程艳, 堵国成, 周景文, 陈坚
工业生物技术教育部重点实验室, 江南大学生物工程学院, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2016-11-13；修回日期：2016-12-28
基金项目：国家"973项目"（2012CB720802）；国家自然科学基金（31130043）；江苏省重点研发计划（BE2016689）
*通信作者：陈坚, Tel/Fax:+86-510-85918309;E-mail:jchen@jiangnan.edu.cn
摘要：[目的]氨基甲酸乙酯是发酵食品中普遍存在的一种潜在危害物。黄酒中氨基甲酸乙酯的前体主要是尿素和乙醇。本研究通过高通量筛选策略降低黄酒发酵过程中尿素的积累，从而降低氨基甲酸乙酯积累。[方法]以一株黄酒生产工业菌株酿酒酵母XZ-11为研究对象，采用ARTP诱变和高通量筛选策略，获得尿素积累量较低菌株。使用实时定量PCR技术检测氮代谢中尿素代谢和转运相关基因（DUR1，2和DUR3）的变化。[结果]筛选得到一株尿素高效稳定性利用菌株5-11C。其尿素积累量比酿酒酵母XZ-11降低了50.6%。实时定量荧光PCR结果表明，与尿素代谢和转运相关的基因（DUR1，2和DUR3）表达量分别提高了3.3和2.2倍。[结论]高通量筛选策略可以用于降低黄酒生产过程中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量。由于未采用基因工程手段，避免了可能的法规问题，消费者易于接受，在发酵食品行业具有较好的应用前景。
关键词： 酿酒酵母XZ-11 高通量筛选 ARTP 超高速流式分选系统 实时定量PCR
High-throughput screening of mutant strain to reduce the accumulation of ethyl carbamate precursor in rice wine fermentation
Cheng Yan, Du Guocheng, Zhou Jingwen, Chen Jian
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received 13 November 2016; Revised 28 December 2016
*Corresponding author: Jian Chen, Tel/Fax: +86-510-85918309; E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn
Supported by the Program for the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program, 2012CB720802), by the Key Program of National Natural Science Foundation of China (31130043) and by the Key Research and Development Program of Jiangsu Province (BE2016689)
Abstract: [Objective]Ethyl carbamate is a common potential hazard in different fermented foods. Urea and ethanol are the major precursors of ethyl carbamate in rice wine. In this study, the accumulation of urea was reduced based on a high-throughput screening strategy, therefore decrease the accumulation of ethyl carbamate in rice wine.[Methods]An industrial strain Saccharomyces cerevisiae XZ-11 was used for the study. Lower urea accumulating strains were achieved by using Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP) mutagenesis and high-throughput screening strategy. RT-qPCR analysis was used to detect the change of DUR1, 2 and DUR3, two important urea metabolism and transport genes.[Results]A mutant strain 5-11C was obtained with the capacity of both efficiently urea using and genetic stability. The accumulation of urea was 50.6% lower than that of S. cerevisiae XZ-11. RT-qPCR results showed that the expression levels of DUR1, 2 and DUR3 increased 3.3 and 2.2 folds, respectively.[Conclusion]High-throughput screening strategy can be applied to obtain mutants with reduced accumulation of ethyl carbamate precursor in rice wine.
