缪静#, 迟晓艳#, 王艳华#, 冯志彬, 薛文文, 黄润, 张颢译, 田铃仟, 张洪倩, 翟俊杰, 葛宜和
鲁东大学生命科学学院, 山东 烟台 264025
收稿日期：2016-06-15；修回日期：2016-08-24；网络出版日期：2016-09-18
基金项目：山东省自然科学基金（ZR2011CL003）；山东省高等学校科技计划项目（J14LK53）
*通信作者：葛宜和,Tel:+86-535-6681053;Fax:+86-535-6686958;E-mail:geyihe@ldu.edu.cn
摘要： [目的]为了进一步鉴定铜绿假单胞菌转录调控因子σ38对2个拷贝吩嗪合成基因簇（phzA1-G1和phzA2-G2）的具体调控方式并推定介导绿脓菌素合成代谢的可能调控机制。[方法]根据铜绿假单胞菌基因组信息，利用同源重组原理构建rpoS基因缺失突变株ΔrpoS以及克隆全长rpoS基因作互补分析；再以单一吩嗪基因簇缺失突变株Δphz1和Δphz2为出发菌株，分别构建rpoS缺失突变株ΔrpoSphz1和rpoS插入突变株ΔrpoSphz2，测定并比较野生株及相关突变株的绿脓菌素合成量，初步推定σ38因子对2个不同吩嗪基因簇表达的调控方式。[结果]在GA培养基中，突变株ΔrpoS的绿脓菌素合成量比野生株显著增加；互补分析证实，σ38可使突变株ΔrpoS的绿脓菌素降低并接近野生株PAO1水平；与对照株Δphz1相比，突变株ΔrpoSphz1的绿脓菌素合成量因σ38因子缺失而显著减少；而与对照株Δphz2相比，突变株ΔrpoSphz2的绿脓菌素合成量因σ38因子缺失显著增加。[结论]转录调控因子σ38对铜绿假单胞菌绿脓菌素的合成代谢的确具一定的负调控作用；结合已报道的研究结果，初步推定：σ38因子通过负调控吩嗪基因簇phz1，正调控吩嗪基因簇phz2的表达实现对绿脓菌素合成代谢的调控。
关键词： 铜绿假单胞菌 σ38因子 phz1 phz2 绿脓菌素 基因调控
Regulation of pyocyanin biosynthesis by transcriptional factor sigma38 in Pseudomonas aeruginosa PAO1
Miao Jing, Chi Xiaoyan, Wang Yanhua, Feng Zhibin, Xue Wenwen, Huang Run, Zhang Haoyi, Tian Lingqian, Zhang Hongqian, Zhai Junjie, Ge Yihe
School of Biological Sciences, Ludong University, Yantai 264025, Shandong Province, China
Received 15 June 2016; Revised 24 August 2016; Published online 18 September 2016
*Corresponding author: Corresponding author. Tel: +86-535-6681053; Fax: +86-535-6686958; E-mail:geyihe@ldu.edu.cn
Supported by the Natural Science Fundation in Shandong Province (ZR2011CL003) and by the Project of Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program (J14LK53)
Abstract: Pyocyanin, an important virulence factor, is synthesized and secreted by Pseudomonas aeruginosa PAO1and plays a critical role in pathogen-host interaction during infection. Sigma38 (σ38, σS) is a central regulator for many virulence production in pathogens.[Objective] Our aim is to identify expression and regulation of two phenazine-producing operons mediated by the sigma38 factor in Pseudomonas aeruginosa PAO1.[Methods] We first cloned the flanking fragments of rpoS from the chromosomal DNA of P. aeruginosa PAO1 and constructed the deletion mutant ΔrpoS with the insertion of gentamycin resistance cassette (aacC1). Complementation of rpoS was then carried out after construction and introduction of pME10S (containing the whole rpoS region). Finally, we created the mutant ΔrpoSphz1 and ΔrpoSphz2, and measured pyocyanin production by these mutants in GA medium, using the parental strain Δphz1 and Δphz2 as controls.[Results] In GA medium, pyocyanin production by mutant ΔrpoS increased dramatically in comparison with the wild-type strain PAO1. Production of pyocyanin, however, was decreased to the level of the wild-type strain with complementation of the derivative ΔrpoS harboring pME10S. Mutant ΔrpoSphz2 produced much more pyocyanin than mutant Δphz2. Mutant ΔrpoSphz1, however, produced much less pyocyanin than mutant Δphz1.[Conclusion] By positively regulating the expression of phz2 and negatively regulating the phz1, sigma38 factor exerts negative modulation on pyocyanin biosynthesis in P. aeruginosa PAO1.
