谢凤行, 张峰峰, 周可, 赵玉洁
, 赵琼, 孙海波 天津市农业生物技术研究中心, 天津 300384
收稿日期：2016-08-21；修回日期：2016-10-13；网络出版日期：2016-10-27
基金项目：天津市科技支撑重点项目（16YFZCNC00670）；天津市自然科学基金项目（16JCQNJC15100）；天津市农业科学院院长基金项目（16015）
*通信作者：赵玉洁,Tel:+86-22-27950956;Fax:+86-22-27950828;E-mail:yujiezh@126.com
摘要： [目的]从水产养殖环境和养殖生物体中选育具有水质净化功能的乳酸菌，以期为水产养殖提供专用高效的菌种资源。[方法]在低温和常温条件下从皮皮虾、南美白对虾肠道及养殖池底质活性污泥中分离具有水质净化功能的乳酸菌，对筛选的优良菌株采用形态、生理生化实验及16S rRNA序列分析进行鉴定，并对菌株的发酵参数进行了研究。[结果]低温和常温条件下从3种介质中共分离到乳酸菌136株，经水质净化能力筛选，发现常温分离的r13对模拟水体中亚硝态氮去除效果较强，72 h能将11.5 mg/L的亚硝态氮彻底去除，且对13.0 mg/L氨氮的去除率达到29.1%。经形态特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，鉴定菌株r13为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。发酵参数研究结果表明，该菌最适培养基组成为：酵母膏6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸钠4.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，番茄汁50 mL/L；培养条件为：初始pH 6.0，接种量5%，装液量45/50，培养温度为34℃；在上述优化培养条件下发酵72 h，菌液的生物量达28.4 g/L湿重，有效活菌浓度达4.4×109 CFU/mL。
关键词： 乳酸菌 水质净化 分离鉴定 发酵参数
Isolation, identification and fermentation optimization of lactic acid bacteria for aquaculture water purification
Xie Fengxing, Zhang Fengfeng, Zhou Ke, Zhao Yujie
, Zhao Qiong, Sun Haibo Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology, Tianjin 300384, China
Received 21 August 2016; Revised 13 October 2016; Published online 27 October 2016
*Corresponding author: Tel: +86-22-27950956; Fax: +86-22-27950828;. E-mail:yujiezh@126.com
Supported by the Major Projects in Science and Technology Support Program of Tianjin (16YFZCNC00670), by the Project of Natural Science Foundation of Tianjin (16JCQNJC15100) and by the Dean Fund Project of Tianjin Academy of Agricultural Sciences (16015)
Abstract: [Objective] In order to get excellent strains for aquiculture water purification, we screened lactic acid bacteria from the aquaculture environment and intestinal tract of shrimp.[Methods] The potential water purification ability of lactic acid bacteria at normal and low temperature was evaluated in the simulated wastewater. Morphological physio-biochemical characteristics, 16S rRNA gene sequence analysis were used to identify strain r13. Single factor test and orthogonal-design experiment were applied to optimize fermentation for r13.[Results] In total 136 lactic acid bacteria strains were isolated from 3 samples. The results of water purification test suggested r13 had higher removal ability of nitrite and ammonia from water. After 72 h treatment by r13, nitrite with 11.5 mg/L in the water was completely removed and ammonia degradation rate was 29.1% with 13.0 mg/L original concentration. According to morphological, physio-biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis, r13 was identified as Lactobacillus plantarum. The optimal fermentation condition for r13 was 6.0 g/L yeast extract, 20.0 g/L glucose, 4.0 g/L sodium acetate, 2.0 g/L diammonium hydrogen citrate, 2.0 g/L monopotassium phosphate, 50 mL tomato juice, with inoculation rate 5% (V/V), at pH 6.0 and 34℃. Under this condition cultured for 72 h, the bacterial biomass reached 28.4 g/L wet weight and cell counting reached 4.4×109 CFU/mL.[Conclusion] Considering high nitrite removal ability, we suggested that r13 would be promising microorganism for water purification in aquiculture.
