现相应的产物生成；表达质粒SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA和SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA转化的所有菌株 (S1、S3、S5、S7、S9和S11) 也没检测到相应的产物；表达质粒SUMO-CsF3'H [28—517]::ATR1[49—688] 3 AA和SUMO-CsF3'H [28—517]::ATR2[75—711] 3 AA转化TOP10、DH5α菌株 (S6、S8、S10和S12) 产物生成情况如图 3所示。从图 3中可以看出，25 ℃培养与30 ℃相比，各菌株生成相应的产物量要高出10–20倍；与表达质粒SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711]转化的菌株 (S8和S12) 相比，SUMO-CsF3'H[28—517]:: ATR1[49—688] 3 AA转化的菌株 (S6、S10) 生成相应产物量要高出1倍左右；同DH5α转化的菌株 (S10、S12) 比较，TOP10转化的菌株 (S6、S8) 生成相应产物的量要略高些。3个底物相比，1000 μmol/L柚皮素最多能生成287.93 μmol/L圣草酚；1000 μmol/L二氢山奈酚最多能转化生成131.76 μmol/L二氢槲皮素；1 000 μmol/L山奈酚最多能转化生成188.62 μmol/L槲皮素，这一结果与前期酶学分析表明柚皮素是CsF3′H最适底物的结果[15]相吻合。:
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| 图 3. 转化CsF3'H与ATR基因融合表达质粒菌株生成产物量 Figure 3. Content of product from different bacterial strains transformed fusion geneCsF3'H::ATR plasmids. Products from the strains incubated at 30 ℃ with naringenin (A), dihydrokaempferol (C) and kaempferol (E) as substrates; products from the strains incubated at 25 ℃ with naringenin (B), dihydrokaempferol (D) and kaempferol (F) as substrates. Duncan's multiple range test (P < 0.05, n=3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. |
| 图选项 |
2.1.2 酵母菌株发酵: 酵母菌株S. cerevisiae WAT11整合有拟南芥P450还原酶基因[18]，是异源表达植物细胞色素P450酶的良好宿主[11-12, 19]。本试验以转化的酵母菌株pYES-Dest52-CsF3'H WAT11(S13) 作为发酵菌株，按1.4方法进行诱导。12 h后，分别添加柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚至终浓度1000 μmol/L，再分别于添加底物后的12、24、36、48、60 h取样分析，结果如图 4所示。从图中可以发现，随着发酵的进行，各产物的积累呈现先增加后降低的趋势，最高积累量在36–48 h。1000 μmol/L柚皮素最多能转化生成734.32 μmol/L圣草酚；1000 μmol/L二氢山奈酚最多能转化生成446.07 μmol/L二氢槲皮素；1000 μmol/L山奈酚最多能转化生成594.64 μmol/L槲皮素。显然，这要高于大肠杆菌的生物转化量 (图 3)。:
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| 图 4. 菌株S13生物发酵过程中产物变化 Figure 4. Products accumulation in strain S13 bioconversion. A: eriodictyol; B: dihydroquercetin; C: quercetin. Duncan's multiple range test (P < 0.05, n=3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. |
| 图选项 |
2.2 以柚皮素为底物生物合成槲皮素 在2.1中，分别以二氢山奈酚和山奈酚为底物生物合成了二氢槲皮素和槲皮素，但柚皮素是类黄酮生物途径中最先合成的化合物，是生物合成其他黄酮类化合物的底物[20]。因此，本试验分别将CsF3'H、CsF3H::AtFLS 9 AA连接到酵母共表达载体pES-URA和pES-HIS上，并同时转化WAT11菌株，培养诱导并喂食5 mmol/L底物柚皮素，以尝试由柚皮素为底物生物合成槲皮素，结果如图 5所示。从图中可以看出，生成的产物中不仅有二氢槲皮素和槲皮素，还有圣草酚、二氢山奈酚、山奈酚。这是因为CsF3H::AtFLS 9 AA可以直接以柚皮素为底物，转化生成二氢山奈酚和山奈酚；CsF3'H可以将柚皮素转化生成圣草酚，整个代谢流并没有持续向槲皮素合成方向流动。
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| 图 5. 共表达酵母菌株S14生成产物液相色谱图 Figure 5. HPLC chromatograms of products from strain S14 co-transformed pES-URA-CsF3'H and pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9 AA. A: standards; B: the strain WAT11 co-transformed with pES-URA-CsF3'H and pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9 AA; C: the strain WAT11 co-transformed with pES-URA and pES-HIS. DHM: dihydromyricetin; DHQ: dihydroquercetin; MYC: myricetin; DHK: dihydrokaempferol; PEN: pentahydroxyflavonone; ERI: eridictyol; QUE: quercetin; NAR: naringenin; KAE: kaempferol. |