Key words: Saccharomyces cerevisiae XZ-11 high-throughput screening ARTP MoFlo Astrios EQ RT-qPCR
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)，又名尿烷或乌拉坦，曾被广泛应用于动植物生长促进剂和抑制剂[1]。EC于2007年被列为与甲醛等级的2A类致癌物质[2]。发酵食品中由于不同的原因会积累一定的EC，从而对食用安全性带来一定的影响。黄酒中的EC主要是由发酵过程中产生的尿素与乙醇自发产生的。尿素是氮代谢和尿素循环中的关键物质，受到氮代谢阻遏效应(Nitrogen catabolite repression，简称NCR)调控[3]。当发酵培养基中无酿酒酵母偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺等)存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶水解为二氧化碳和氨；当有偏好型氮源存在时，尿素利用的转运蛋白和水解酶的表达会受到强烈抑制。由于细胞内大量的尿素积累对细胞有害，尿素会通过胞内尿素透性酶转运到胞外并积累，在生产和贮存过程中与乙醇自发形成EC。
因此，降低尿素浓度是消除黄酒中EC致癌物质的首要选择。为了解决这一问题，已开展了大量酿酒酵母氮代谢相关的调控。大量的研究表明，偏好型氮源阻遏尿素利用是通过将氮源转化成谷氨酸和谷氨酰胺两种不同的途径[4]。通过调节NCR效应相关的基因解除氮代谢阻遏，使尿素和EC分别降低63%和72%[5]。在黄酒中添加经过改造后的脲酶[6]，可以降解95.8%的尿素[7]。由于尿素主要是通过氮代谢中精氨酸分解所得，通过抑制酿酒酵母的精氨酸代谢[8]或敲除编码精氨酸酶的CAR1基因[9–10]，也可以阻断尿素的生成。但是这通常会造成精氨酸的大量积累从而影响黄酒风味[11]。过量表达酿酒酵母尿素代谢相关基因DUR1, 2降低尿素浓度[12–13]，同时调节编码尿素转运相关的基因DUR3[14–15]，也可显著减少尿素积累。大量的研究表明，通过代谢工程调控氮源代谢，可以显著降低尿素浓度，但同时也存在一些问题。在技术层面的主要问题包括发酵液中精氨酸的大量积累、菌株生长缓慢等，在实际产品生产和销售过程中，基因工程菌存在着稳定性差、易污染和潜在的食品安全问题。
本文采用等离子诱变(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)[16–17]，在室温常压下的大量等离子体使细胞发生突变，然后借助于超高速流式分选系统[18–19]等高通量筛选方法获取尿素积累量较低菌株。通过实时定量PCR检测与尿素代谢(DUR1, 2)和转运相关基因(DUR3)表达调控变化，发现与尿素代谢和转运相关的基因(DUR1, 2和DUR3)表达量分别提高了81.2%和30.1%。结果表明，高通量筛选策略可以用于降低黄酒生产过程中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量。由于未采用基因工程手段，避免了可能的法规问题和消费者接受程度问题，具有较好的应用前景。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株: Saccharomyces cerevisiae XZ-11由浙江某黄酒公司提供。
1.1.2 引物: 表 1为本研究使用的引物，均由Beacon Designer 7软件设计。
表 1. RT-qPCR中使用的引物 Table 1. Primers used in RT-qPCR
| Primers | Sequences(5′→3′) |
| GLN3-F | CTAATAACTTAATGCGTCACAA |
| GLN3-R | GGTAATATCGGAACAACAGA |
| GAT1-F | CTGATATGAATATGACTATGAAC |
| GAT1-R | TCCAGAATGATGATCTATTG |
| DUR1, 2-F | AAGAAGTAATGGTGGTGAAG |
| DUR1, 2-R | AAGTAATAATAACTGGCTCATCA |
| DUR3-F | AACGATAAGGAACAAGAAGAAGAA |
| DUR3-R | CCAAGGTTAGGCTCAATCAAT |
| ACT1-F | TGGATTCTGGTATGTTCT |
| ACT1-R | GTCAATATAGGAGGTTATGG |
表选项