Key words: Pseudomonas aeruginosa sigma38 phz1 phz2 pyocyanin regulation
作为院内感染的常见病原菌之一，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)极易引起免疫功能低下、烧伤或某些植入性手术(气管插管、导尿管)等患者感染[1]。研究证实，铜绿假单胞菌除了合成并分泌外毒素A外，还分泌包括绿脓菌素(Pyocyanin，PYO)、弹性蛋白酶等其它多种毒力因子[2]。研究发现，从患者体内分离的铜绿假单胞菌中至少90%可以合成并分泌绿脓菌素，且在囊胞性纤维症患者(Cystic fibrosis，CF)的痰液中具有较高的浓度，这些结果充分表明绿脓菌素在感染患者的过程中具有很强的致病作用[3]。
根据基因组序列分析可知，铜绿假单胞菌PAO1拥有2个独立吩嗪合成基因簇phz1和phz2[4]，虽然它们相距甚远(约2.6 Mb)，且它们上游启动子区域相差迥异，但是2个基因簇都包含紧密排列的phzABCDEFG共7个基因，它们同源性高达98.3%。研究证实，2个基因簇都可以各自独立地表达一系列相同的酶并用于合成绿脓菌素的前体：吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)。吩嗪-1-羧酸再经PhzM和PhzS两个酶催化最终可转变为绿脓菌素[4]。
调节因子 σ38 (sigma38)是由rpoS基因在细菌进入稳定期时编码产生的与RNA聚合酶相结合的一种调控因子，又称作sS或RpoS。当结合了σ38转录因子的RNA聚合酶可以启动相关基因的表达。研究显示，在多种环境胁迫因子作用下，细菌通过表达σ38因子并启动约30多个相关基因的表达从而使细菌适应复杂而多变的环境[5]。在Escherichia coli、Salmonella typhimurium和Shigella flexneri等病原菌中，σ38因子可激活与细菌毒力相关的基因表达[6]。
Suh等通过构建铜绿假单胞菌PAO1的rpoS基因插入突变株，证实铜绿假单胞菌的σ38因子缺
失后可显著提高绿脓菌素的合成量[7]。然而，绿脓菌素的合成来自于2个吩嗪基因簇phz1和phz2合成的前体吩嗪-1-羧酸，σ38因子是否通过介导2个不同基因簇的表达来实现调控绿脓菌素的合成，至今未见详细报道。基于此点，我们分别以野生株PAO1、吩嗪基因簇phz1缺失突变株Δphz1和吩嗪基因簇phz2缺失突变株Δphz2为出发菌株，根据同源重组的原理，采用双亲杂交方法构建并鉴定一系列σ38因子缺失突变株ΔrpoS、ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2。针对它们绿脓菌素合成量的变化加以比较与分析，初步推定并解析σ38因子对2个吩嗪合成基因簇可能的调控方式或机制。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒： 本研究所使用的菌株、质粒及其来源等信息见表 1。 表 1. 菌株和质粒 Table 1. Strains and plasmids
| Strain and plasmid | Characteristics and description | Source or reference |
| Strains | ||
| E. coli | ||
| DH5α | Φ80 lacZΔM15Δ(lacZYA-argF) U169 hsdR17 recA1endA1 thi-1 | [8] |
| SM10 | F- thi-1 thr-1 leuB6 recA tonA21 lacY1 supE44(MuC+) λ- Kmr | [10] |
| P. aeruginosa | ||
| PAO1 | Wild type,phz1 and phz2 clusters,Spr | Stephen Lory |
| Δphz1 | phz1 locus deleted and inserted with aacC1,SprGmr | [11] |
| Δphz2 | phz2 locus deleted and inserted with aph,SprKmr | [11] |
| Δphz1phz2 | phz1 and phz2 loci deleted and inserted with aacC1 and aph,respectively,GmrKmr | [11] |
| ΔrpoS | rpoS deleted and inserted with aacC1 in the PAO1 strain,SprGmr | This study |
| ΔrpoSphz1 | rpoS deleted in the mutant Δphz1,SprGmr | This study |
| ΔrpoSphz2 | rpoS deleted and inserted with aacC1 in the mutant Δphz2,SprGmrKmr | This study |
| Plasmids | ||
| pUCm-T | T-vector,Apr | Sangon (Shanghai) |
| pEX18Tc | Suicide plasmid ,Tcr | [10] |