Key words: lactic acid bacteria water purification isolation and identification fermentation parameters
乳酸菌是可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，主要存在于植物表面、人和动物肠道等。目前发现的乳酸菌至少有43属，210多个种及亚种，广泛应用于乳制品[1]、肉制品[2]、泡菜[3-4]和青贮饲料[5-7]发酵中以及益生菌[8]制品。近年来的研究结果表明，乳酸菌能有效去除食品发酵过程中产生的亚硝酸盐[9-13]，从而降低因亚硝酸盐累积而产生的食品安全问题，而将乳酸菌用于去除养殖水体中亚硝酸盐的研究相对较少。吴伟等研究表明在pH 6.0，含葡萄糖的水体中，短乳杆菌(Lactobacillus brevis，A1.558) 30 °C恒温处理48 h，对1.0 mg/L亚硝酸盐的去除率为94%，但对养殖水体中0.38 mg/L亚硝酸盐的去除率仅为60.5%[14]；李卓佳等研究发现乳酸杆菌(Lactobacillus spp.) LH能有效地降低养殖废水和饲料中的亚硝酸盐，但会使氨氮含量升高[15]。已有的研究结果表明，乳酸菌在去除养殖水体中的亚硝酸盐同时存在累积氨氮的风险，且亚硝酸盐去除效率不理想。本研究拟从养殖环境和养殖生物体内选育亚硝酸盐去除效率高同时对氨氮有一定去除效果的水质净化高效乳酸菌，并对菌株的发酵参数进行研究，以期为水产养殖水质净化高效微生态制剂的研制和开发提供优良的菌种资源。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 培养基： (1) 富集培养基(改良TJA)：番茄汁50 mL，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，TWeen80 1 mL，乙酸钠5 g，pH 6.8，蒸馏水 950 mL，121 °C灭菌20 min。(2) 分离培养基：碳酸钙单独灭菌，灭菌后与富集固体培养基混合后倒平板，添加量为8 g/L。(3) 水琼脂培养基：琼脂粉12-15 g，水1000 mL，灭菌待用。
1.1.2 材料： (1) 分离介质：养殖池底泥、皮皮虾和南美白对虾肠道。(2) 筛选水体：1/2改良TJA+0.05 g/L亚硝酸钠。(3) 模拟污水配制：参照陈尚智等的方法[16]略有改进。葡萄糖0.5 g、氯化钠0.25 g、K2HPO4 0.075 g、养殖池水1000 mL，试验时加入11.5 mg/L亚硝态氮和13.0 mg/L氨氮。
1.1.3 主要仪器和试剂： Allegra X-22R离心机(Beckman)，灭菌锅(Sanyo)，PCR (MJ Research PTC-100)，电泳仪(Bio-RAD)，凝胶成像系统(SIM Bio-Best)，水质快速测定系统(北京普析通用仪器有限责任公司)，UV-2550 紫外可见分光光度计(岛津)，恒温培养箱、摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)。DNA提取试剂盒(TaKaRa)，Taq酶、dNTPs (北京鼎国生物技术有限责任公司)，回收试剂盒[宝生物(大连)有限公司]，半胱氨酸(北京鼎国生物技术有限责任公司)、胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司)，其它试剂均为国产分析试剂。 1.2 常温条件下乳酸菌的分离纯化
1.2.1 取样： 采集养殖池底5-15 cm处污泥，用烧杯带回室内。取健康皮皮虾和南美白对虾，在无菌条件下剪下肠道，将肠道加入少许蒸馏水研磨，以研磨后的样品为原液。
1.2.2 富集： 取1 g泥或1 mL原液于50 mL富集培养基中，37 °C静置培养48 h。
1.2.3 分离纯化： 将富集的样品梯度稀释，取 0.1 mL 10-5、10-6、10-7稀释液于冷却至45 °C左右的分离培养基中，混匀倒平板，在平板上覆盖一薄层水琼脂培养基以造成厌氧环境，37 °C培养，培养过程中观察平板上有无水解圈产生。挑取产生水解圈的菌落在新的分离培养基上进行纯化。 1.3 低温条件下乳酸菌分离纯化 低温分离与纯化的方法同常温，只是将培养温度设为15 °C，时间适当延长。
1.4 菌株水质净化能力筛选
1.4.1 菌株产酸能力筛选： 将纯化的乳酸菌接种到改良的TJA液体培养基中，常温分离的菌株置于37 °C静置培养2 d，低温的菌株置于15 °C下静置培养6 d后测菌液的pH值。