1.1.3 主要试剂和仪器: MoFlo Astrios EQ超高速流式分选系统，美国Beckman公司；ARTP仪，无锡思清源生物科技有限公司；Freedom EVO 200移液工作站，瑞士Tecan公司；Cytation3酶标仪，美国BioTek公司；安捷伦1260高效液相色谱，美国Agilent公司；LightCycler 480 Ⅱ实时定量PCR扩增仪，瑞士Roche公司；NanoDrop ND-2000分光光度计，美国Thermo公司；PCR仪，美国BioRad公司；离心机，美国Eppendorf公司；细菌总RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit，德国Qiagen公司；反转录试剂盒PrimeScriptRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq试剂盒、DNA marker，大连TaKaRa公司。
1.2 培养基
1.2.1 种子培养基(YPD)(g/L): 葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10。
1.2.2 初筛培养基(g/L): 葡萄糖20，YNB(无氨基酸和硫酸铵) 1.74，硫酸铵5，谷氨酸5，谷氨酰胺5，尿素5。
1.2.3 复筛培养基(g/L): 葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，硫酸铵5，谷氨酸5，谷氨酰胺5，尿素5。
1.2.4 检测培养基(g/L): YNB合成培养基(无氨基酸和硫酸铵) 1.74，尿素0.6，葡萄糖20。
1.2.5 黄酒发酵培养基: 糯米100 g，生曲14 g，熟曲4 g，水170 g。
初筛和复筛培养基用于高通量筛选；检测培养基用于尿素积累稳定性检测。
1.3 ARTP诱变 本研究采用恒温等离子诱变技术[17]对酿酒酵母XZ-11诱变处理。将XZ-11涂布在YPD平板上，于30 ℃恒温培养箱中培养24 h。以控制菌体终浓度OD600=0.1转接到含有20 mL的YPD培养基中(250 mL锥形瓶)，220 r/min在30 ℃条件下振荡培养12 h。
取1 mL菌悬液于1.5 mL EP管中，8000 r/min，离心2 min，弃去上清液。用生理盐水洗涤2次后，稀释制成菌体浓度在106–107之间的菌悬液，取10 μL菌悬液均匀涂布于无菌的载片表面。然后将载片置于ARTP诱变育种系统的载台上，在入射功率为100 W、氦气流量为10 SLM条件下，分别照射30、50、70、90、110、130、150 s。样品处理完毕，用镊子将载片放到装有1 mL生理盐水的EP管中，持续充分振荡1 min，把附着在载片上的菌体充分洗脱形成菌悬液，对照组中直接加10 μL菌液至1 mL生理盐水中。
1.4 超高速流式分选系统分选 本研究采用碘化丙啶(Propidiumiodide，简称PI)对酿酒酵母细胞进行染色。PI可进入死细胞内与DNA结合而产生荧光[20]，而无法大量进入活细胞。根据这一特性，用超高速流式分选系统分析死细胞与活细胞[21]，计算百分比并分选活细胞。将ARTP处理后的菌悬液与过滤除菌的PI (10 mg/L)以1:1混合后，4 ℃避光反应20 min，过滤后于超高速流式分选系统中上样。根据超高速流式分选系统检测荧光特性分析死细胞，分选活细胞至96孔板中。根据公式(1) 计算致死率。
 | 公式(1) |
1.5 高通量筛选策略 本研究建立高通量筛选策略快速筛选出尿素积累量较低菌株，尿素高通量检测初筛：将流式分选的活细胞在96孔板摇床中培养，900 r/min在30 ℃条件下振荡培养56 h。在96孔板离心机中4000 r/min离心10 min，用移液工作站转移80 μL的上清液到96孔板中，并立即加入20 μL二乙酰一肟硫胺脲(6 g/L二乙酰一肟和0.3 g/L的硫胺脲)和100 μL磷酸高铁铵(6 g/L)。置于金属浴中100 ℃反应10 min后，用移液工作站转移至96孔板中，并用酶标仪检测525 nm下的吸光值。根据吸光值筛选突变菌株，尿素积累量较低菌株其吸光值低。高效液相色谱复筛：将初筛菌以终浓度OD600=0.1转接到含有20 mL的复筛培养基中(250 mL锥形瓶)，于30 ℃条件下220 r/min培养56 h。8000 r/min离心5 min，取上清液用高效液相色谱(HPLC)检测尿素浓度，筛选出尿素积累量较低的菌株。尿素积累稳定性检测：将复筛菌株涂布于YPD平板中，于30 ℃条件下恒温培养12 h，转接到新的YPD平板中同条件下传代培养，重复5次。将每次传代培养菌以终浓度OD600=0.1转接到含有20 mL的尿素利用检测培养基中(250 mL锥形瓶)，于30 ℃条件下220 r/min培养56 h。8000 r/min离心5 min，取上清液用高效液相色谱(HPLC)检测尿素，来确定高通量筛选菌株的遗传稳定性。