| pEXS | A 2.0-kb rpoS-flanking PCR fragment cloned in pEX18Tc，Tcr | This study |
| pUCGm | Resource of gentamycin resistance cassette (aacC1),AprGmr | [12] |
| pEXSG | A 0.8-kb aacC1 cassette cloned into pEXS,Tcr Gmr | This study |
| pME6010 | Low copy vector in Pseudomonas sp.,Tcr | [13] |
| pME10S | A 1761-bp fragment containing the whole rpoS gene cloned into pME6010,Tcr | This study |
表选项
1.1.2 培养基和培养条件： 大肠杆菌(E. coli)通常在37 °C条件下培养于Luria-Bertani (LB)培养基中；铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)通常在37 °C条件下培养于LB或甘油-丙氨酸补充培养基(GA)培养基中[8-9]。根据不同培养条件和目的，E. coli培养基中抗生素的添加量分别为(μg/mL)：氨苄青霉素(Ap) 100、盐酸四环素(Tc) 25、硫酸庆大霉素(Gm) 20、硫酸卡那霉素(Km) 50；铜绿假单胞菌培养基中需要添加的抗生素用量(μg/mL)为：盐酸壮观霉素(Sp) 100、Tc 125、Gm 40和Km 300。细菌振荡培养时，大肠杆菌和铜绿假单胞菌均在37 °C、180 r/min条件下振荡培养。
1.1.3 主要酶与试剂： 本研究中DNA重组所使用的多种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准物(DNA marker)皆为Fermentas (MBI)公司产品并购于生工生物工程上海股份有限公司；rTaq DNA聚合酶、dNTPs购于TaKaRa宝生物(大连)工程有限公司；Phusion High-Fidelity DNA polymerase购自Thermo Fisher Scientific 公司(Waltham，MA，USA)。在实验过程中，PCR扩增所使用的引物名称、序列及人工添加的酶切位点等信息参见表 2，并委托生工生物工程上海股份有限公司合成。细菌基因组DNA提取、PCR产物纯化与回收、DNA胶回收等试剂盒均来自生工生物工程上海股份有限公司；D/L-丙氨酸、5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)及多种抗生素也购自生工生物工程上海有限公司。绿脓菌素的标准品购自Cayman Chemical公司(Ann Arbor，MI，USA)。此外，三氯甲烷、丙氨酸和甘油等其它生化试剂级别均为分析纯(或色谱纯)。 表 2. 引物 Table 2. The primers employed in this study
| Primers | Sequences (5′-3′) and artificial restriction enzyme sites (underlined and in italics) |
| S-1F | GTGCACCTGAACGCGACCGAGC |
| S-1R | CTATTATCTAGAAGAATGGCCTGTCGAGTGACG (Xba I) |
| S-2F | GAATTATCTAGAGTGCCATGTCGTTATCCCTTGC (Xba I) |
| S-2R | CTCAACGGCCCGATCGCCTGAG |
| S-3F | GAATTAGAGCTCAAGCGCCTGGAAACCACCAGC (Sac I) |
| S-3R | CTAATACTGCAGATGGATAAGGGGGAAGGATTGAG (Pst I) |
| g-1F | GCAGCAACGATGTTACGCAG |
| g-1R | TGTTAGGTGGCGGTACTTGG |
| g-LF | GTCACAACGCCGCGGCCAATTC |
| g-LR | CAGGCTTATGTCAATTCGAGCTC |
| S-CF | CGATTCCCAGTGCTCCCGCAACCTG |
| S-CR | GACCAAGCCTACCCCGGTTCCACCC |
表选项
1.2 rpoS相邻片段的克隆与载体构建 为构建rpoS基因缺失突变株，依据铜绿假单胞菌PAO1基因组序列信息在该基因的上、下游分别设计3对引物S-1F/S-1R、S-2F/S-2R和S-3F/S-3R以铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA为模板分别采用S-1F/S-1R和S-2F/S-2R两对引物进行PCR，分别获得rpoS基因的上、下游2个片段rpoS-Up和rpoS-Down。PCR采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，反应程序及条件参数为：预变性，98 °C 20 s，1个循环；变性：98 °C 6 s，退火：64 °C 20 s，延伸反应：72 °C 30 s，33-35个循环；72 °C再延伸7 min，1个循环。为了直接克隆PCR产物，在后延伸阶段中补加一定量的rTaq DNA聚合酶，使PCR产物的3′-末端添加A。然后经0.8%-1.0%琼脂糖电泳检测、纯化与回收，克隆于T-载体(pUCm-T)后，交由生工生物工程上海股份有限公司进行测序。