1.4.2 菌株对亚硝态氮转化能力初筛： 将筛选水体分装，每瓶装水50 mL，灭菌后按3%接种量接种初筛优良菌株，30 °C厌氧培养4 d后取水，8000 r/min离心10 min，取上清液测亚硝态氮含量和pH值。
1.4.3 菌株对亚硝态氮转化能力复筛： 方法同上，分别在接菌后的第24、48、72、96 h取样，8000 r/min离心10 min，取上清，测亚硝态氮含量，根据测定结果计算转化率。
1.4.4 菌株在模拟污水中水质净化能力比较： 在250 mL的三角瓶中装模拟污水100 mL灭菌，取 3 mL菌液离心，将菌泥接入瓶中，30 °C静置处理，3 d后取水离心，测上清液中的氨氮及亚硝态氮含量。 氨氮测定采用纳氏试剂光度法(GB747987)，亚硝态氮测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(《水和废水监测分析方法》(第4版)。 1.5 r13形态观察及生理生化实验 形态观察包括菌落形态、革兰氏染色观察、芽孢染色观察，生理生化实验包括接触酶实验、硫化氢产生实验、pH生长实验、葡萄糖产酸产气实验、氯化钠生长实验、温度生长实验等。
1.6 分子鉴定
1.6.1 DNA提取： 采用SDS-CTAB结合法提取菌株基因组DNA。
1.6.2 PCR扩增： 16S rDNA扩增引物采用通用引物，正向引物为27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′，反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′，PCR扩增片段约为1500 bp。扩增体系：10×PCR缓冲液5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，27f 2.0 μL，1492R 2.0 μL，DNA模板2.0 μL，TaKaRa rTaq酶0.5 μL，ddH2O2 4.5 μL。循环参数如下：94 °C 5 min；94 °C 45 s，58 °C 45 s，72 °C 90 s，30个循环；72 °C 10 min。PCR产物保存于-20 °C备用。
1.6.3 16S rDNA的序列测定： 扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统紫外灯照射下将目的条带迅速切下，使用宝生物(大连)有限公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0 PCR产物回收试剂盒进行回收，测序工作由北京三博远志生物技术有限公司完成。 1.7 r13发酵参数研究
1.7.1 碳源筛选： 基础培养基成分为酵母膏5 g，牛肉膏10 g，乙酸钠5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸氢二铵2 g，番茄汁50 mL，蒸馏水950 mL，处理1：葡萄糖20 g；处理2：蔗糖20 g；处理3：乳糖20 g；处理4：麦芽糖20 g，用10%的碳酸钠调pH 6.0，接种量5%，34 °C静置培养3 d后测pH及干重。
1.7.2 氮源筛选： 基础培养基成分为葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸铵2 g，番茄汁50 mL，蒸馏水950 mL，处理1：牛肉膏10 g，处理2：蛋白胨10 g，处理3：胰蛋白胨10 g，处理4：酵母膏10 g，处理5：牛肉膏5 g，酵母膏5 g，用10%的碳酸钠调pH 6.0，接种量5%，34 °C静置培养3 d后测pH及干重。
1.7.3 培养条件优化： 温度设30、34、38 °C，初始设pH 5.0、6.0、7.0，装液量设25/50、35/50、45/50，采用L9(33)正交设计表进行3因素3水平正交试验，接种量5%，静置培养3 d后离心，测菌体生物量。
1.7.4 培养基成分优化： 酵母膏(6.0、8.0、10.0 g/L)，葡萄糖(15.0、20.0、25.0 g/L)，乙酸钠(3.0、4.0、5.0 g/L)和柠檬酸氢二铵(0.5、1.0、2.0 g/L)各设3个水平，采用L9(34)正交设计表进行4因素3水平正交试验，装液量45 mL/50 mL，初始pH 6.0，接种量5%，34 °C静置培养3 d后离心，测菌体生物量。