1.6 模拟黄酒发酵 将培养至对数期的菌株以10% (V/V)的接种量接入至模拟黄酒发酵培养基中，摇匀，加上发酵栓，置于恒温培养箱，30 ℃培养5 d后，温度降至15 ℃，培养15 d，以出发菌株作为对照，发酵结束后，4000 r/min离心10 min，取上清液用于检测尿素和乙醇含量。
1.7 检测尿素含量 黄酒中尿素含量通过高效液相色谱-荧光检测器检测[22]。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35 ℃；流速为1 mL/min；进样量20 μL；流动相：乙腈和0.02 mol/L乙酸钠；荧光检测器的激发波长和发射波长分别为213 nm和308 nm。
1.8 乙醇检测 黄酒中乙醇含量通过高效液相色谱-视差检测器检测[23]。色谱柱：有机酸柱300 mm×7.8 mm (Aminex HPX-87H，Bio-RAD)；柱温45 ℃；流速0.6 mL/min；进样量10 μL；流动相：5 mmol/L硫酸。
1.9 实时定量PCR (RT-qPCR) 将酿酒酵母细胞活化后转接到YPD培养基中，30 ℃ (200 r/min)培养12 h。种子液于4℃条件下10000 r/min离心5 min，收集菌体后立即置于液氮中研磨，并用酵母总RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit提取酵母总RNA。将酵母总RNA用gDNase 42 ℃处理3 min，除去基因组DNA。随后用RNA反转录试剂盒制备cDNA。以所得酵母cDNA为模板，利用LightCycler480Ⅱ系统进行荧光定量PCR。所用引物见表 1。以ACT1基因为内参基因。基因表达变化的计算采用2–ΔΔCT法[24]。表达变化量2倍以上的基因才被认为发生了显著变化。RT-qPCR反应采用20 μL体系，95 ℃ 40 s、95 ℃ 5 s和55 ℃ 30 s，50个循环。
2 结果分析 2.1 ARTP诱变致死率曲线 生物诱变广泛运用于生物发酵工业中，包括物理诱变如紫外诱变[25]、化学诱变[26]等。ARTP诱变通过控制等离子体强度破坏其DNA结构，进而改变其生物特性。近年来，由于常温常压等离子诱变术(ARTP)具有操作简单安全且诱变效率高等优点，引起了广泛关注[16]，已广泛运用于微生物育种[27–28]。ARTP诱变对微生物细胞和DNA具有显著的影响，细胞暴露在大量活跃等离子体下会导致大量细胞死亡。同时，过程中会有少量细胞通过自我修复形成新的突变。为了获得有效的突变率，较高的致死率十分必要。图 1是酿酒酵母XZ-11不同处理时间下的致死率曲线，根据诱变后死活细胞比，一般选取致死率90%较佳[29]。因此，选取的处理时间为100–120 s。
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| 图 1 致死率曲线 Figure 1 The lethality curve. Error bars are standard deviation from biological triplicates |
| 图选项 |
2.2 高通量尿素检测 目前，尿素检测方法有直接比色法、酶联反应法、高效液相色谱法等[30]。直接比色法包括二乙酰一肟法[31]、二甲基苯甲醛法和对二甲氨基苯甲醛法[32]等。酶偶联反应法涉及两种酶(脲酶，谷氨酸脱氢酶)，其成本高、稳定性较差。高效液相色谱-荧光检测器法检测精准性高、检测浓度范围较广，但难以用于高通量检测。常规比色法检测范围窄、稳定性差，国标法二乙酰一肟法耗时久、稀释倍数高，且需在比色管中沸水浴条件下进行，所需样品体积大。此外，沸水浴会导致反应体系体积损失，数据波动较大、回收率吻合度差、检测范围较窄、不适合大批量检测等。本研究采用优化后的二乙酰一肟显色法，即二乙酰一肟硫胺脲、磷酸高铁铵和样品以1:5:4混合后发生反应，缩合成红色二嗪化合物4, 5-二甲基-2咪唑酮。用酶标仪检测最大吸收峰525 nm处的值，获得标准曲线和回收率。如图 2所示，尿素浓度与OD525关系为y=34.54x–0.052(R=0.998)，在黄酒中加标回收测定，回收率为98.20%–101.18%，平均回收率为99.47%。实验证明，优化后的二乙酰一肟显色法适用于发酵体系中尿素含量的高通量检测。
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| 图 2 高通量尿素检测标准曲线 Figure 2 Calibration curve of high-throughput urea detecting. Error bars are standard deviation from biological triplicates. |
