, 成小英1,2,3
, 蒋俊4, 郭赟41. 江南大学环境与土木工程学院, 无锡 214122;
2. 江苏省厌氧生物技术重点实验室, 无锡 214122;
3. 江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215000;
4. 无锡市太湖湖泊治理股份有限公司, 无锡 214122
收稿日期: 2018-12-28; 修回日期: 2019-03-10; 录用日期: 2019-03-10
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项(No.2017ZX07203-005-07)
作者简介: 李晓丽(1993-), 女, E-mail:503384101@qq.com
通讯作者（责任作者）: 成小英(1977—), 女, 副教授, 硕士生导师, 主要研究方向为水体污染治理工程及其机理.E-mail:439174716@qq.com
摘要: 诺氟沙星作为一种常用的氟喹诺酮类抗生素，普遍存在于自然水体中，其输入会刺激水环境进而影响受污染水体的处理效果.为了探究诺氟沙星对反应器处理污染河水性能的影响，向反应器中投加不同浓度的诺氟沙星，研究反应器中NH4+-N、TN、TP和CODMn去除率及生物膜特性的变化.结果表明，不同浓度的诺氟沙星对反应器中污染物去除率的影响不同.诺氟沙星浓度为0.05 μg·L-1时，对NH4+-N、TN去除率的影响表现为先促进后抑制；随着诺氟沙星浓度的持续增加，对NH4+-N、TN去除率的影响更加显著（p < 0.05）.反应器TP的去除率随诺氟沙星添加浓度的不断增加而明显降低，且添加浓度越高下降趋势越明显（p < 0.05）.而诺氟沙星的存在对CODMn去除没有明显作用（p>0.05）.诺氟沙星的添加使生物膜VSS/TSS、TTC-脱氢酶活性降低，同时，微生物为进行自我保护分泌了大量EPS从而增加了蛋白和多糖含量.诺氟沙星的存在改变了生物膜EPS化学组分及化学含量，并且降低了生物膜物种多样性和丰富度.
关键词:诺氟沙星生物转盘去除率生物膜
Influence of norfloxacin on the performance of rotating biological contactor for the treatment of polluted river water
LI Xiaoli1,2,3
, CHENG Xiaoying1,2,3 , JIANG Jun4, GUO Yun4 1. School of Environment and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122;
2. Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Wuxi 214122;
3. Water Treatment Technology and Material Collaborative Innovation Center in Jiangsu Province, Suzhou 215000;
4. Wuxi Taihu Lake Restoration Co., Ltd, Wuxi 214122
Received 28 December 2018; received in revised from 10 March 2019; accepted 10 March 2019
Abstract: As a commonly used fluoroquinolone antibiotic, norfloxacin is ubiquitous in natural water, which could influence the treatment of contaminated water. In order to investigate how norfloxacin take effect on the treatment of polluted river water, different concentrations of norfloxacin were added to the reactor. The results show that different concentrations of norfloxacin had various effects on the removal rates of contaminants. When the concentration of norfloxacin was 0.05 μg·L-1, the removal rates of NH4+-N and TN were first promoted and then inhibited. With increasing norfloxacin concentrations, the removal rates of NH4+-N and TN were significantly affected(p < 0.05). The removal rates of TP in the reactor decreased significantly with the increasing of norfloxacin concentrations. Norfloxacin had no significant effects on CODMn removal (p>0.05). The addition of norfloxacin reduced the VSS/TSS and TTC-dehydrogenase activity of biofilm, indicating that the microorganisms secreted a large amount of EPS for self-protection to increase the proteoglycan content. Norfloxacin changed the chemical composition and content of EPS and reduced the diversity and richness of biofilm species.
