高媛, 曾伟主, 周景文, 陈坚
工业生物技术教育部重点实验室, 江南大学生物工程学院, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2016-11-25；修回日期：2017-02-09
基金项目：国家"973项目"（2014CB745100）；全国博士学位论文作者专项资金（201256）；国家自然科学基金（21390204）；江苏省科技支撑计划（BE2014698）
*通信作者：陈坚, Tel:+86-510-85913661;Fax:+86-510-85913661;E-mail:jchen@jiangnan.edu.cn
摘要：[目的]对源于普通生酮基古龙酸菌（Ketogulonicigenium vulgare WSH-001）的山梨糖脱氢酶（Sorbosedehydrogenase，SDH）和山梨酮脱氢酶（Sorbosone dehydrogenase，SNDH）的酶学性质进行分析。[方法]以K.vulgare WSH-001基因组DNA为模板，PCR扩增得到山梨糖脱氢酶基因（sdh）和山梨酮脱氢酶基因（sndh），构建重组表达质粒pET28a-sdh、pET28a-sndh，并分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中。利用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析得到纯化的SDH和SNDH。[结果]成功构建产SDH和SNDH的大肠杆菌BL21（DE3）并对目的酶进行纯化。SDS-PAGE分析结果表明，SDH和SNDH的大小分别为64 kDa和48 kDa，与理论预测值一致。显色法测得SDH酶活为3.15 U/mg，最适反应温度为30℃，最适反应pH为8.0左右；SNDH酶活为6.12 U/mg，最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.0左右。在pH 3.0、4.0、5.0的偏酸性条件下，2个酶的酶活受到显著影响。[结论]表达并纯化了来源于普通生酮基古龙酸菌来源的SDH、SNDH，并进行了酶学性质分析，为利用SDH、SNDH实现维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的一步法发酵生产提供了必要的参考。
关键词： 氧化葡萄糖酸杆菌 2-酮基-L-古龙酸 山梨糖脱氢酶 山梨酮脱氢酶
Purification and characterization of L-sorbose dehydrogenase and L-sorbosone dehydrogenase from Ketogulonicigenium vulgare WSH-001
Gao Yuan, Zeng Weizhu, Zhou Jingwen, Chen Jian
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received 25 November 2016; Revised 9 February 2017
*Corresponding author: Jian Chen, Tel:+86-510-85913661;Fax:+86-510-85913661;E-mail:jchen@jiangnan.edu.cn
Supported by National Basic Research Program of China (2014CB745100), by the Foundation for the Author of National Excellent Doctoral Dissertation of PR China (FANEDD, 201256), by the National Natural Science Foundation of China (21390204) and by the Science and technology support program of Jiangsu Province (BE2014698)
Abstract: [Objective]We purified and characterized L-sorbose dehydrogenase and L-sorbosone dehydrogenase from Ketogulonicigenium vulgare WSH-001.[Methods]L-sorbose dehydrogenase gene (sdh) and L-sorbosone dehydrogenase gene (sndh) from K. vulgare WSH-001 were amplified by PCR. The amplified fragments were inserted into pET-28a(+) to obtain expression plasmids, namely pET28a-sdh and pET28a-sndh. Escherichia coli BL21(DE3) harboring the above plasmids was used to express SDH and SNDH. Purified SDH and SNDH were obtained by using HisTrapTM affinity chromatography and gel filtration chromatography.[Results]SDH and SNDH from K. vulgare WSH-001 were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified. The molecular weight of SDH and SNDH were 64 kDa and 48 kDa on SDS-PAGE, respectively. Colorimetric assay showed that the enzyme activity of SDH and SNDH was 3.15 U/mg and 6.12 U/mg, respectively. The optimum temperature and pH of the purified SDH were 30℃ and 8.0, respectively, whereas the optimum temperature and pH of the purified SNDH were 35℃ and 8.0, respectively. The enzyme activity of SDH and SNDH was extremely low at pH 3.0, 4.0 and 5.0.[Conclusion]SDH and SNDH from K. vulgare WSH-001 were expressed in E. coli BL21(DE3) and characterized. The results could provide essential reference for the achievement of one-step fermentation of 2-KLG.