| 图选项 |
2.3 高通量筛选 高通量筛选发展迅速，已普遍实现微量化、智能化[33]。超高速流式分选系统分选结合移液工作站节约了大量人力物力，解决了高通量筛选复杂化和工作量大等问题。移液工作站可实现微量大批量转移，具有高效和低试剂成本优点[34]。本研究通过连续10次ARTP诱变处理菌株，用PI染色后结合超高速流式分选系统分选出38400株活细胞，最后采用优化后的二乙酰一肟显色法检测38400株诱变菌株尿素积累情况。结果如图 3-A所示，与出发菌株相比，162株显示出低OD525值，根据方程y=34.54x–0.052(R2=0.998) 计算尿素浓度。从初筛中选取10株低尿素积累量菌转接到复筛培养基中进行复筛，复筛中获得5株尿素积累量较低菌株，如图 3-B所示，分别是1-11A、8-8C、2-12、8-9H和5-11C。它们的尿素积累量分别比出发菌株降低了11.2%、24.5%、42.4%、46.1%和55.5%。此外，分别对这5株菌进行连续传代培养6代，检测尿素。如表 2所示，5株菌株1-11A、8-8C、2-12、8-9H和5-11C在6次传代培养中基本保持稳定，这说明高通量筛选菌株具有高效稳定的尿素利用能力。
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| 图 3 低积累尿素酿酒酵母的典型高通量筛选结果 Figure 3 Typical high-throughput screening process of the reduced urea accumulation S. cerevisiae strains. A: The first screening obtained 162 from 38400 strains by the method of high-throughput urea detecting, and 0 is the control. B: The second screening obtained 5 from 162 strains, and XZ-11 is the control strain. Error bars are standard deviation from biological triplicates. |
| 图选项 |
表 2. 尿素积累稳定性测定 Table 2. The stability of urea accumulation
| Strains | c(urea)/(mg/L) | |||||
| 1st subculture | 2nd subculture | 3rd subculture | 4th subculture | 5th subculture | 6th subculture | |
| Wild | 14.90±0.15 | 15.00±0.08 | 14.90±0.10 | 15.10±0.05 | 15.50±0.18 | 14.80±0.06 |
| 1-11A | 12.50±0.02 | 12.50±0.05 | 12.60±0.12 | 12.60±0.10 | 12.60±0.15 | 12.50±0.09 |
| 8-8C | 10.10±0.06 | 10.30±0.10 | 10.60±0.11 | 10.80±0.07 | 10.70±0.10 | 10.40±0.07 |
| 5-11C | 9.20±0.02 | 9.30±0.05 | 9.70±0.12 | 9.70±0.07 | 9.30±0.10 | 9.00±0.03 |
| 2-12 | 10.10±0.22 | 10.40±0.24 | 10.70±0.03 | 10.40±0.06 | 10.90±0.07 | 10.60±0.16 |
| 8-9H | 10.80±0.10 | 10.20±0.04 | 10.80±0.15 | 10.40±0.09 | 10.20±0.13 | 10.00±0.10 |
表选项
2.4 模拟黄酒发酵验证 为了进一步确定诱变菌株在黄酒中尿素积累量，对诱变复筛菌株进行模拟黄酒发酵验证。复筛菌株1-11A、8-8C、2-12、8-9H和5-11C进行模拟黄酒发酵，以XZ-11为对照株。结果如图 4，相较于出发菌株XZ-11，高通量筛选菌株1-11A、8-8C、2-12、8-9H和5-11C尿素积累量均有所降低，尿素积累量分别比出发菌株XZ-11降低了16.4%、20.5%、45.2%、49.2%和50.6%，说明此结果与高通量复筛结果相吻合，进一步验证了高通量筛选结果的可靠性，并且可应用于黄酒发酵。图中4株高通量筛选菌在模拟黄酒中乙醇含量平均比出发菌株高6%，说明高通量筛选菌株的黄酒发酵产乙醇并未受到影响。