Keywords: norfloxacinbiological rotating discremoval ratebiofilm
1 引言(Introduction)抗生素作为一类抗菌性药物被广泛用于预防和治疗人类和动物疾病(高立红等, 2013), 同时将其用于畜牧和水产养殖业中时, 能够促进动物生长.然而, 因抗生素不能被机体完全吸收, 从而导致其通过各种途径排入环境当中(李华瑞等, 2015).从近几年的研究来看, 地表水、地下水、饮用水、污泥、土壤和水生物体等环境介质中均有不同浓度的抗生素类药物检出(Amorim et al., 2014).抗生素检出浓度一般在ng·L-1~ μg·L-1水平(魏东斌等, 2011), 但有研究表明, 在北京清河水体中检测到喹诺酮类抗生素最高浓度达16952.5 ng·L-1(Zhang et al., 2015).抗生素能够在环境中长期赋存, 不仅对生态系统可能造成负面影响, 还会诱导抗生素抗性细菌和抗生素抗性基因的产生(Luo et al., 2011；Qiao et al., 2018).国内外已有研究在污水处理厂(Yang et al., 2013)和地表水(邹世春等, 2013)中检测到抗生素抗性基因的存在.实际上, 关于抗生素存在对水处理方面的影响也越来越受到研究者的关注.章洪涛(2015)研究了磺胺间甲氧嘧啶对SBBR处理猪场废水的影响, 发现磺胺间甲氧嘧啶无论浓度高低均会对污染物的去除产生抑制作用且呈无法恢复状态；邹高龙等(2019)研究了环丙沙星对污水生物处理的影响, 结果表明, 环丙沙星长期暴露会降低系统脱氮除磷效率.因此, 进行抗生素存在对污水处理过程影响的研究十分必要.
诺氟沙星(Norfloxacin, NOR)属于喹诺酮类抗生素, 能有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(郎印海等, 2018).研究表明, 50%~90%的NOR因不被吸收而通过粪便和尿液排入水环境中(张涵瑜等, 2016).中国抗生素药物市场2012结构报告显示检出的高质量浓度抗生素中, 氟喹诺酮类占将近80%, 说明氟喹诺酮类药物的局部残留浓度相对较高, 污染比较严重(杨常青等, 2012).而NOR是氟喹诺酮类中使用频率最高的一种抗生素, 由于日常的大量频繁性连续输入, 导致NOR在各类水体中表现为“假持久性”特征, 从而严重威胁到生态平衡和人类健康(柯润辉等, 2014).因此, 进行NOR对地表水净化过程的影响研究刻不容缓.
生物转盘作为一种高效的生物膜污水处理技术, 因具有结构简单、自动化程度高、安装维护便捷、运行费用低等优点(娄高彬等, 2015), 目前已被应用于污染物浓度较低的水体处理中(魏东洋等, 2013).例如, 王文东等(2016)将生物转盘与平流沉淀池相结合来处理微污染水体, 发现氨氮和总磷的去除效果较好.许雯佳等(2018)利用生物转盘处理污染河水, 结果表明, 出水氨氮和总磷浓度可以达到地表水Ⅰ、Ⅱ类水的标准.然而有关抗生素对地表水中污染物生物处理效果的影响研究还鲜见报道.
因此, 本研究将复合亲水性聚氨酯泡沫与生物盘片相结合, 利用自然河水实现反应器挂膜来处理污染河水, 考察不同NOR投加浓度对生物转盘反应器中污染物去除行为的影响, 并探究其对生物膜特性的影响及自身变化, 以期为NOR的环境风险评价及为治理环境中的NOR及其它抗菌药品带来的污染问题提供理论支持及科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 试验材料与装置反应器装置如图 1所示, 反应槽有效容积为9.8 L, 盘片直径为45 cm, 盘片之间间隔4 cm.本试验采用的填料为复合亲水性聚氨酯泡沫(宜兴市浩洋海绵制品有限公司), 为具有海绵特性的新型载体材料, 孔径为20 ppi, 孔隙率大于95%, 复合亲水性聚氨酯泡沫在盘片上均匀分布.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 反应器装置图 Fig. 1Reactor installation diagram |
2.2 试验挂膜启动用水水质反应器挂膜启动用水为江南大学校内河水, NH4+-N、TN、TP、CODMn分别为0.3~3.2、0.7~3.6、0.12~0.87、3.4~12.1 mg·L-1, 水质属于劣Ⅴ类水以上, DO为6.31~8.28 mg·L-1, 温度为18~24 ℃, pH呈近中性.诺氟沙星来自上海迈瑞尔化学技术有限公司, 为分析标准品.