1.7.5 验证试验： 由于优化的培养基成分和培养条件组合均不在所设的试验中，对优化的培养基成分(酵母膏6.0 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠 4.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，K2HPO4 2 g/L，番茄汁50 mL/L)，和培养条件(初始pH 6.0，装液量45/50，培养温度34 °C，接种量5%)进行验证试验，72 h取样测菌体生物量和有效活菌浓度。 2 结果和分析 2.1 菌株的分离筛选 常温下共分离到乳酸菌73株，其中23株产酸能力较强(混养池底泥中4株，编号为CN11、CN12、CN13、CN15，皮皮虾中4株，编号CP30、CP32、CP33、CP34，对虾精养池底泥15株，编号r1-r15)，低温下共分离到乳酸菌63株，其中产酸能力较强的7株(混养池底泥中1株，编号为DN6，对虾中6株，编号DD9、DD10、DD11、DD13、DD16、DD18)，将此30株产酸能力较强的菌进行亚硝态氮转化能力筛选。
2.2 菌株对亚硝态氮转化能力初筛 从表 1可知，筛选的30株菌对亚硝态氮的转化能力都较强，去除率均在85%以上，除DD9、DD10和DD18外的其他27个分离株，对亚硝态氮的去除能力在95%以上，其最终的pH也都在3.80以下，说明其产酸能力也较强，选择此27个分离株进行复筛。
表 1. 分离菌株对亚硝态氮的去除及pH值 Table 1. The nitrite-N removal rate and pH of different isolated strains
| Strain number | Removal rate | pH |
| CK | / | 6.59 |
| DD9 | 85.19 | 4.55 |
| DD10 | 88.63 | 4.35 |
| DD11 | 99.12 | 3.68 |
| DD13 | 98.24 | 3.76 |
| DD16 | 98.64 | 3.76 |
| DD18 | 88.88 | 4.41 |
| DN6 | 99.12 | 3.65 |
| CN11 | 99.04 | 3.72 |
| CN12 | 98.60 | 3.69 |
| CN13 | 95.98 | 3.68 |
| CN15 | 95.54 | 3.77 |
| CP30 | 95.23 | 3.66 |
| CP32 | 95.37 | 3.77 |
| CP33 | 96.53 | 3.70 |
| CP34 | 98.79 | 3.66 |
| r1 | 95.87 | 3.72 |
| r2 | 95.95 | 3.70 |
| r3 | 95.92 | 3.65 |
| r4 | 96.17 | 3.78 |
| r5 | 96.10 | 3.74 |
| r6 | 96.07 | 3.68 |
| r7 | 96.09 | 3.72 |
| r8 | 95.63 | 3.80 |
| r9 | 95.89 | 3.75 |
| r10 | 96.01 | 3.79 |
| r11 | 96.17 | 3.65 |
| r12 | 95.86 | 3.68 |
| r13 | 95.64 | 3.70 |
| r14 | 96.02 | 3.69 |
| r15 | 95.93 | 3.66 |
表选项
2.3 菌株对亚硝态氮转化能力复筛 从表 2可知，所有菌株对亚硝态氮的去除率随试验的进行逐渐升高，说明筛选菌株对亚硝态氮的去除与菌体的生长繁殖活动有关。24 h菌株对亚硝态氮的去除率为24.56%-59.58%，48 h多数菌株的去除率达到70%以上，而到72 h所有菌株的去除率都达90%以上。菌株之间比较发现CN15、CP30、CP32、CP33、CP34、DD11、DN6、r10、r13、r15(表内黑体)的对亚硝态氮的去除能力相对较强，48 h去除率达70%以上，72 h达95%以上。由于CP30、CP32、CP33和CP34均为皮皮虾中分离，且4个分离株特征特性比较接近，因此选CP30进行后续试验，r10、r13、r15均为对虾精养池底泥中分离，选r13进行后续试验。
表 2. 乳酸菌对亚硝态氮去除速率 Table 2. The nitrite -N removal speed of isolated strains/%
| Strains | t/h | ||
| 24 | 48 | 72 | |
| ck | 2.42 | 6.89 | 9.94 |
| CN11 | 35.77 | 65.14 | 91.88 |
| CN12 | 49.33 | 68.50 | 93.90 |
| CN13 | 48.72 | 70.46 | 93.10 |
| CN15 | 40.38 | 71.55 | 95.43 |
| CP30 | 56.11 | 77.38 | 95.24 |
| CP32 | 50.11 | 71.38 | 95.04 |
