, 黄智峰1,2, 张东3, 陆永生1
1. 上海大学环境与化学工程学院, 上海 200444;
2. 同济大学环境科学与工程学院, 上海 200092;
3. 上海城市水资源开发利用国家工程中心, 上海 200082
收稿日期: 2019-06-19; 修回日期: 2019-07-27; 录用日期: 2019-07-28
基金项目: 国家自然科学基金（No.51678351）
作者简介: 高佩玥(1995-), 女, E-mail:gaopeiyue@shu.edu.cn
通讯作者（责任作者）: 陆永生(1971—), 男, 硕士生导师, 主要研究方向为：废水及固体废物的资源化利用, E-mail:luys71748@shu.edu.cn
摘要: 本研究开展了蓝藻产2-MIB功能基因mic的qPCR定量分析，对上海水源水库中的mic基因进行长期调研.结果表明，在长江水源水库和黄埔江水源水库中mic基因都有检出.在夏季其丰度达到峰期，基因拷贝数达到107~108 copies·L-1.分析表明mic基因拷贝数与蓝藻、伪鱼腥藻细胞密度、2-MIB浓度之间均存在相关性.因此通过mic基因定量进而推断水中产嗅生物总量的方法，可代替繁琐、重现性低的显微镜镜检过程.应用中还需更多实践，结合其他指标改进准确度.
关键词:二甲基异莰醇qPCR饮用水源水库
Application and research of the detection methods for odorous substances in water reservoirs
HUANG Xin1, GAO Peiyue1
, HUANG Zhifeng1,2, ZHANG Dong3, LU Yongsheng1 1. School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University, Shanghai 200444;
2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092;
3. Shanghai National Engineering Research Center of Urban Water Resources, Shanghai 200082
Received 19 June 2019; received in revised from 27 July 2019; accepted 28 July 2019
Abstract: In this work,2-MIB producing gene (mic) of Cyanobacteria was quantitatively determined by qPCR method. The occurrence and distribution of mic gene in two drinking water reservoirs located in Shanghai was investigated. The results show that mic gene occurred in two studied reservoirs,Yangtze River water sources and Huangpu River. The abundance reached highest in summer,with a copy number of 107~108 copies·L-1. There is a good correlation between the copy number of mic gene,cell density of Cyanobacteria,Pseudoanabaena sp. and 2-MIB concentration. Therefore the evaluation of odor-producing biota by using the quantification of mic gene may replace the cumbersome and low reproducible microscopic determination process of algae. Before its application,more investigation should be conducted and other indicators might be needed to improve the accuracy.
Keywords: 2-MIBqPCRdrinking water reservoirs
1 引言(Introduction)人体对于饮用水的质量评价往往基于对水的直观感受(色、嗅和味等), 因此饮用水的异嗅味问题是影响饮用水质量的重要因素.一般而言, 饮用水中的异嗅味通常由水源中带来, 多由生物代谢产物引起(马晓雁, 2007), 包括腐殖质、藻类、放线菌和真菌的分泌物生成的土臭素(Geosmin, GSM)和二甲基异莰醇(2-MIB)等有机物(Schrader et al., 2010；Abbaszadegan et al., 2015；Su et al., 2017).
藻类是饮用水产生嗅味的主要原因.在蓝藻的生长代谢过程中常有2-MIB和土臭素的生成.2011—2012年, 上海某水库输水口2-MIB含量均超过限值(陈国光等, 2013).国外如美国、日本、瑞士及德国等地水环境中均有嗅味事件的报道(Durrer et al., 1999；Westerhoff et al., 2005；Sugiura et al., 2010；J?hnichen et al., 2011).MIB在水体中的嗅阈值极低, 通常在4~10 ng · L-1左右(Juttner et al., 2007；Oh et al., 2017), 超过30 ng · L-1即会散发出极强的气味, 因此往往闻到时即超标.而且根据以往经验, 水体中2-MIB爆发有时呈现“脉冲式”迅速增长与快速恢复, 爆发时间点难以预测.仅依靠对2-MIB的检测无法实现对其有效预警预测与管控.
实时荧光定量PCR(qPCR)对基因定量的检测已被广泛用于检测蓝藻总量或者有毒蓝藻量, 具有操作简便、快速高效、高通量及灵敏度高、特异性好和高重复性等优点.目前少量研究开发出qPCR检测水体中产土臭素的微生物生物总量的方法, 但是利用分子生物技术检测2-MIB合成基因生产者的方法还较少.Wang等(2016)首先建立了qPCR方法对2-MIB合成基因进行了定量分析, 他们在鉴定出蓝藻的单萜环化酶(mic)基因序列的保守区域的基础上设计了针对于蓝藻的特异性引物来对产生2-MIB的蓝藻进行定量, 并阐明了蓝藻2-MIB基因与相对应的2-MIB浓度在水生生态系统中的相关性.基于此, 本研究建立了qPCR方法同时检测水体中的2-MIB和土臭素, 并对上海两个水库的水体进行了长期调查.研究旨在通过对水体中2-MIB和土臭素的初步研究, 为水库嗅味管理提供技术支持.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 水库与采样点A水库为长江水源水库, 于2010年建成并运行使用, 设计日供水量为7.2×106 m3 · d-1.水库面积66 km2, 体积为4.35×108 m3, 水深为1.5~1.7 m.为了防止咸潮入侵, 淡水流经水库从西部(进口水闸)到东部(泵站), 最后泵送并分配给8个饮用水处理厂.库内水力停留时间(HRT)在15~35 d的范围内, 并设置了一个恒定关闭的出口闸门来排出多余的水.从水库入水口(1号)到出水口(5号)沿水流方向设置5个采样断面(靠近2号采样点的白色区域为一个小岛).