铜绿假单胞菌基因组DNA提取、大肠杆菌的质粒小量抽提、限制性内切酶消化、酶切DNA片段胶回收与纯化、连接反应、感受态细胞制备和转化等步骤均参照文献或相关试剂盒推荐的方法进行[8]。rpoS-Up和rpoS-Down两PCR片段预期大小分别为1196和1072 bp，PCR结果经测序鉴定后，将上、下游PCR片段混合，经纯化、XbaⅠ酶切、纯化、连接、再纯化等步骤处理后产物作PCR模板，并以S-3F/S-3R作引物，利用Phusion Taq酶进行PCR扩增。将扩增获得的长度约2.0 kb的PCR产物经纯化后，再经Sac I-Pst I双酶切，克隆于质粒pEX18Tc相应位点中[10]，所获得质粒命名为pEXS。然后，用Xba I酶切克隆载体pUCGm，获得约878 bp的抗庆大霉素基因片段(aacC1)[12]。该片段经胶回收后，克隆于pEXS载体上的rpoS基因相邻片段的中间Xba I位点中，所得质粒命名为pEXSG。
1.3 rpoS基因插入突变株ΔrpoS的构建 用化学转化法(CaCl2法)将pEXS、pEXSG分别转化E. coli SM10 λpir，方法见文献[8]。
以E. coli SM10/pEXSG为供体菌，铜绿假单胞菌PAO1野生株为受体菌进行双亲杂交。杂交后，混合菌涂布于Tc125/Gm40的双抗LB平板，挑取该平板上的单克隆于含Gm40的LB液体培养基中作传代培养，每隔12 h传代1次，传代3 d后作梯度稀释并涂布于含10%蔗糖/Gm40的LB平板上，将所得单菌落同时分别接种于单抗Tc125和单抗Gm40 (对照)的LB平板上。筛选Tc平板敏感而Gm平板生长的相应克隆，即铜绿假单胞菌PAO1的rpoS基因缺失突变株ΔrpoS。
1.4 突变株ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2的构建 为了明确σ38因子是否对单个吩嗪基因簇的功能具有调控作用，我们分别利用实验室已构建的吩嗪基因簇缺失突变株Δphz1和Δphz2为受体菌构建突变株ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2[11]。其中以E. coli SM10/pEXS为供体菌和突变株Δphz1为受体菌进行双亲杂交，获得缺失突变株ΔrpoSphz1 (rpoS无抗性标记缺失突变)。步骤与筛选突变株Δphz1稍有区别，具体如下：双亲杂交后涂布Sp100/Tc125获得单交换菌株，传代LB培养基只添加Sp100 (不添加Tc125)，传代后稀释涂布于含10%蔗糖/Sp100的LB平板进一步筛选突变株(双交换)，由于没有抗性标记基因的插入，筛选平板上获得的Tc敏感的克隆也有可能是回复突变株，因此通过PCR剔除回复突变株是必要的步骤。而以E. coli SM10/pEXSG为供体菌和突变株Δphz2为受体菌进行双亲杂交，获得突变株ΔrpoSphz2 (rpoS抗庆大霉素标记缺失突变)，其步骤与筛选突变株ΔrpoS完全相同。
1.5 rpoS基因互补表达载体的构建和转化 为了构建rpoS基因的互补表达载体，以PAO1基因组DNA为模板，利用引物S-CF/S-CR进行PCR获得约1840 bp包含rpoS基因自身启动子的片段。PCR片段通过Hind Ⅲ-Acc65Ⅰ双酶切，经纯化获得的约1761 bp片段克隆于低拷贝穿梭质粒pME6010相应位点中[13]，所获质粒命名为pME10S。经测序验证后，分别将pME6010和pME10S通过化学转化法转化野生株PAO1和突变株ΔrpoS后，进行互补分析。
1.6 发酵培养和生长曲线的测定 将野生株PAO1和突变株ΔrpoS等分别同时培养于盛有150 mL的GA培养基中(接种比例按1∶100)，每个样品设3个重复。每隔12 h取样，测定OD600。
1.7 绿脓菌素的测定 绿脓菌素的定量测定方法参照文献[14]进行。其基本步骤如下：取不同发酵时间点的细菌发酵液4 mL，加入2.4 mL三氯甲烷振荡抽提2 min，10000×g条件下，离心5 min。吸取下层有机相 2 mL并向其中加入4 mL的0.2 mol/L的盐酸，振荡混匀3-5 min，10000×g条件下，离心5 min。取上层水相(桃红色)作不同程度的稀释后，在 520 nm条件下采用分光光度计测定其光密度值(OD520)，并依据标准曲线和消光系数(17.072)计算其浓度。
1.8 数据分析 同一实验一般重复3次，每个实验组和对照组一般设3个重复，每隔12 h取样分析。根据统计学原理，测定的结果除了进行算术平均数的计算，我们还进行了离差和标准差等分析。同时针对每个时间节点实验组和对照组的3个重复进行双尾t检验。若P<0.05，则认为差异显著，若P<0.01，则认为实验组与对照组差异极其显著。