Key words: Gluconobacter oxydans 2-keto-L-gulonic acid L-sorbose dehydrogenase L-sorbosone dehydrogenase
维生素C，又称L-抗坏血酸，是人类及灵长类的一种外源性营养物[1]。维生素C是生物体内氧化还原反应的重要成员，在生物体内参与多种氧化还原反应，具有较强的还原性[2]，被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业[3]。2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)，是工业生产维生素C的直接前体。目前工业化生产2-KLG采用二步发酵法[4–5]，二步发酵法涉及两步三菌，即：(1) 氧化葡萄糖酸杆菌(Glucobnobacter oxydans)将底物D-山梨醇转化为L-山梨糖[4, 6–7]，几乎所有的山梨醇都能有效转化；(2) 普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)构成的混菌体系将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸[8]。
在二步发酵法中主要包括3种重要的脱氢酶系，分别为山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase，SLDH)、山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase，SDH)和山梨酮脱氢酶(sorbosone dehydrogenase，SNDH)。在K. vulgare中，已经证实有脱氢酶可以将L-山梨糖转化为L-山梨酮，再进一步将L-山梨酮转化为2-KLG[9]。随着生物技术的发展，越来越多的菌株得到了基因组序列，很多和SLDH、SDH、SNDH具有较高同源性的脱氢酶可以在NCBI、KEGG或者BRENDA等数据库中检索到，但是大部分均未经过实验验证。因此，这些脱氢酶的鉴定及酶学性质分析，对构建2-KLG一步生产菌株及其发酵条件优化至关重要。
本实验室前期研究中，曾对1株K. vulgare WSH-001菌株进行了全基因组测序，发现该菌细胞膜上存在大量参与不完全氧化还原反应的脱氢酶[10]，预测其中7个基因编码山梨糖脱氢酶(SDH)或山梨酮脱氢酶(SNDH)，并进行了验证实验[11]。为得到1株能将D-山梨醇直接转化为2-酮基-L-古龙酸的生产菌株，将上述SDH和SNDH基因通过质粒表达于G. oxydans WSH-003中，获得1株2-KLG产量达39.2 g/L的菌株[12]。
在利用G. oxydans WSH-003发酵生产L-山梨糖的过程中发现，发酵初始pH值为4.5左右，且pH逐渐降低；而对混菌生产2-KLG的研究过程发现，发酵产酸较合适的pH值为5–8，控制发酵过程pH值为6.7–7.0可获得较大转化率[1, 13–14]。脱氢酶SDH和SNDH的异源表达，导致此两种酶所处的环境发生变化，可能会影响酶的催化活性进而影响山梨糖到2-KLG的转化效率(表 1)。因此，本文以SDH和SNDH为对象，将源于K. vulgare WSH-001中的k0203 (编码SDH)、k0095 (编码SNDH)在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3) 中进行表达，并对SDH和SNDH进行纯化及酶学性质的分析。
表 1. 典型山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的酶学性质 Table 1. Enzyme chracteristics of typical SDH and SNDH
| Names | Sourses | Molecular weight/kDa | Km/(mmol/L) | Optimum pH | Optimun temperature/℃ |
| L-sorbose dehydrogenase[15] | Gluconobacter oxydans SCB329 | 60.000 | 52.70 | Around 7.0 | 42 |
| L-sorbose dehydrogenase[16] | Ketogulonigenium sp. WB0104 | 60.499 | 23.94 | 5.5–6.5 | 40–50 |
| L-sorbose dehydrogenase[17] | Sinorhizobium sp. 97507 | – | 64.20 | – | – |
| L-sorbose dehydrogenase[18] | Gluconobacter oxydans | 58.000 | – | 7.0 | 50 |
| L-sorbosone dehydrogenase[19] | Acetobacter liqueficiens IF012258 | 50.000 | – | – | – |
| L-sorbosone dehydrogenase[20] | Ketogulonicigenium vulgare Y25 | 43.100 | – | – | – |
| Sorbose/sorbosone dehydrogenase[9] | Gluconobacter oxydans DSM 4025 | 62.500 | – | 7.0–9.0 | – |