B水库为黄浦江水源水库, 于2016年12月29日正式运行, 目前供水规模约2.1×106 m3 · d-1, 近期设计供水规模3.51×106 m3 · d-1.水库主要有水库和输水泵站两大部分组成, 总占地面积约2.7 km2, 总库容约910万m3, 承担上海5个区域的原水供应, 服务人口约670万.库内水力停留时间(HRT)为3~4 d.从水库入水口(1号)到出水口(8号)沿水流方向设置8个采样断面.
每月采集水样(0.5 m深度, 5 L).每个断面的样品由3个相近点的样本混匀组成.水样均用无菌塑料容器收集.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 2个调查水库与采样点分布图 Fig. 1Sampling locations in two studied reservoirs in Shanghai |
2.2 qPCR方法定量水中2-MIB基因实验所用水样DNA提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司, q-PCR酶(SYBR)购自美国赛默飞世尔科技公司, 合成引物由上海生工生物科技有限公司提供, 2-MIB标准品购自美国O2Si公司.采用qPCR方法对水体及沉积物中的2-MIB进行检测, qPCR反应体系如表 1所示.反应所用引物参考文献(王中杰, 2012).反应程序：94 ℃预变性3 min, 接着40个循环反应(95 ℃变性15 s, 59 ℃退火与延伸30 s, 每个循环结束后检测一次荧光信号), 反应完毕后样品从75~95 ℃逐渐升温.
表 1(Table 1)
| 表 1 荧光定量PCR反应体系 Table 1 Reaction mixture of qPCR | ||||||||||||||
表 1 荧光定量PCR反应体系 Table 1 Reaction mixture of qPCR
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3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 上海水源地2-MIB基因总量随时间变化特征分别对A水库5个采样点和B水库8个采样点的2-MIB合成基因(mic基因)浓度随时间的变化进行了研究.A、B水库采样点的mic基因浓度的平均值随时间分布的特征见图 2.结果表明, 2-MIB合成基因在水体中广泛存在.在调研期间, A、B水库每个月份各点位均有2-MIB合成基因被检出, A水库浓度变化为105~107 copies · L-1, B水库浓度变化为104~108 copies · L-1, 而且存在着明显的时间分布特征.总体而言, 水体中mic基因拷贝数呈现一个先上升后下降的趋势, 基本在104 copies · L-1以上.对A水库而言, 在3—7月期间, mic基因浓度处于低谷时期, 最低丰度水平为1.23 × 105 copies · L-1, 然而从8月开始, mic基因拷贝数丰度有了一个骤然的升高, 虽然在随后的几个月中拷贝数有所波动, 但基本都处于106 copies · L-1以上, 并在11月达到了峰值.到了1、2月, mic基因拷贝数开始有所下降, 并在3月到达最低水平.而B水库在4—6月间, mic基因浓度处于低谷时期, 最低丰度水平为8.95×104 copies · L-1.从7月开始, mic基因拷贝数丰度有了一个急剧升高, 并在8月达到峰值.与A水库不同的是, B水库来自黄浦江上游, 主要来自东太湖出水, 其上游原水水质基本为Ⅲ~Ⅳ类, 水质差的少数月份为Ⅴ类水体, 季节性氨氮浓度高(乐林生等, 2005；陈国光等, 2007).长江原水水质基本为Ⅱ类, 虽然总磷、总氮较为丰富, 但其所受污染及水库内藻量均少于黄浦江原水(董秉直等, 1998；钱静汝, 2017).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 2017年A、B水库水样中2-MIB合成基因拷贝数的分布特征 Fig. 2Distribution characteristics of copy number of 2-MIB synthetic gene in water samples in A and B Reservoir in 2017 |
3.2 mic基因总量与优势藻种的相关性伪鱼腥藻属是蓝藻中被广泛用于研究2-MIB生物合成代谢途径和基因表达的藻类(Kakimoto et al., 2014；Chiu et al., 2016), 分子生物学方法定量2-MIB基因的“标准物质”往往使用伪鱼腥藻来构建标准质粒.由于在A水库的现场调研中也发现在夏季水中的伪鱼腥藻比率偏高, 因此将伪鱼腥藻与和mic基因总量建立相关性分析.如图 3可见, mic基因拷贝数与伪鱼腥藻的密度随时间变化的趋势大致上是相同的, 在5—7月处于较低的浓度水平, 而从8月开始迅速上升.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 A水库2-MIB合成基因拷贝数与伪鱼腥藻细胞密度的时间变化趋势 Fig. 3The temporal variation and the correlations of mic gene copy number with Pseudoanabaena sp. cell number in reservoir A |
研究者对于嗅味物质的生产者的鉴定主要是通过嗅味物质的浓度与优势藻种之间的关联度进行判断.马晓雁等(2008)在对上海市饮用水中嗅味物质的规律及来源进行研究时发现在嗅味物质的高发时期, 水体中的颤藻等微生物的密度也处于高峰期, 故认为颤藻是嗅味物质的主要来源.Su等(2013)在通过对密云水库中的浮游植物与2-MIB浓度之间建立回归分析时发现拟浮丝藻属为该水库中2-MIB的主要生产者.Rong等(2018)利用qPCR法对深圳的2个水库进行了2-MIB的检测, 结果表明, 伪鱼腥藻是水库中2-MIB的主要生产者, mic基因的数量与2-MIB浓度之间存在极强的关联性(R2= 0.746, p < 0.001).本例研究中, A水库的mic基因拷贝数与伪鱼腥藻的浓度之间存在一定的相关性(R2=0.401, p < 0.05), 伪鱼腥藻的爆发期与mic基因的高峰期一致, 故认为A水库内的优势藻种为伪鱼腥藻.而B水库检测显微镜检测中未发现明确产嗅优势藻种.