2.3 水质指标检测方法水质分析中常规指标NH4+-N、TN、TP和CODMn的测定依据《水和废水监测方法》(第四版)(国家环保总局, 2002).
2.4 生物膜指标测量方法生物膜量采用烘箱法测定(Liu, 1997), 生物膜脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法测定(张金莲等, 2008)；胞外多聚物(EPS)采用NaCl提取法测定(杨春雪, 2015)；蛋白采用考马斯亮蓝法测定(Fr/Olund et al., 1995)；多糖采用蒽酮-硫酸比色法测定(Ludwig et al., 1956)；采用Hitachi F-7000荧光分光光度计对S-EPS、LB-EPS、TB-EPS进行三维荧光光谱扫描.
生物膜高通量测序：取试验4个稳定状态下的生物膜进行预处理；将预处理后的样品装入10 mL离心管中, 加入20%的甘油并保存在-70 ℃环境下；使用MP-soil试剂盒抽提DNA；对抽提完毕的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR), 并在相同浓度下收集4个PCR产物；在上海美吉生物医药科技有限公司测序平台进行测序.
2.5 反应器挂膜启动生物转盘盘片采用江南大学校内河水直接挂膜.挂膜与整个试验阶段, 生物转盘反应器水力停留时间为12 h, 转速为3 r·min-1, DO控制在4~8 mg·L-1, pH控制在7~8, 温度控制在25~28 ℃.定期监测进出水水质, 当反应器中出水水质基本达到稳定状态即为挂膜成功(魏东洋等, 2013).反应器挂膜成功后采用模拟配水进水.
2.6 试验阶段设置试验分为4个阶段, 每个阶段反应器连续运行30 d.第1阶段采用自然河水挂膜启动, 第2、3、4阶段采用模拟配水并加入NOR使其浓度控制在3个不同水平(0.05、5、500 μg·L-1).整个试验期间每天取样分析NH4+-N、TN、TP、CODMn的去除效果.4个阶段取样频率相同, 所取水样均现取现测, 如有延迟, 均避光保存于4 ℃冰箱内, 不超过2 d, 水样测定前经过0.45 μm的滤膜过滤.数据处理使用Origion制图软件和SPSS统计软件.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 诺氟沙星长期暴露对反应器水质指标去除效率的影响3.1.1 NOR对反应器NH4+-N去除率的影响试验结果表明, NOR长期暴露会抑制反应器对NH4+-N的去除, 且NOR浓度越高, 抑制作用越显著.如图 2a所示, 第1阶段生物填料挂膜稳定运行持续30 d, 挂膜启动前23 d, NH4+-N去除率呈波动上升趋势, 原因可能是开始时微生物处于适应期, 后期生物填料上负载有一定的微生物(许雯佳等, 2018)；23~30 d反应器开始稳定运行, NH4+-N平均去除率达到88.20%.随着NOR添加浓度的不断升高, 试验第2、3、4阶段的NH4+-N平均去除率依次降至83.64%、73.73%、58.86%.差异性分析显示, 不同浓度NOR暴露下, NH4+-N去除率存在显著差异(p < 0.05), 而第4阶段和第2、3阶段的去除率均存在极显著差异(p < 0.01).