2 结果和分析 2.1 σ38因子缺失突变株的构建和鉴定 为了验证σ38因子缺失是否影响绿脓菌素的合成代谢，我们首先以铜绿假单胞菌PAO1为受体菌(图 1-A)，构建rpoS基因的带庆大霉素抗性标记的缺失突变株(图 1-B)。在构建过程中，首先利用蔗糖(反选)和抗生素抗性(正选)双重筛选初步获得突变株(ΔrpoS)。为了进一步鉴定是否真正获得了rpoS基因缺失突变株(双交换突变株)，我们分别提取野生株PAO1、突变株ΔrpoS和阳性对照株Δphz1的基因组DNA为模板，采用来自TaKaRa公司的rTaq DNA聚合酶或LA Taq DNA聚合酶进行PCR鉴定(图 1-C)。若采用g-1F/g-1R、S-1F/g-LR和g-LF/S-2R 3对引物分别进行PCR扩增，以突变株ΔrpoS基因组DNA为模板扩增的条带预期大小分别为546 bp、1.2 kb和1.2 kb。据图 1-C所示，实际PCR扩增的条带大小皆与预期相符，表明不仅抗庆大霉素基因盒(aacC1)插入到突变株的基因组中，而且该基因盒的确定点插入到了rpoS缺失的位点中，证实我们确已获得σ38因子缺失突变株ΔrpoS。
 |
| 图 1. rpoS基因缺失突变株的构建与鉴定 Figure 1. Generation and identification of rpoS deletion mutant. |
| 图选项 |
突变株ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2中的rpoS基因敲除同样由PCR鉴定(结果未显示)。
2.2 σ38因子缺失对绿脓菌素合成代谢的影响 为了确定σ38因子缺失是否对细菌生长产生一定的影响，我们比较了突变株ΔrpoS与野生株PAO1的生长状况。将它们分别接种于GA或LB液体培养基中，振荡培养，每12 h取样分析，600 nm波长下测定菌体的吸光度(OD600)并绘制生长曲线。据图 2所示，突变株ΔrpoS与野生株PAO1在LB培养基中生长无显著差别，在相同的培养时间、温度等条件下，突变株的菌体总量几乎与野生株无异。但在GA培养基中，σ38因子敲除对铜绿假单胞菌的生长尤其在后期，菌体的密度稍有降低，该结果表明，在碳源和氮源较为单一的培养基中，σ38因子缺失后，细菌的生长对营养因子的变化较为敏感，该结果也与以往研究结果相一致[7]。
 |
| 图 2. 铜绿假单胞菌PAO1和突变株ΔrpoS在不同培养基中的生长曲线 Figure 2. Growth curves of the wild-type strain PAO1 and the mutant ΔrpoS in LB and GA medium. All experiments were carried out in triplicate,and each value is presented as the average±standard deviation. |
| 图选项 |
为了进一步验证σ38因子对吩嗪类的合成代谢是否具有调控作用以及调控方式，将已构建的缺失突变株ΔrpoS和野生株PAO1分别同时接种于GA培养基中进行发酵培养，并以吩嗪基因簇双缺失突变株Δphz1phz2为阴性对照。定时取样并分析绿脓菌素合成量，并根据结果绘制产物合成 曲线。
据图 3所示，与野生株PAO1相比，在发酵24 h后突变株ΔrpoS合成的绿脓菌素明显增加，其合成量比野生株PAO1的绿脓菌素多近1倍(P<0.01)。此结果表明，σ38因子的缺失在一定程度上促进了绿脓菌素的合成。
 |
| 图 3. 铜绿假单胞菌野生株PAO1、突变株ΔrpoS及相关互补株在GA培养基中绿脓菌素合成量 Figure 3. Pyocyanin production of the wild-type strain PAO1 (black),the rpoS-deleted mutant ΔrpoS (dark grey),the mutant ΔrpoS bearing pME6010 (grey),and the mutant ΔrpoS harboring pME60S (light grey) in GA medium. |
| 图选项 |
2.3 rpoS基因的互补分析 为了进一步证实突变株ΔrpoS绿脓菌素的合成量的变化确由σ38因子缺失引起，我们构建了rpoS基因的互补表达载体pME10S，并同时用pME6010做阴性对照转化突变株ΔrpoS。转化子经质粒抽提验证后，接种GA发酵培养基进行发酵培养，并定时测定绿脓菌素的合成量。发酵培养结果如图 3所示，当突变株ΔrpoS重新引入rpoS基因以后，其绿脓菌素的合成量显著降低，并与野生株绿脓菌素的合成量相差无几(P>0.05)。当pME6010引入突变株，并未带来突变株绿脓菌素合成代谢上的显著变化(P>0.05)。据此互补分析的结果可以确定，在铜绿假单胞菌中σ38因子的确对绿脓菌素合成具有抑制作用(负调控)。
2.4 σ38因子缺失对phz2介导的绿脓菌素合成的影响 鉴于铜绿假单胞菌具有2个拷贝的吩嗪合成基因簇，且它们都参与了吩嗪及其衍生物的合成，为了进一步推定rpoS是否对phz1和phz2两个基因簇的表达有一定的调控作用，以已构建的吩嗪基因簇缺失突变株Δphz1和Δphz2为出发菌(受体菌)，再次构建σ38因子缺失突变，产生新的突变株ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2。
为了推定σ38因子缺失是否影响了吩嗪基因簇phz2介导的绿脓菌素的合成，我们将突变株ΔrpoSphz1接种于GA培养基进行发酵培养，同时以突变株Δphz1、Δphz1phz2为对照株。定时取样，测定绿脓菌素的合成量。