表选项
1 材料和方法 1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒: 大肠杆菌JM109由本实验室保存，用于质粒的构建；大肠杆菌BL21(DE3) 由本实验保藏，用于蛋白质表达；K. vulgare WSH-001来自于江苏江山制药有限公司。pMD19-T Simple购自TaKaRa (大连)有限公司，pET-28a(+)为本实验室保藏。
1.1.2 主要试剂: PrimeSTAR HS DNA polymerase、DNA连接酶，TaKaRa (大连)有限公司；2×Taq Master Mix DNA聚合酶，杭州宝赛生物科技有限公司；限制性内切酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，Thermo Scientific公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌质粒小量抽提试剂盒、感受态细胞制备试剂盒，上海生工生物有限公司；标准分子量蛋白、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE预制胶，Life Technologies公司。
1.1.3 培养基及缓冲液: LB培养基(g/L)：酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10，ddH2O 1 L；固体培养基添加琼脂条20，121 ℃灭菌15 min。
TB培养基(g/L)：酵母提取物24、蛋白胨12、甘油4 mL/L、KH2PO4 2.3、K2HPO4 16.4，ddH2O 1 L；121 ℃灭菌15 min。
Binding buffer (mmol/L)：NaH2PO4 50，NaCl 300，咪唑10，用NaOH调至pH 8.0。
Wash buffer (mmol/L)：NaH2PO4 50，NaCl 300，咪唑20，用NaOH调至pH 8.0。
Elution buffer (mmol/L)：NaH2PO4 50，NaCl 300，咪唑250，用NaOH调至pH 8.0。
1.2 载体构建 根据山梨糖脱氢酶基因sdh (NCBI登录号为AEM40042.1) 和山梨酮脱氢酶基因sndh (NCBI登录号为AEM39934.1) 的基因序列，设计引物sdh-F、sdh-R及sndh-F、sndh-R (表 2)。以K. vulgare WSH-001基因组为模板，sdh-F、sdh-R为引物扩增大小为1737 bp的sdh基因；以K. vulgare WSH-001基因组为模板，sndh-F、sndh-R为引物扩增大小为1290 bp的sndh基因。sdh及sndh基因先连接到pMD19-T Simple上得到T-sdh、T-sndh。测序正确后，用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，并连入表达载体pET-28a(+)，转化入E. coli BL21(DE3)，取菌液提取质粒，对质粒进行双酶切实验，核酸电泳验证阳性转化子。
表 2. 本研究中所用引物 Table 2. Primes used in this study
| Primers | Sequences (5′→3′) | Restriction sites |
| sdh-F | GGAATTCCATATGAAACTGACGACCCTGCTG | Nde Ⅰ |
| sdh-R | CCCAAGCTTTTACTGCTGCGGCAGAGC | Hind Ⅲ |
| sndh-F | GGAATTCCATATGAGCGTTCTGGCCAAATTC | Nde Ⅰ |
| sndh-R | CCCAAGCTTTTACGCAGCGGAAATCCGCCA | Hind Ⅲ |
| The underlined are restriction enzyme cutting sites. | ||
表选项
1.3 诱导表达及粗酶液制备 从LB固体平板上挑取大肠杆菌BL21(DE3) 单菌落转接于LB液体培养基中(加入终浓度为50 μg/mL的卡那霉素)，37 ℃、220 r/min条件下培养12 h后，以1%的接种量转接至TB培养基中，30 ℃、220 r/min条件下培养3 h至菌体OD600≈0.6时，向培养基中添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG进行诱导。为促进蛋白的可溶性表达，加入IPTG后，培养温度降低至20 ℃。
取培养12 h的菌体，4 ℃、5000 r/min离心10 min收集菌体，将收集到的菌体用Binding buffer缓冲液清洗2次，重悬至菌体浓度为OD600≈20，冰上放置超声破碎15 min后，4 ℃、10000 r/min离心30 min去除细胞碎片，采用微孔滤膜(0.45 μm)过滤除去杂质，得到粗酶液。
1.4 SDH及SNDH的分离纯化 首先利用Ni-NTA亲和层析柱(QIAGen)对粗酶液进行纯化：首先用Binding buffer平衡2个柱体积；将1.3中得到的粗酶液上样5 mL；然后用Wash buffer冲洗5个柱体积；再用Elution buffer洗脱5个柱体积；最后用纯水冲洗5个柱体积后再用20%乙醇冲洗3个柱体积，卸下柱子保存。以上步骤中，流速均为1 mL/min。