| CP33 | 55.09 | 79.44 | 96.15 |
| CP34 | 55.03 | 77.99 | 95.14 |
| DD11 | 57.70 | 76.63 | 95.29 |
| DD13 | 40.99 | 62.60 | 93.20 |
| DD16 | 39.23 | 63.75 | 93.31 |
| DD18 | 27.64 | 60.94 | 93.36 |
| DN6 | 58.31 | 74.16 | 95.17 |
| r1 | 24.56 | 45.59 | 90.53 |
| r2 | 57.87 | 83.33 | 90.26 |
| r3 | 43.31 | 78.66 | 91.68 |
| r4 | 53.68 | 84.33 | 93.64 |
| r5 | 54.63 | 83.66 | 90.22 |
| r6 | 48.02 | 80.95 | 93.32 |
| r7 | 52.02 | 79.47 | 90.96 |
| r8 | 41.98 | 52.16 | 90.49 |
| r9 | 55.21 | 84.52 | 93.80 |
| r10 | 52.72 | 79.04 | 95.27 |
| r12 | 28.75 | 47.60 | 90.34 |
| r13 | 59.58 | 76.76 | 95.81 |
| r14 | 59.15 | 84.66 | 93.26 |
| r15 | 54.01 | 83.37 | 95.60 |
表选项
2.4 模拟污水中筛选结果 从表 3知，所有菌株对亚硝态氮都有很强的去除效果，去除率在90%以上。其中CN15、CP30和DN6的去除率达到99%，但氨氮含量出现了累积，可能是部分的亚硝态氮转化成了氨氮，这与李卓佳等研究结果一致[15]；而r13和DD11处理在去除亚硝态氮的同时，对氨氮有一定的去除效果，去除率为29.12%和33.56%。综合分析得知，r13的水质净化能力最强，处理72 h能将11.5 mg/L的亚硝态氮彻底去除，且对13.0 mg/L的氨氮去除率达到29.1%。
表 3. 模拟污水中筛选结果 Table 3. The water purificationresult under the simulated wastewater
| Nitrite-N | Ammonia-N | ||||
| Concentration/(mg/L) | Removal rate/% | Concentration/(mg/L) | Removal rate/% | ||
| CK | 11.50 | 0.00 | 13.00 | 0.00 | |
| CN15 | 0.03 | 99.74 | 13.83 | -6.17 | |
| CP30 | 0.10 | 99.13 | 21.39 | -64.16 | |
| r13 | 0.04 | 99.65 | 9.24 | 29.12 | |
| DN6 | 0.07 | 99.39 | 14.09 | -8.14 | |
| DD11 | 0.91 | 92.08 | 8.66 | 33.56 | |
表选项
2.5 r13的鉴定
2.5.1 r13的形态及生理生化实验结果： r13为杆状，革兰氏染色阳性，芽孢染色阴性，兼性厌氧，接触酶阴性，不产生H2S，pH 4.5生长，初步确定为乳杆菌属(Lactobacillus)。
2.5.2 分子鉴定： PCR扩增电泳后发现r13在1000 bp到2000 bp之间有目标条带(图 1-A)，对r13的PCR产物进行测序。序列与GenBank数据库中已收录乳酸菌的16S rRNA进行BLAST分析，r13核酸序列长度为1462 bp，NCBI数据库BLAST搜索结果表明，r13为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，将得到的序列采用MEGA 7.0建立系统发育树，从图 1可知，菌株r13与模式菌株JCM1149 (GenBank：NR117813.1)同处一个分支中，说明r13为Lactobacillus plantarum，与BLAST数据结果一致。
 |
| 图 1. r13 PCR电泳图(A)和聚类分析图(B) Figure 1. PCR electrophoretogram(A) and phylogenetic tree (B) drawn based on 16S rDNA of r13. |
| 图选项 |
2.6 r13发酵参数研究