据图 4-A所示，与对照株Δphz1相比，突变株ΔrpoSphz1绿脓菌素的合成量显著减少(P<0.01)。由于突变株Δphz1中绿脓菌素的合成仅由吩嗪基因簇phz2单独介导并参与，因此我们推定σ38因子缺失可能通过抑制了phz2的表达来实现降低绿脓菌素的合成。
 |
| 图 4. 基因敲除对铜绿假单胞菌不同吩嗪基因簇表达的影响 Figure 4. Pyocyanin (PYO) production in the mutant Δphz1 and ΔrpoSphz1 |
| 图选项 |
2.5 σ38因子缺失对phz1介导的绿脓菌素合成的影响 假设σ38因子缺失致使吩嗪基因簇phz2表达受抑制这一推定成立，绿脓菌素合成量减少；但事实是σ38因子缺失却引起了突变株ΔrpoS绿脓菌素合成量的明显增加，因此我们推测，只有σ38因子缺失促进了由吩嗪基因簇phz1介导并参与的绿脓菌素的合成，才能实现突变株ΔrpoS中绿脓菌素合成增加的这一事实。为了证实这一推定，我们将突变株ΔrpoSphz2接种于GA培养基进行发酵培养，同时以Δphz2和Δphz1phz2为对照。定时取样，测定毒力因子绿脓菌素的合成量。
据图 4-B所示，在发酵12 h之前，实验株ΔrpoSphz2与对照株Δphz2、Δphz1phz2相比，绿脓菌素的合成量差异不显著。但发酵进入中、后期以后，实验株ΔrpoSphz2的绿脓菌素比对照株Δphz2显著增加(P<0.01)。互补实验分析显示，当pME10S转化实验株ΔrpoSphz2后，其绿脓菌素的合成显著降低，且与对照株Δphz2水平相当，该结果进一步确认了σ38因子敲除的确促进了实验株ΔrpoSphz2的绿脓菌素合成(结果未显示)。由于Δphz2中吩嗪基因簇phz2的敲除，只有吩嗪基因簇phz1介导并参与绿脓菌素的合成，实验株ΔrpoSphz2中绿脓菌素合成量增加表明σ38因子很可能负调控了phz1的表达，这一结果与我们的推断相符。
此前，本课题组周金凤等通过构建phz1′-′lacZ和phz2′-′lacZ翻译融合表达载体的系列实验已证实，rpoS基因插入突变引起了吩嗪基因簇phz1表达的增强，phz2的表达降低[15]。鉴于吩嗪基因簇表达是铜绿假单胞菌合成绿脓菌素等吩嗪类毒力因子的关键性第一步，结合这一已有研究结果，我们初步推定：转录调节因子σ38对铜绿假单胞菌毒力因子绿脓菌素的生物合成具有负调控作用；同时，对绿脓菌素合成代谢的调控可能通过负调控吩嗪基因簇phz1、正调控吩嗪基因簇phz2的表达来实现。
3 讨论 作为最常见的病原细菌之一，铜绿假单胞菌分泌3类主要毒力因子：外毒素A、绿脓菌素和弹性蛋白酶[7]。此前已有研究报道，σ38因子(sS或RpoS)的缺失突变可以促进绿脓菌素的合成，但绿脓菌素合成量增加的这一事实与2个吩嗪合成基因簇的表达水平是否直接相关却未见详细报道。为了解决该问题，本研究首先采用抗庆大霉素基因插入失活的策略构建了σ38因子缺失突变株ΔrpoS。通过发酵培养证实，缺失突变株ΔrpoS的绿脓菌素合成量与野生株相比明显增加，表明σ38因子可以负调控绿脓菌素的合成，且这一结果与已有的报道相符。为了进一步确认σ38因子针对2个吩嗪合成基因簇的具体调控方式是否与绿脓菌素合成调控直接相关，我们相继又构建了突变株ΔrpoSphz1和ΔrpoSphz2。发酵结果显示，当σ38因子缺失时，由吩嗪基因簇phz1介导合成的绿脓菌素显著增加；而当rpoS基因敲除时，由吩嗪基因簇phz2介导合成的绿脓菌素显著降低。结合已报道的研究结果，我们初步推定：绿脓菌素合成代谢的调控可能通过σ38因子负调控吩嗪基因簇phz1、正调控吩嗪基因簇phz2的表达来实现。鉴于绿脓菌素必定不是吩嗪基因簇phz的直接表达产物，而是吩嗪-1-羧酸通过PhzM和PhzS 2个酶作用并转化而来，因此，σ38因子的缺失是否影响了phzM和phzS基因的表达仍需另外实验证实。
目前已有研究证实，铜绿假单胞菌PAO1 2个吩嗪基因簇尽管结构基因部分同源性高，但是它们的上游调控区段的序列截然不同：在phz1操纵子的启动子区域存在1个类似las-box的组成元件，该元件为群体感应(Quorum sensing)系统的顺式调控元件[16-17]；在phz2操纵子的上游却存在另一个调控基因qscR[5, 6]。这些结构上的差异无疑为差别性调控2个吩嗪基因簇的表达奠定了物质基础，为细菌在不同的环境因子或其它条件下诱导毒力因子的合成提供了差别基础。这显然对于维持病原细菌的毒力或感染能力是有利的。
现如今已鉴定的参与毒力因子代谢调控的系统至少包括lasR-lasI、rhlR-rhlI介导的群体感应系统和qscR等调控系统，这些都显示了铜绿假单胞菌毒力因子合成代谢的复杂性。而σ38因子(RpoS)研究最多的是其作为许多调控通路的下游元件去调控一系列相关基因的表达[5]。可诱导或调控σ38因子表达的包括Vfr、PsrA、the las system、the rhl system、GacA/RsmA、RelA、PPGPP等系 统[5-6]。但对σ38因子如何介导特定基因的表达，知之甚少。在针对铜绿假单胞菌2个吩嗪基因簇的调控方式的研究中，我们已报道了Pip(TetR family)对吩嗪基因簇phz1无明显的调控作用，却正调控吩嗪基因簇phz2的表达[19]。同时我们也发现RsmA也以σ38因子相似的方式介导2个吩嗪基因簇的表达(结果未发表)。因此，作为一种转录调控因子，σ38因子如何具体差别性调控吩嗪基因簇phz1和phz2的表达，以及它与Pip和RsmA等调控因子在绿脓菌素合成代谢的调控通路上有什么关系等，目前仍是个谜。显然，针对这些问题有待进一步深入研究。