第2阶段添加0.05 μg·L-1 NOR, 前5 d的NH4+-N去除率有所提高, 原因可能是少量NOR可以激发生物膜中功能性微生物分泌更多的胞外聚合物(EPS), 从而提高自身活性(杨涛等, 2018).Oosterhof等(2003)曾提到EPS能保障微生物免受进水环境不断变化的冲击, 同时可以缓冲周围环境的酸碱变化.5 d后NH4+-N去除率缓慢下降, 表明NOR暴露时间增长, 微生物活性最终受到抑制(Chao et al., 2015), 这可能与硝化细菌比较敏感的生化条件有关.第3、4阶段NOR浓度分别增加至5 μg·L-1和500 μg·L-1, NH4+-N去除率均快速下降, 第4阶段NH4+-N浓度下降更快且达到稳定之后波动比前两个阶段明显.这可能有3个方面的原因：第一, 水中微生物稳定性较差, NOR浓度变化较大, 微生物易受环境变化影响；第二, NOR浓度升高对微生物的毒害作用增强, 超过了微生物的抵御能力范围；第三, NOR浓度提高对反应系统环境也有相应影响, 导致反应器稳定性受到干扰.此外, NOR浓度升高后NH4+-N去除率波动明显加大与硝化细菌较之异养菌更为敏感有关(朱洁等, 2012).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 不同浓度NOR对氨氮(a)、总氮(b)、总磷(c)和CODMn(d)去除率的影响 Fig. 2Effect of NOR on removal rates of NH4+-N(a), TN(b), TP(c) and CODMn(d) |
3.1.2 NOR对反应器TN去除率的影响如图 2b所示, 随着NOR浓度从0 μg·L-1增加至500 μg·L-1, 反应器的TN去除率均出现一定程度的下降.第1阶段挂膜启动运行前23 d, TN去除率处于波动上升状态, 原因可能是前15 d硝化细菌和反硝化细菌需要一定的时间适应环境而生长缓慢, 15~23 d期间二者开始适应生存条件并大量繁殖.23 d后反应器达到稳定状态并持续运行, TN平均去除率为71.74%, 但去除效率并不是很高, 原因可能是缺乏有机碳化合物作为电子供体(Xia et al., 2008).接下来投加NOR, 试验第2、3、4阶段的TN平均去除率分别降至67.48%、61.01%、53.11%.SPSS差异性分析结果显示, 不同浓度NOR存在下, TN去除率均存在显著差异(p < 0.05), 第4阶段的去除率与第2阶段存在极显著差异(p < 0.01).第2阶段投加0.05 μg·L-1 NOR, 前期TN去除率略有上升, 分析原因可能是反硝化菌的作用滞后而导致由硝化菌转化得到的NO3--N有一定积累.随后TN去除率开始缓慢下降, 到42 d基本达到稳定, 之后在小范围内波动变化, 原因可能是功能性微生物受到NOR的毒害作用, 导致微生物活性降低.第3、4阶段将NOR浓度增大至5 μg·L-1和500 μg·L-1, 反应器前期, TN去除率均直接下降之后呈稳定波动变化, 且第4阶段下降幅度更大.有3个可能的解释：①NOR浓度增大到一定程度会使微生物死亡并从填料上面脱落, 而河水中的有机组分低且微生物含量少, 从而导致新生生物膜形成需要更多时间；②硝化细菌生化条件较为敏感, 硝化速率减缓；③可能是反应系统碳源不足, 异养菌与反硝化菌争夺生存空间导致反硝化菌生长受到抑制.观察可得, 4个阶段TN的去除变化趋势与NH4+-N极为相似, 这与河水中氮的存在形式主要为NH4+-N有关.