3.3 mic基因总量与2-MIB的相关性调研期间, A水库检测到的2-MIB浓度值为2.39~7.32 ng · L-1, mic基因拷贝数与2-MIB浓度呈正线性相关性(R2=0.368, p < 0.05), 见图 4a.B水库中检测到的2-MIB浓度为1.1~14039.7 ng · L-1, 高峰期出现在8月.mic基因拷贝数与2-MIB浓度在呈现良好的对数相关性(R2=0.478, p < 0.05, 图 4b).对比A、B水库的2-MIB浓度和mic浓度, 发现B水库的2-MIB浓度和mic浓度显著高于A水库.自2014年以来, 东太湖中的总磷(TP)浓度有逐渐上升的趋势.氨氮、总磷的升高使得水体富营养化加重, 故而造成近年来太湖蓝藻高强度频发(谷孝鸿等, 2019).在东太湖原水中的2-MIB浓度可达到1121.99 ng · L-1(展永兴等, 2018).
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 A水库(a)和B水库(b) mic基因拷贝数与2-MIB浓度之间的关系(95%置信区间) Fig. 4Relationship between the copy number of mic gene and 2-MIB concentration in Reservoir A (with 95% confidence interval) |
虽然基因的存在可能并不意味着化合物已经产生, 但是基因数量的多少决定着化合物生成的潜在能力.自从2-MIB的生物合成路径与相关的合成基因在蓝藻体内被阐明以来, 不同的****试图探寻水中2-MIB合成基因(mic)与2-MIB的浓度的关联, 以期能够达到对2-MIB进行预警的作用.Wang等(2016)率先研究出了mic与2-MIB浓度之间的对数相关性, 并发现在实验室中培养的蓝藻中mic与2-MIB浓度之间的相关系数为0.799, 而在野外样品中其相关系数为0.723, 野外样品的相关性略低.Chiu等(2016)对台湾29个水库中mic与2-MIB浓度进行了调查, 无论水中的2-MIB处于低浓度水平或者高峰期(3.9~1715.5 ng · L-1), mic与2-MIB浓度之间均存在着较好的对数相关性(R2= 0.302~0.796).
课题组基于数年的调查数据进行汇总, 发现A水库中的mic基因拷贝数(6月均值)呈总体逐年上升趋势, 从2016年的2.17 × 105 copies · L-1升至2019年的1.54 × 108 copies · L-1, 同时2-MIB浓度也从2016年极值10.15 ng · L-1升至2019年的极值145 ng · L-1(图 5).
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 A水库2016—2019年间2-MIB基因拷贝数(夏季均值)趋势 Fig. 5Trend of 2-MIB gene copy number (summer average) in reservoir A from 2016 to 2019 |
4 结论(Conclusions)1) 开展了藻类产2-MIB基因mic的定量分析.实测上海水源水库中蓝藻产2-MIB基因.调研结果表明, 蓝藻产2-MIB基因无论在长江水源水库还是黄埔江水源水库中都有一定的检出.平时期间浓度约在105 copies · L-1左右, 夏季高峰期浓度高达107~108 copies · L-1.
2) 2-MIB合成基因拷贝数, 伪鱼腥藻细胞密度及2-MIB浓度的统计分析结果表明, 2-MIB基因拷贝数与蓝藻、伪鱼腥藻细胞密度、2-MIB浓度之间均存在较好的相关性.
3) 产嗅基因总量检测通过qPCR方法代替了繁琐、重现性低的显微镜数藻、看藻过程.但总的说来, qPCR方法仍是半定量手段, 需要结合其它指标改进准确度.沉积物中mic基因量的检测, 以及藻源性基因和放线菌基因的甄别检测, 还有许多工作要做.
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