致谢: 感谢鲁东大学生命科学学院统计学教研室的柏新富教授对实验设计与数据分析的指导。感谢鲁东大学生命科学学院2014级生物工程专业的杨停停和2014级生物科学专业的王笑同学参与绿脓菌素的发酵测定实验。
参考文献
| [1] | Kung VL, Khare S, Stehlik C, Bacon EM, Hughes AJ, Hauser AR. An rhs gene of Pseudomonas aeruginosa encodes a virulence protein that activates the inflammasome.Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unite States of America, 2012, 109(4): 1275–1280DOI:10.1073/pnas.1109285109. |
| [2] | Heurlier K, Williams F, Heeb S, Dormond C, Pessi G, Singer D, Cámara M, Williams P, Haas D. Positive control of swarming, rhamnolipid synthesis, and lipase production by the posttranscriptional RsmA/RsmZ system in Pseudomonas aeruginosa PAO1.Journal of Bacteriology, 2004, 186(10): 2936–2945DOI:10.1128/JB.186.10.2936-2945.2004. |
| [3] | Hunter RC, Klepac-Ceraj V, Lorenzi MM, Grotzinger H, Martin TR, Newman DK. Phenazine content in the cystic fibrosis respiratory tract negatively correlates with lung function and microbial complexity.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2012, 47(6): 738–745DOI:10.1165/rcmb.2012-0088OC. |
| [4] | Mavrodi DV, Bonsall RF, Delaney SM, Soule MJ, Phillips G, Thomashow LS. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAO1.Journal of Bacteriology, 2001, 183(21): 6454–6465DOI:10.1128/JB.183.21.6454-6465.2001. |
| [5] | Potvin E, Sanschagrin F, Levesque RC. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.FEMS Microbiology Review, 2008, 32(1): 38–55DOI:10.1111/j.1574-6976.2007.00092.x. |
| [6] | Dong T, Schellhorn HE. Role of RpoS in virulence of pathogens.Infection and Immunity, 2010, 78(3): 887–897DOI:10.1128/IAI.00882-09. |
| [7] | Suh SJ, Silo-Suh L, Woods DE, Hassett DJ, West SE, Ohman DE. Effect of rpoS mutation on the stress response and expression of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa.Journal of Bacteriology, 1999, 181(13): 3890–3897. |
| [8] | Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. |
| [9] | Chieda Y, Iiyama K, Yasunaga-Aoki C, Lee JM, Kusakabe T, Shimizu S. Pathogenicity of gacA mutant of Pseudomonas aeruginosa PA01 in the silkworm, Bombyx mori.FEMS Microbiology Letters, 2005, 244(1): 181–186DOI:10.1016/j.femsle.2005.01.032. |