进一步利用分子筛(HiLoad 16/60 Superdex 200) 进行纯化：首先用不加咪唑的Wash buffer平衡1.5个柱体积；将上面经过Ni-NTA亲和层析柱(QIAGen)获得的酶液经超滤管浓缩后进样1 mL；然后用1.2个柱体积的不加咪唑的Wash buffer进行洗脱；再用纯水冲洗和用20%乙醇各冲洗1.5个柱体积，保存柱子。以上步骤中，流速均为1 mL/min。
对得到的洗脱峰进行酶活及SDS-PAGE分析。
1.5 酶活测定及酶学性质分析 在620 nm可见光波长下可以通过检测DCIP-PMS显色剂的褪色速率来测定SDH及SNDH的酶活[21]。显色剂配制：0.0116 g DCIP、0.0612 g PMS、0.0048 g MgSO4溶于5 mL 50 mmol/L pH 7.0的PBS缓冲液中。反应底物：L-山梨糖或乙二醛(乙二醛代替L-山梨酮用于测定SNDH酶活)[22]溶于50 mmol/L PBS缓冲液中，L-山梨糖或乙二醛终浓度为200 mmol/L。
取纯化后的酶液15 μL加5 μL 10 mg/L PQQ在30 ℃条件下孵育10 min变为全酶，加入100 μL显色剂及900 μL反应底物后混匀，取200 μL加入96孔板中，在OD620滤镜下每10 s检测反应液褪色情况，检测10次。1个L-山梨糖脱氢酶(或L-山梨酮脱氢酶)酶活定义为30 ℃条件下每分钟还原1 μmol DCIP的酶量，等同于每分钟氧化1 μmol底物L-山梨糖(或乙二醛)的酶量。
1.6 酶反应动力学参数测定 在酶反应体系中分别添加山梨糖和乙二醛，使其终浓度为25、50、100、150、200 mmol/L，于最适反应条件及最适反应pH条件下测定其初始反应速率[11]。
1.7 SDH、SNDH体外催化反应 将SDH与SNDH混合后加入PQQ孵育后变为全酶，参照1.5中酶活测定方法，以L-山梨糖为底物，对其组合催化L-山梨糖生成2-KLG的能力进行测定。
1.8 液相检测条件 高效液相色谱仪Agilent 1260，检测器为示差折光检测器，色谱柱为Aminex HPX-87H (Bio-Rad)，流动相为为5 mmol/L的H2SO4，流速为0.5 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为10 μL。
2 结果和分析 2.1 表达载体的构建 分别以限制性内切酶Nde Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切T-sdh、T-sndh以及pET-28a(+)，sdh和sndh两片段与pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中，得到重组表达质粒pET28a-sdh和pET28a-sndh。提取质粒后用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切验证，核酸电泳得到大小为1800 bp和1400 bp左右的条带，分别与sdh和sndh大小一致(图 1)。
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| 图 1 表达载体酶切验证琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of expression vectors. M: DL10000 DNA marker; 1: Recombinant plasmid pET28a-sdh digested by Nde Ⅰ and Hind Ⅲ; 2: Recombinant plasmid pET28a-sndh digested by Nde Ⅰ and Hind Ⅲ. |
| 图选项 |
2.2 诱导表达及纯化 将E. coli BL21(DE3)/pET28a-sdh及E. coli BL21(DE3)/pET28a-sndh单菌落接种于LB液体培养基中，培养12 h后转接至TB培养基中，待菌体OD600达到约0.6时，添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为20 ℃。取培养12 h的细胞，用Binding buffer洗涤2次后，取OD600=2的菌体细胞进行SDS-PAGE分析sdh和sndh在E. coli中的表达情况，对全细胞分析可见大小约为64 kDa和48 kDa的蛋白条带与SDH及SNDH的理论预测值相符(图 2条带1、4)，表明sdh和sndh基因在E. coli中得到了表达。
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| 图 2 SDH及SNDH纯化过程的SDS-PAGE分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of the purification process of the dehydrogenases. M: Standard protein marker; 1: E. coli BL21(DE3)/pET28a-sdh; 2: SDH purified by Ni-NTA; 3: SDH purified by gel filtration chromatography. 4: E. coli BL21(DE3)/pET28a-sndh; 5: SNDH purified by Ni-NTA; 6: SNDH purified by gel filtration chromatography. |