3.1.3 NOR对反应器TP去除率的影响试验连续进行4个阶段, 出水TP去除率变化如图 2c所示, 可以看出, NOR对TP去除率呈现“浓度-效应”关系.不同浓度NOR存在对TP去除率均有抑制作用, 且暴露浓度升高, 抑制作用增强.因此, 与含氮污染物相比, TP的去除更易受NOR的影响.第1阶段反应器运行初期前13 d左右, TP去除率较低, 平均去除率只有11.55%, 原因可能是：①进水中有机物组分少且水质浓度不稳定；②挂膜启动前期生物膜还未形成, 且聚磷菌等除磷微生物的生长繁殖需要一定时间.14~21 d时TP去除率快速上升并达到81.16%, 主要原因可能是：①复合亲水性聚氨酯泡沫对磷有物理吸附作用；②填料上负载有一定的微生物, 微生物自身分泌的EPS对磷也有吸附作用；③聚磷菌适应环境后大量繁殖, 从而使TP的去除效率提高.22 d后反应器稳定运行, TP平均去除率为80.58%.第31 d进水中开始投加NOR, TP平均去除率分别降为68.47%、57.31%、41.14%.SPSS差异性分析显示, 第4阶段分别与第2、3阶段的TP去除率存在极显著差异(p < 0.01), 而第2、3阶段的TP去除率存在显著差异(p < 0.05).由图 2c可知, 反应器添加NOR之后的3个阶段, TP去除率均有所降低且之后处于稳定波动状态.随着NOR浓度升高, TP去除率降低幅度增大, 同时稳定之后波动程度也加强.原因可能是:①物理吸附不稳定, 磷易于脱附重新回到反应器中(宋东等, 2015), 同时部分生物膜受生物转盘转动的冲击作用而脱落, 影响到生物膜中EPS对TP的吸附；②聚磷菌活性受NOR的抑制作用, 部分除磷微生物被杀死, 细胞水解可能会释放出大量的磷(Chao et al., 2015)；③碳源是聚磷菌生长的主要限制因素, 其他耐药性强的异养菌利用碳源大量繁殖, 聚磷菌生长缺乏必要的能源物质而受到限制(李一兵等, 2017), 所以时间越长, TP去除率下降越快. Zumft等(1997)研究指出, PHA和糖原的代谢与生物除磷过程密切相关.NOR暴露可能降低PHA消耗, 抑制糖原补充, 从而抑制聚磷菌(PAOs)和聚糖菌(GAOs)的活性.
3.1.4 反应器CODMn去除率的影响由图 2d可得, 一定浓度NOR长期暴露于反应器中, CODMn的去除率并未受到很大程度抑制.挂膜启动阶段(0~15 d), CODMn去除率在较大幅度波动中上升, 原因可能是该时期为适应期, 微生物菌群不稳定且进水浓度波动较大.15~20 d时系统微生物进入快速增长期并大量消耗碳源, 因此, CODMn去除率快速上升.20 d后CODMn去除率达到稳定状态, 表明生物填料已挂膜成功.第2阶段加入0.05 μg·L-1 NOR, 前8 d左右, CODMn略有下降, 下降幅度约为2.21%, 可能原因是外界环境突然变化对微生物生长产生了影响.之后去除率迅速回升并稳定, 可能由于微生物自身具有防御机制并已适应低浓度NOR的存在, 生长代谢活动不再受限.第3阶段加入5 μg·L-1 NOR后, 前10 d左右高锰酸盐去除率小幅下降, 10 d后去除率有所回升但未恢复到之前的数值, 原因是NOR浓度提高, 与污染物去除相关的功能性微生物均受到不同程度的不利影响, 从而其生长繁殖速度减慢, 自身代谢活动减弱, 对碳源的利用率下降.第4阶段NOR浓度提高到500 μg·L-1, CODMn去除率较之前的下降速率加快, 下降幅度变大, 到12 d左右去除率基本稳定, 原因是较高浓度的NOR存在对各微生物的毒害性增强, 因此, 微生物被大量杀死, 水体中的碳源无法被利用.不同浓度NOR存在的3个阶段, CODMn平均去除率分别为76.84%、75.64%、71.21%.差异性分析显示, 3个阶段CODMn去除率均无显著差异(p>0.05).原因可能是去除率下降与NOR具有一定的杀菌作用有关, 其次可能是因为生物膜随转盘转动会不定时地部分脱落并随出水排出系统, 但下降幅度很小, 尤其是前两个阶段可能是由于系统中有一部分耐药性较强的异养菌仍能利用碳源进行正常的代谢生长.CODMn去除的变化趋势与NH4+-N去除的变化趋势进一步吻合.
3.1.5 反应器中诺氟沙星(NOR)的浓度变化表 1为各污染物达到稳定状态时反应器进出水中NOR的浓度.由表 1可知, NOR进水浓度分别为0.05、5、500 μg·L-1时, 生物转盘反应器出水浓度分别为0.032、1.977、230.271 μg·L-1, 可见生物转盘反应器对NOR有一定的去除作用, 去除率分别为36.00%、60.46%、53.95%.原因可能是生物膜对NOR有一定的吸附作用, 此外, 反应器中存在与NOR降解有关的微生物.