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| 图 4 黄酒中尿素积累情况 Figure 4 The accumulation of urea in rice wine. Error bars are standard deviation from biological triplicates. |
| 图选项 |
2.5 实时定量PCR分析 针对高通量获得菌株8-8C、5-11C、8-9H、1-11A和2-12与氮代谢相关的基因(GLN3、GAT1、DUR1, 2、DUR3)的表达变化，进一步使用实时定量PCR进行验证。以XZ-11为对照菌株，ACT1基因为内参基因。如图 5所示，实验结果表明，在YPD培养基中，尿素积累量较低菌株8-8C、5-11C、8-9H、1-11A和2-12与氮代谢相关基因表达量均有提高。
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| 图 5 代谢阻遏效应相关基因表达 Figure 5 The expression of nitrogen catabolite repression gene. Error bars are standard deviation from biological triplicates. |
| 图选项 |
氮代谢阻遏效应主要是指由于偏好性氮源的存在激活了一些TOR途径中相关的TORP1和TORP2基因表达从而抑制GLN3和GAT1的表达[35]，进而阻遏了与尿素代谢与转运相关的基因DUR1, 2和DUR3的表达。根据氮代谢阻遏效应选取4个基因GLN3、GAT1、DUR1, 2和DUR3。实时定量PCR的结果(图 5)显示，尿素积累降低50.6%的5-11C菌株，与尿素代谢相关基因GLN3、GAT1、DUR1, 2、DUR3分别上调了3.6、5.3、3.3和2.2倍。尿素积累量降低45.1%的8-9H与尿素代谢相关基因GLN3、GAT1、DUR1, 2和DUR3上调倍数分别为2.6、9.5、2.1和1.3。1-11A、2-12和8-8C菌株的GLN3、GAT1、DUR1, 2、DUR3有些表达量提高，但也有部分不明显的下调。由此可知，尿素积累与尿素代谢相关基因(GLN3、GAT1、DUR1, 2、DUR3)表达有关，主要表现在尿素积累量越低其尿素代谢相关基因表达量越高。
3 讨论 尿素作为EC生成的重要前体，通过解除氮代谢阻遏效应降低胞外尿素浓度是降低黄酒中EC含量的首要选择。氮代谢阻遏效应调控等分子手段是目前降低黄酒中氨基甲酸乙酯的普遍采用的策略，该策略旨在解除氮代谢阻遏效应，进一步通过降低尿素来降低氨基甲酸乙酯。目前国内外在酿酒酵母氮代谢调控方面已经做了大量研究。Guo等[10]通过敲除CAR1 (编码精氨酸酶)使酒中尿素和EC分别降低了77.89%和73.78%，Wu等[13]采用过量表达DUR1, 2和敲除CAR1的手段使黄酒中尿素得到降低，Zhao等[36]通过研究氮代谢阻遏效应中相关基因的核定位发明了提高非偏好型氮源的利用改造方法，但是基因工程菌存在着稳定性差、易污染和潜在的食品安全问题。
近年来，随着等离子诱变ARTP、超高速流式分选系统、全自动移液工作站、多孔板摇床的开发利用，为高通量筛选开拓道路，使高通量筛选受到广泛青睐。目前尚未见有关高通量筛选降低氨基甲酸乙酯的研究，本文通过高通量筛选策略从38400株诱变菌中渐次通过初筛、复筛、稳定性检测和模拟黄酒发酵验证实验获得了尿素积累量较低菌株1-11A、8-8C、2-12、8-9H和5-11C，其尿素积累量分别降低了16.4%、45.%、20.5%、49.2%和50.6%。实时定量PCR检验与氮代谢相关基因表达调控结果显示，尿素积累较低的菌株与尿素代谢相关基因表现比较活跃。尿素积累降低50.6%的5-11C菌株，与尿素代谢相关基因GLN3、GAT1、DUR1, 2和DUR3分别上调3.6、5.3、3.3和2.2倍。本文结果与Zhao等[5]通过敲除Ure2p (NCR效应中的一种阻遏蛋白)使尿素积累量降低63%且与尿素代谢相关基因(GLN3、GAT1、DUR1, 2、DUR3)变得活跃一致。由此可以推断出，通过高通量筛选策略获得尿素代谢和转运相关的调控基因表达量提高菌株，从而降低了尿素积累。因此，本研究通过高通量筛选降低黄酒发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质的积累，避免了可能的法规问题，消费者易于接受，具有较好的应用前景和重要的研究意义，可适用于食品行业。
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