| 图选项 |
2.3 SDH及SNDH的酶学性质分析 对纯化后的蛋白进行最适反应pH值、最适反应温度的分析。以pH 7.0的PBS作为酶活反应的缓冲液，分别测定SDH和SNDH于20–45 ℃反应温度下的酶活，计30 ℃的相对酶活为100%。结果显示SDH的最适反应温度为30 ℃，且25 ℃和35 ℃的酶活与30 ℃的酶活基本一致；SNDH的最适反应温度为35 ℃ (图 3-A)。
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| 图 3 温度及pH对脱氢酶活性的影响 Figure 3 Effects of temperature and pH on enzyme activity. A: Effects of temperature on SDH and SNDH activity; B: Effects of pH on SDH and SNDH activity. |
| 图选项 |
于30 ℃的条件下进行酶活测定，比较SDH和SNDH于pH 3.0–10.0环境中的酶活力，计pH 7.0时的相对酶活为100%。结果显示SDH于pH 8.0时呈现最高的相对酶活，SNDH在pH 8.0和pH 9.0时相对酶活接近且最高。两种脱氢酶在pH较低时，相对活性都很低(图 3-B)。
2.4 SDH及SNDH的酶活测定及动力学参数的测定 SDH的酶活测定条件为pH 8.0，温度为30 ℃，参照1.2.4中酶活测定方法，测得SDH的比酶活为3.15 U/mg；同样的，SNDH的酶活测定条件为pH 8.0，温度为35 ℃，测得SNDH的比酶活为6.12 U/mg。
为了确定关键酶的动力学参数，分别测定了SDH和SNDH在25、50、100、150、250 mmol/L底物浓度下的催化活性，进行数据拟合和米氏方程进行数据分析，得到SDH的Km为149.52 mmol/L；SNDH的Km为94.68 mmol/L (图 4)。
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| 图 4 反应动力学的米氏方程 Figure 4 Michaelis-Menten plots for the reaction kinetics. |
| 图选项 |
2.5 SDH及SNDH体外催化特性分析 对SDH、SNDH组合催化L-山梨糖反应体系进行HPLC验证，结果SDH、SNDH可组合催化L-山梨糖生成2-KLG，并且检测到中间产物L-山梨酮(图 5)。
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| 图 5 催化L-山梨糖生成2-KLG的HPLC检测 Figure 5 Analysis of 2-KLG production from L-sorbose by HPLC. |
| 图选项 |
3 讨论 目前国内发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸采用的方法为二步发酵法[23]。其中，负责L-山梨糖向2-KLG转化的山梨糖脱氢酶(SDH)和山梨酮脱氢酶(SNDH)是该途径中的关键酶。因此，将源于混菌系统的SDH和SNDH异源表达于氧化葡萄糖酸杆菌，理论上可获得2-KLG生产一步菌。为了实现这一目的，Akira等对一种G. oxydans DSM 4025来源的山梨糖/山梨醇脱氢酶的酶学性质进行分析，发现该酶最适反应pH值为7.5–8.5，最适反应温度为30–40 ℃[22]。Zhang等对G. oxydans GO112中的SDH进行纯化和分析发现，pH 6.86、40 ℃时，SDH活性最高[24]。Taro等发现源于K. vulgare DSM 4025的SNDH在pH 7.0时可将L-山梨酮转化为L-AA[25]。
本文将源于K. vulgare WSH-001的sdh和sndh基因异源表达于大肠杆菌中，通过Ni-NTA亲和层析柱(QIAGen)和凝胶过滤层析得到了较高纯度的SDH和SNDH，利用显色法测得SDH的酶活为3.15 U/mg，并测得SDH的最适反应温度为30，最适反应pH为8.0左右；同样的，SNDH的酶活为6.12 U/mg，并测得SNDH的最适反应温度为35，最适反应pH为8.0左右。在pH 3.0、4.0、5.0的偏酸性条件下，2个酶的酶活都很低。本实验室的Gao等将源于K. vulgare WSH-001的sdh和sndh基因通过质粒异源表达于G. oxydans WSH-003，得到2-KLG最高产量为4.9 g/L，通过连接肽将SDH和SNDH融合表达后，2-KLG产量进一步提高为32.4 g/L，尽管如此，发酵液中仍然有大量L-山梨酮积累[12]且发酵过程中pH值自然下降为4.0左右[26]，因此，基于本实验获得的研究结果，可设计pH调控策略优化Gao等构建的G. oxydans WSH-003 2-KLG生产一步菌。通过调控发酵后期反应体系的pH及温度，使得表达在G. oxydans WSH-003中的SDH、SNDH具有最大的催化活性。K. vulgare WSH-001来源的SDH和SNDH的酶学性质研究，将会为2-KLG生产一步菌的应用提供借鉴意义。
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