表 1(Table 1)
| 表 1 NOR进出水浓度变化 Table 1 Variation of NOR concentration in inlet and outlet water | ||||||||||||
表 1 NOR进出水浓度变化 Table 1 Variation of NOR concentration in inlet and outlet water
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3.2 诺氟沙星投加浓度对生物膜的影响3.2.1 生物膜活性及蛋白(PN)和多糖(PS)分析不同浓度NOR存在下生物膜特性如表 2所示, 可以看出, 随着NOR浓度的增加, 生物膜特性均呈下降趋势, 尤其当NOR浓度为500 μg·L-1时, 生物膜VSS/TSS比值从38.41%降到28.67%, TTC-脱氢酶活性从(1.28±0.08) μg·mL-1· h-1降到(0.62±0.04) μg·mL-1· h-1, 下降最为明显(p < 0.05).这表明NOR浓度为500 μg·L-1时, 生物膜活性较差, 这也与NH4+-N、TP去除率在500 μg·L-1时较低相一致.TTC-脱氢酶是代表微生物活性敏感度的指标之一, TTC-脱氢酶活性在NOR浓度为0.05 μg·L-1时亦下降约0.12 μg·mL-1·h-1, 可见即使是痕量NOR的存在也对微生物活性有一定的抑制作用, 从而说明低浓度NOR存在对水环境中微生物等的毒害作用不容忽视.NOR浓度升高, VSS/TSS比值逐渐减小的可能原因是：①河水中污染物浓度低, 生物膜易受周遭环境影响；②填料负载微生物受NOR毒害, 使得微生物数量减少, 从而有机物比例下降.
表 2(Table 2)
| 表 2 不同浓度NOR存在下生物膜的特性 Table 2 Characteristics of biofilms in the presence of different concentrations of NOR | |||||||||||||||||||||||||
表 2 不同浓度NOR存在下生物膜的特性 Table 2 Characteristics of biofilms in the presence of different concentrations of NOR
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EPS是由微生物产生的复杂有机聚合物, 但主要成分为蛋白和多糖, 它们占EPS总量的70%~80%, 其余含少量脂类、腐殖质和氨基酸等(Wang et al., 2016).EPS可分为溶解性EPS(S-EPS)(Nielsen et al., 1997)、松散附着的EPS(LB-EPS)和紧密结合的EPS(TB-EPS)(Ramesh et al., 2006).据报道, 在有毒条件下, 微生物产生EPS作为细胞壁和极端环境之间的扩散屏障(Yang et al., 2016).如图 3可知, 随着NOR浓度的增加, 生物膜EPS组分中PN、PS的含量及PN与PS的比值(PN/PS)均发生显著变化(p < 0.05), 且随NOR浓度不断升高, EPS组分中PN、PS和PN/PS比值均不断增加, 表明NOR对微生物有毒害作用, 导致各微生物细菌分泌更多的EPS以保护细胞免受外界恶劣环境影响.随着NOR浓度从0 μg·L-1升高至500 μg·L-1, S-EPS中PN含量从12.12 mg·g-1(以VSS计，下同)增加到71.41 mg·g-1, PS含量从21.52 mg·g-1(以VSS计，下同)增加到48.72 mg·g-1, PN/PS比值从0.56增加至1.47(图 3a)；LB-EPS中PN含量从33.26 mg·g-1增加到118.76 mg·g-1, PS含量从49.69 mg·g-1增加到84.46 mg·g-1, PN/PS比值从0.67增加至1.41(图 3b)；TB-EPS中PN含量从67.18 mg·g-1增加到231.29 mg·g-1, PS含量从82.62 mg·g-1增加到142.08 mg·g-1, PN/PS比值从0.81增加至1.63(图 3c).