| [10] | Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, Kutchma AJ, Schweizer HP. A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Gene, 1998, 212(1): 77–86DOI:10.1016/S0378-1119(98)00130-9. |
| [11] | Cui QN, Lv HN, Qi ZZ, Jiang B, Xiao B, Liu LD, Ge YH, Hu XM. Cross-regulation between the phz1 and phz2 operons maintain a balanced level of phenazine biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa PAO1.PLoS One, 2016, 11(1). |
| [12] | Schweizer HD. Small broad-host-range gentamycin resistance gene cassettes for site-specific insertion and deletion mutagenesis.BioTechniques, 1993, 15(5): 831–834. |
| [13] | Heeb S, Itoh Y, Nishijyo T, Schnider U, Keel C, Wade J, Walsh U, O'Gara F, Haas D. Small, stable shuttle vectors based on the minimal pVS1 replicon for use in gram-negative, plant-associated bacteria.Molecular Plant-Microbe Interaction, 2000, 13(2): 232–237DOI:10.1094/MPMI.2000.13.2.232. |
| [14] | Liang HH, Li LL, Dong ZL, Surette MG, Duan KM. The YebC family protein PA0964 negatively regulates the Pseudomonas aeruginosa quinolone signal system and pyocyanin production.Journal of Bacteriology, 2008, 190(18): 6217–6227DOI:10.1128/JB.00428-08. |
| [15] | Zhou JF, Ge YH, Liu T, Cheng XH, Wang L, Gao XX. Effect of rpoS mutation on two gene clusters of phenazine in Psedomonas aeruginosa PAO1.Acta Microbiolgica Sinica, 2010, 50(3): 411–417(in Chinese).周金凤, 葛宜和, 刘婷, 程显好, 王磊, 高兴喜. rpoS基因插入突变对铜绿假单胞菌两个吩嗪合成基因簇的调控.微生物学报, 2010, 50(3): 411–417. |
| [16] | Jimenez PN, Koch G, Thompson JA, Xavier KB, Cool RH, Quax WJ. The multiple signaling systems regulating virulence in Pseudomonas aeruginosa.Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2012, 76(1): 46–65DOI:10.1128/MMBR.05007-11. |
| [17] | Lee JH, Lequette Y, Greenberg EP. Activity of purified QscR, a Pseudomonas aeruginosa orphan quorum-sensing transcription factor.Molecular Microbiology, 2006, 59(2): 602–609DOI:10.1111/j.1365-2958.2005.04960.x. |
| [18] | Zhang Y, Cui QN, Zhao Z, Ming YF, Chi XY, Feng ZB, Cheng SW, Xie WH, Ge YH. Positive regulation in expression of the phenazine-producing operon phz2 mediated by Pip in Pseudomonas aeruginosa PAO1.Acta Microbiologica Sinica, 2013, 53(2): 127–135(in Chinese).张圆, 崔钦娜, 赵哲, 明永飞, 迟晓艳, 冯志彬, 程仕伟, 解卫海, 葛宜和. Pip介导铜绿假单胞菌吩嗪基因簇phz2的表达.微生物学报, 2013, 53(2): 127–135. |