2.6.1 碳源筛选结果： 从图 2可知，r13在以葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基上生长较好，其生物量干重显著高于其它处理，而在以乳糖为碳源的培养基上生长最差，生物量干重显著低于其它处理。葡萄糖价格低于麦芽糖，因此在今后生产中选择葡萄糖作为碳源。
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| 图 2. 碳源筛选结果 Figure 2. The screening result of carbon source. |
| 图选项 |
从图 2还可以看出菌液的pH值与生物量呈负相关关系，生物量高的处理其菌液pH相应较低，说明r13在培养过程中的产酸能力与菌体细胞的增殖有关。
2.6.2 氮源筛选： 从图 3可知r13在以酵母膏为氮源的培养基上生长最好，其生物量干重显著高于其它处理，而在以蛋白胨和胰蛋白胨为氮源的培养基上的生物量最低，显著低于其它处理，因此，适宜r13生长的有机氮源为酵母膏。
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| 图 3. 氮源筛选结果 Figure 3. The screening result of nitrogen source. |
| 图选项 |
生物量高的处理其pH值相应较低，这与碳源筛选结果一致，因此，菌液的pH可作为衡量菌体生长繁殖状况的一个指标。
2.6.3 培养条件优化： 从菌体生物量分析得知 (表 4)，利于r13生长的组合是A2B3C2，即初始pH 6.0，装液量45/50，培养温度为34 °C。从极差大小分析，初始pH>温度>装液量。 表 4. 培养基条件的正交表及试验结果 Table 4. The results of the fermentation conditions orthogonal test
| Test number | Factors | Results | ||
| A | B | C/°C | Wet weight | |
| 1 | 5.0 | 25 | 30 | 8.80 |
| 2 | 5.0 | 35 | 34 | 11.57 |
| 3 | 5.0 | 45 | 38 | 9.62 |
| 4 | 6.0 | 25 | 34 | 12.33 |
| 5 | 6.0 | 35 | 38 | 11.63 |
| 6 | 6.0 | 45 | 30 | 12.53 |
| 7 | 7.0 | 35 | 38 | 8.67 |
| 8 | 7.0 | 35 | 30 | 9.67 |
| 9 | 7.0 | 45 | 34 | 12.41 |
| K1 | 9.99 | 9.93 | 10.33 | |
| K2 | 12.16 | 10.96 | 12.10 | |
| K3 | 10.25 | 11.52 | 9.97 | |
| R | 2.17 | 1.59 | 2.13 | |
| A,B,C indicate pH,medium volume,temperature,respectively,K1,K2,K3 indicate the means of the corresponding list,respectively,R indicates range,the same as following. | ||||
表选项
从表 5方差分析可知，培养基初始pH和温度对菌体生物量有显著影响，装液量在所设试验范围内对菌体生物量影响不显著。 表 5. 方差分析结果 Table 5. Variance analysis results
| Factors | Sum of deviation square | Freedom | F ratio | Critical value | Significance |
| A | 8.419 | 2 | 26.898 | 19.000 | * |
| B | 3.382 | 2 | 12.403 | 19.000 | |
| C | 7.799 | 2 | 24.917 | 19.000 | * |
| Error | 0.310 | 2 |
表选项
2.6.4 培养基成分优化结果： 从表 6菌体生物量分析得知，利于r13生长的组合是a1b2c2d3，即酵母膏6.0 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠4.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L。从极差大小分析，乙酸钠>葡萄糖>酵母膏>柠檬酸氢二铵。方差分析可知，葡萄糖和乙酸钠对菌体生物量有显著影响，其他2个因素在所设试验范围内对菌体生物量影响不显著(表 7)。 表 6. 培养基优化的正交试验结果 Table 6. The results of the medium composition orthogonal test