由此可知, 微生物可以分泌EPS进行自我保护, 从而使PN和PS含量明显增加.同时, PN的增加量比PS更明显, 导致PN/PS比值在EPS三组分中均不断升高, 表明微生物更倾向于分泌蛋白进行自我保护, 此结果与Kong等(2017)的研究结果一致.另外, 随着NOR浓度升高, PN/PS的斜率也不断增大, 尤其是浓度达到500 μg·L-1时, EPS三组分中PN/PS斜率均增大.这一方面是因为后期NOR浓度增加, 诱导细胞死亡及细胞碎片水解, 从而导致反应器中PS和PN积累(Chao et al., 2015)；另一方面是由于NOR侵害, 少部分微生物加速内源性呼吸, 并伴随释放有机细胞成分.图 3b显示, NOR浓度为5 μg·L-1时, LB-EPS中PN和PS含量的增幅较小, PN/PS比值略有下降, 推测原因可能是：①LB-EPS位于S-EPS与TB-EPS之间, 是一种松散附着的EPS, 它与S-EPS一样较易脱落到反应器中；②反应器生物膜较薄, LB-EPS转型成为S-EPS, 这与NOR浓度为5 μg·L-1时S-EPS中PN和PS增量显著且PN/PS比值增大、斜率亦增大相一致.总体而言, NOR的存在对生物膜PN和PS含量影响显著, 这一结果与反应器水质指标去除率变化原因的猜想相吻合.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 生物膜各组分EPS中PN、PS含量及PN/PS(a.S-EPS, b. LB-EPS, c. TB-EPS) Fig. 3PN, PS content and PN/PS in biofilm EPS(a.S-EPS, b.LB-EPS, c.TB-EPS) |
3.2.2 EPS三维荧光光谱分析3D-EEM荧光光谱法是表征EPS化学成分的有效方法(Sheng et al., 2006).依据文献(Jian et al., 2016)将三维荧光区域进行如下划分：Ⅰ为芳香族蛋白质Ⅰ, Ⅱ为芳香族蛋白质Ⅱ, Ⅲ为富里酸, Ⅳ为溶解性微生物产物, Ⅴ为类腐殖酸.如图 4所示, 图 4a~4c为未添加NOR生物膜EPS三组分的三维荧光图.由图可知, S-EPS、LB-EPS、TB-EPS扫描图中均出现了相同的两个主要峰, 即peak A和peak B, peak A位于三维荧光区域Ⅳ, 与溶解性微生物产物有关, 且EPS三组分荧光强度分别为194.5、318.7、443.8；peak B位于三维荧光区域Ⅱ, 与芳香族蛋白质Ⅱ有关, EPS三组分荧光强度分别为130.7、202.8、298.5.它们的荧光强度均呈增强趋势, 表明靠近生物膜内层的EPS更稳定, 浓度更高.图 4d~4f为NOR浓度为0.05 μg·L-1时的三维荧光图, S-EPS、LB-EPS、TB-EPS扫描图中同样出现了两个主要峰peak A和peak B, 荧光强度比第1阶段较大, 呈明显上升趋势, 表明NOR的存在会促进微生物分泌EPS.但S-EPS中出现了次要峰peak C, 此峰位于荧光区域Ⅴ, 与类腐殖酸有关, 且在LB-EPS和TB-EPS中未观察到.结果表明, 低浓度的NOR已经对外层生物膜产生毒害作用, 并对内层生物膜产生生物刺激作用从而加速微生物代谢活动.图 4g~4i为添加5 μg·L-1 NOR时的三维荧光图, 观察可得, EPS三组分荧光图中除了出现peak A与peak B之外, 还均出现了与类腐殖酸相关的peak D, 且荧光强度不断增强, TB-EPS中还出现了与类腐殖酸有关的peak C.由此可得, NOR浓度的进一步增加会导致生物膜EPS化学组分发生一定变化.图 4j~4l为NOR浓度增加至500 μg·L-1时的三维荧光图, 可以明显看出, 生物膜EPS化学组分发生了显著改变.S-EPS中出现的4个峰(peak A、peak B、peak C和peak D)与之前扫描图中的峰位置一致, 且荧光强度明显增强.LB-EPS中出现了5个峰, 且新出现的peak E位于荧光区域Ⅰ, 与芳香族蛋白质Ⅰ有关, 但不是主要峰, Peak A和peak B的荧光强度逐渐减弱, peak C和peak D的荧光强度明显加强.TB-EPS扫描图中, peak B、peak E消失, peak A的荧光强度只有111.7, 而peak C和peak D的荧光强度进一步增强, 类腐殖酸荧光峰开始成为主要峰.