| 图选项 |
由图 6可见，圣草酚积累量最多，在48 h达到1412.16 μmol/L；其次是山奈酚，在36 h达到490.25 μmol/L；再次是槲皮素，在48 h达到445.75 μmol/L。在48 h时，二氢槲皮素和二氢山奈酚累积量达到最高值，分别为66.75 μmol/L和73.50 μmol/L。
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| 图 6. 酵母共表达菌株S14生物发酵过程中各产物量变化 Figure 6. Products accumulation in coexpression strain S14 bioconversion. DHQ: dihydroquercetin; DHK: dihydrokaempferol; ERI: eriodictyol; QUE: quercetin; KAE: kaempferol. Duncan's multiple range test (P < 0.05, n=3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. |
| 图选项 |
3 讨论 大肠杆菌是用于微生物代谢工程的常用宿主，许多重要的植物源天然产物由大肠杆菌发酵生物合成[21-24]。产率低是采用大肠杆菌重组技术的缺陷，现已通过系统生物学的方式克服[25]。但在大肠杆菌中表达具有膜结合区域的细胞色素P450酶，仍然具有挑战性[17, 26]，这也使得无法采用重组大肠杆菌来合成一些生物活性物质。阻止植物P450酶在大肠杆菌中表达，主要有两个因素：一方面，大肠杆菌中缺乏满足真核细胞色素P450酶电子传递的P450还原酶[27]；另一方面，由于大肠杆菌缺失内质网膜，导致P450酶的跨膜信号区域与宿主不亲和[28-29]。
本试验中，将CsF3'H和拟南芥的P450还原酶 (ATR1和ATR2) 的跨膜区域敲除，再用接头将它们连接起来，进行融合表达。在4个基因融合表达质粒中，SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA和SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA转化的菌株 (S6、S8、S10和S12) 表达出活性，SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA和SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA转化的菌株 (S5、S7、S9和S11) 则没有表达出活性。这可能是由于在后二者的构建中，P450酶的跨膜区域未敲除完全之故。大肠杆菌菌株BL21是常用的表达重组蛋白的菌株，而TOP10和DH5α则是用于克隆的菌株。本试验结果显示，4个基因融合表达质粒在BL21菌株中都未表达出活性，而转化SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA或SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2 [75—711] 3 AA的TOP10和DH5α菌株 (S6、S8、S10和S12) 都检测出活性。在大肠杆菌中表达P450酶生物合成异黄酮的研究中[30]，也发现转化的TOP10、DH5α和JM109菌株活性远远高于转化的BL21菌株的现象。另外，发酵温度对菌株的活性影响较大 (图 3)，这是因为在较高的温度如30 ℃异源表达时，易产生包涵体从而导致酶的活性降低。
采用酵母菌株表达CsF3'H生物合成圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的效率，比大肠杆菌的效率要高 (图 3和图 4)，其转化圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的量分别是大肠杆菌的2.55倍、3.39倍和3.15倍。不过，酵母的生物发酵相对大肠杆菌来说，其发酵周期长，且需要更换液体培养基。
4 结论 为生物合成圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素，分别以大肠杆菌和酵母作为发酵菌株进行生物合成。在大肠杆菌生物合成中，构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因 (CsF3′H) 和拟南芥的P450还原酶基因 (ATR) 融合表达质粒：SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR1[49—688] 3 AA、SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA、SUMO-CsF3'H[7—517]::ATR2[75—711] 3 AA和SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR2[75—711] 3 AA，分别转入大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21中表达。转化SUMO-CsF3'H[28—517]::ATR1[49—688] 3 AA载体的TOP10菌株在25 ℃下发酵，转化效率最高，能将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，分别转化生成287.93 μmol/L圣草酚、131.76 μmol/L二氢槲皮素和188.62 μmol/L槲皮素。以酵母菌株pYES-Dest52-CsF3′H WAT11作为发酵菌株，分别将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚，最多能转化生成734.32 μmol/L圣草酚、446.07 μmol/L二氢槲皮素和594.64 μmol/L槲皮素。
以5 mmol/L柚皮素为底物，喂食pES-URA-CsF3′H和pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9AA共表达酵母菌株WAT11，生物合成槲皮素，在发酵36–48 h中，最多能生成1412.16 μmol/L圣草酚、490.25 μmol/L山奈酚、445.75 μmol/L槲皮素、66.75 μmol/L二氢槲皮素和73.50 μmol/L二氢山奈酚。
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