| Test number | Factors | Results | |||
| a | b | c | d | Wet weight | |
| 1 | 6.00 | 15 | 3.00 | 0.50 | 20.67 |
| 2 | 6.00 | 20 | 4.00 | 1.00 | 26.13 |
| 3 | 6.00 | 25 | 5.00 | 2.00 | 22.53 |
| 4 | 8.00 | 15 | 4.00 | 2.00 | 23.47 |
| 5 | 8.00 | 20 | 5.00 | 0.50 | 23.20 |
| 6 | 8.00 | 25 | 3.00 | 1.00 | 25.07 |
| 7 | 10.0 | 15 | 5.00 | 1.00 | 19.33 |
| 8 | 10.0 | 20 | 3.00 | 2.00 | 25.20 |
| 9 | 10.0 | 25 | 4.00 | 0.50 | 26.93 |
| K1 | 23.11 | 21.16 | 23.65 | 23.60 | |
| K2 | 23.91 | 24.84 | 25.51 | 23.51 | |
| K3 | 23.82 | 24.64 | 21.69 | 23.73 | |
| R | 0.80 | 3.68 | 3.82 | 0.22 | |
| a、b、c、d indicate yeast extract,glucose,sodium acetate,diammonium hydrogen citrate respectively,the same as following. | |||||
表选项
表 7. 方差分析结果 Table 7. Variance analysis results
| Factors | Sum of deviation square | Freedom | F ratio | Critical value | Significance |
| a | 1.158 | 2 | 15.237 | 19.000 | |
| b | 21.783 | 2 | 357.671 | 19.000 | * |
| c | 21.931 | 2 | 288.566 | 19.000 | * |
| d | 0.076 | 2 | 1.000 | 19.000 | |
| Error | 0.080 | 2 |
表选项
验证试验结果表明，菌体发酵72 h生物量为28.4 g/L湿重，有效活菌浓度达4.4×109 CFU/mL。 3 讨论 乳酸菌是常用的益生菌，在水产养殖上的应用主要用于饲料添加，可提高鱼虾的生长性能和消化酶活性，改善其非特异性免疫力[17-21]，用于养殖水质净化的研究相对较少，而在现代化的高密度养殖模式中，大量残饵、粪便和生物残体沉入水体，在溶氧不足的情况下，有机质腐烂产生大量亚硝态氮、氨氮、硫化氢等有害物质，水质恶化，给养殖业造成巨大经济损失。乳酸菌在发酵过程中可产生亚硝酸盐还原酶和有机酸，通过酸降解和酶降解作用，去除水体中亚硝酸盐[22]。
李卓佳的研究表明，乳酸杆菌LH在不同条件下对养殖废水、饲料中的亚硝态氮去除率从24.57%到78.07%不等，但各处理氨氮出现了上升趋势[15]；施大林的研究结果表明在乳酸菌的添加量为1.5×107 g/mL条件下，处理模拟废水5 d对 1.2 mg/L氨氮去除率达28.7%，对0.25 mg/L亚硝态氮去除率为48.3%[23]。本研究选育的优良乳酸菌r13不仅对模拟水体中亚硝态氮有很强的去除效果，72 h能将11.5 mg/L的亚硝态氮彻底转化，且对13.0 mg/L氨氮的去除率达到29.1%，水质净化效果优于已有的研究报道。经形态特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，鉴定菌株r13为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。经过培养基和培养条件优化，r13发酵72 h的生物量达28.4 g/L湿重，有效活菌浓度达4.4×109 CFU/mL。
植物乳杆菌是饲料添加剂品种目录中允许添加的菌种，且菌株的产酸能力强，可用饲料添加，同时菌株对水体中亚硝态氮有很强的去除效果，对氨氮也有一定的去除效果，且菌株发酵的有效活菌浓度高，具有很好的市场前景。
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