这一系列变化表明, NOR浓度增大导致微生物不断死亡.由上可知, NOR的存在对EPS化学组成及各组分含量均有显著影响.随着NOR浓度不断增加, 前期微生物不断分泌EPS进行自我保护, 因此, 芳香族蛋白类物质与溶解性微生物产物为EPS中的主要成分, 后期EPS不断增加的同时伴随出现少量类腐殖酸物质, 一直到类腐殖酸物质成为EPS的主要成分.此结果与之前生物膜蛋白和多糖研究结果相一致.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 不同浓度NOR存在下生物膜各组分EPS(S-EPS、LB-EPS、TB-EPS)三维荧光图(a~c.未添加NOR, d~f.添加0.05 μg·L-1 NOR, g~i.添加5 μg·L-1 NOR, j~l.添加500 μg·L-1 NOR) Fig. 4Three-dimensional fluorescence diagrams of EPS (S-EPS, LB-EPS, TB-EPS) components in the presence of different concentrations of NOR |
3.3 不同浓度诺氟沙星对微生物多样性的影响表 3为不同浓度NOR下微生物多样性统计结果.由表可知, 随NOR浓度的增加, 生物膜微生物多样性明显降低.从OTU数量来看, 由第1阶段(485)到第4阶段(332)显著降低, 结果表明, NOR可降低微生物物种的种群数量.Ace和Chao指数可反映微生物的物种丰富度, Shannon和Simpson指数可揭示微生物的物种多样性(He et al., 2016).Ace和Chao指数均呈下降趋势, 表明NOR的存在降低了生物膜的物种丰富度.Shannon和Simpson指数大体呈下降趋势, 但Simpson指数在NOR浓度为0.05 μg·L-1时有所增加, 可能原因是痕量NOR的存在促进了某些劣势种微生物的生长, 从而增加了物种多样性.此结果与CODMn去除率在第4阶段有所下降相一致.
表 3(Table 3)
| 表 3 生物膜多样性统计结果 Table 3 Statistical results of biofilm diversity | ||||||||||||||||||||||||||||||
表 3 生物膜多样性统计结果 Table 3 Statistical results of biofilm diversity
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4 结论(Conclusions)1) 不同浓度诺氟沙星对反应器污染物去除率的影响各不相同.诺氟沙星浓度为0.05 μg·L-1时, 前期对NH4+-N、TN去除率有促进作用, 之后去除率下降并达到稳定状态；当诺氟沙星浓度增加至5 μg·L-1和500 μg·L-1时, NH4+-N、TN去除率呈下降趋势, 且诺氟沙星浓度越高, 下降趋势越明显.不同浓度诺氟沙星暴露下, 反应器的TP去除率存在显著差异(p < 0.05), CODMn去除率不存在显著性差异(p>0.05).反应器对NOR有一定的降解作用.
2) 诺氟沙星可使生物膜VSS/TSS、TTC-脱氢酶活性均有所降低.随着诺氟沙星浓度增加, 生物膜蛋白、多糖含量均明显增加(p < 0.05), 且蛋白增量更为显著.
3) 诺氟沙星改变了生物膜EPS化学组分及化学含量.诺氟沙星浓度低于5 μg·L-1时, 生物膜EPS三维荧光图中芳香类蛋白Ⅱ和溶解性微生物代谢产物为主要代表峰, 当诺氟沙星浓度大于5 μg·L-1时, 类腐殖酸成为三维荧光图中的主要峰.
4) 诺氟沙星可降低微生物的物种多样性和丰富度.随着诺氟沙星浓度增加, OTU数量逐渐减少, Ace指数、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数均呈下降趋势.
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