, 陈建文, 刘勇
, 张红, 李君剑山西大学黄土高原研究所, 太原 030000
收稿日期: 2019-01-10; 修回日期: 2019-02-21; 录用日期: 2019-02-21
基金项目: 国家自然科学基金项目(No.41771548);山西省1331工程土壤修复学科群项目(No.20181401)
作者简介: 师碧玲(1995-), 女, E-mail:892380785@qq.com
通讯作者（责任作者）: 刘勇, E-mail:liuyong@sxu.edu.cn
摘要: 重金属污染的长期存在，使环境中的微生物保持并不断强化其自身重金属抗性.为了研究长期污染场地重金属污染水平和土壤中微生物重金属抗性之间的关系，本文以山西省灵丘县刁泉铜矿尾矿库区及其周边为研究对象，研究了不同立地条件下土壤重金属含量特征以及重金属抗性基因的丰度与分布，采用Hakanson潜在生态风险指数法对该区域的生态环境风险进行了评估，并对重金属及重金属抗性基因进行相关分析.结果表明：①研究区土壤重金属污染严重，7种重金属Cr、Ni、Zn、As、Cd、Cu、Pb含量均超过山西土壤背景值，单因子潜在生态危害程度顺序基本上为Cd > Pb > Cu > As > Ni > Zn > Cr.②尾矿库区存在不同程度的生态危害，尾矿坝、草地属于很强生态危害，林地、农田处于强生态危害，不同样地间的潜在生态风险顺序为草地>尾矿坝>农田>林地.③相对丰度较高的重金属抗性基因主要是针对Cu、As的抗性，针对Cu抗性以cop基因为主，针对As抗性以ars基因为主.④除copA基因与重金属之间存在显著相关性外，其他重金属抗性基因与重金属含量之间的相关性不显著.
关键词:铜尾矿重金属重金属抗性基因生态风险
Spatial distribution of heavy metal and the microbial metal-resistance genes in copper tailing
SHI Biling
, CHEN Jianwen, LIU Yong , ZHANG Hong, LI Junjian Institute of Loess Plateau, Shanxi University, Taiyuan 030000
Received 10 January 2019; received in revised from 21 February 2019; accepted 21 February 2019
Abstract: Heavy metal tolerance in environmental microbes can be gradually reinforced under the long term exposure of heavy metals. In order to detect the association between metal-resistance of soil microbe and the level of heavy metal contamination in the long term exposure at Diaoquan Copper tailing dam area in the North of Shanxi Province, study was carried out to investigate the characteristics of heavy metal contents and related abundances and distributions of the metal-resistance genes, evaluate ecological environment risk based on Hakanson method, and analyze the correlations of the metal-resistance genes. The results show that:①The contents of Cr, Ni, Zn, As, Cd, Cu and Pb all exceed the soil background values recorded in Shanxi province, and the ecological hazard risk of single factor index was in the following order:Cd > Pb > Cu > As > Ni > Zn > Cr; ②The ecological risk levels in the soils with different land use appeared also distinct:tailing dam and grassland were at the very strong ecological risks, and woodland and farmland were at also strong ones, of which the risk levels were as the following order:grassland > tailing dam > farmland > woodland; ③The resistant genes cop to Cu and the resistant genes ars to As were respectively detected to have the significantly higher abundances in this area; ④The significant correlations were only found between copA genes and all the detected heavy metals, however, no any significantly correlations between other metal resistant genes and metals were found in this study.
Keywords: copper tailingheavy metalheavy metalresistance genesecological risk
1 引言(introduction)土壤重金属污染是土壤健康和生产力下降的重要原因之一, 土壤中过量的重金属会对生态环境、动植物以及人类健康构成威胁, 而矿井的开采, 特别是金属矿石的开采, 是土壤重金属污染的一大来源(J?rup, 2003).矿产资源的开采会产生一系列不能人为利用的尾矿、废液、废渣、废气等.针对这些污染废料的处理, 常见的处理方式就是建立尾矿库, 对这些污染废料进行堆积贮存, 在占用大量土地资源, 如耕地、林地等的同时, 其中的有害物质也会迁移至大气、土壤、地下水体中, 对周围生态环境造成严重的破坏, 对尾矿区附近植物、动物、微生物甚至人类的生存造成威胁(龙健等, 2004).
微生物在重金属污染的土壤中, 具有很强的适应能力和生存能力.在重金属的胁迫下, 复杂的微生物群落中重金属抗性基因(Heavy metal resistance gene, MRGs)的出现, 揭示了微生物必要的生物过程以及在极端环境条件下微生物的生存策略(Zhang et al., 2018).为了应对污染环境带来的生存威胁, 微生物具有各种抗性机制, 如外排泵介导的金属运输, 通过渗透屏障产生的金属排斥, 细胞内和细胞外对重金属的转化以及酶解毒等方式, 这使得微生物可以通过增加调控这些抗性机制的基因来扩大其在重金属污染土壤中的生态位(Bouskill et al., 2007;Denef et al., 2010).然而, 到目前为止, 很少有研究探索MRGs在铜尾矿区的分布特征及其在生态环境中担当了一个什么样的角色.
本研究选取山西省灵丘县刁泉矿的铜尾矿库区为研究区域, 该区域有长期的开采历史和尾矿堆存历史, 通过对土壤中重金属的含量及微生物重金属抗性基因丰度进行分析测定, 探讨不同植被类型下土壤重金属的分布特征、微生物重金属抗性基因的分布特征以及二者的相关关系, 旨在阐明长期开采历史下的铜尾矿区土壤重金属的污染现状及土壤微生物重金属抗性基因的分布规律, 为铜尾矿区土壤重金属污染的修复提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 研究区概况山西省灵丘县是我国金属矿资源丰富的地区, 灵丘县的铜矿、银矿、锰矿储量大, 品位高, 分布集中.灵丘县刁泉矿区位于刁泉村西南, 是1个以铜为主, 铁、金、银综合金属铜银矿床, 在明、清年间就有该矿的开采记录, 直至2012年, 该矿停止作业, 至今已停采5~6年.刁泉矿区停止开采后, 铜尾矿库为废弃状态, 周边分布有白桦、沙棘、铁杆蒿等植被及少量农田.
2.2 样品采集在2015年8月在刁泉矿区铜尾矿库进行土壤采样(东经114°49′~114°50′, 北纬39°53′~39°54′).为了研究铜尾矿库下游不同立地条件下的土壤重金属污染现状及土壤重金属抗性基因的分布特征, 本研究在铜尾矿库分别设置了尾矿核心区、乔木区、草本区、农田区4个样地, 分别命名为尾矿坝、林地、草地、农田, 采样点分布见图 1.尾矿核心区、乔木区、草本区、农田区4个样地的面积约为13000、12000、10000、6800 m2, 其中乔木区、草本区、农田区距离尾矿核心区的距离约为350、300、550 m.4个样地的土地利用类型、植被类型如表 1所示.因地势不平整, 采样区内采用蛇形采样的方法, 分别在每个样地设置6个采样点, 采集半径5 m范围内5~10个表层土壤样品(0~20 cm), 然后合并混匀为1个1 kg独立样品, 总共得到24份土样, 分别编号并保存于塑封袋中, 送回实验室待测.样品剔除植物残体等杂物后, 过2 mm筛后充分混匀, 分为3部分：1份分出10 g左右储存在-80 ℃用于分子生物学分析；1份分出50 g左右储存于4 ℃用于微生物筛选及其他分析；其余部分避光自然风干用于理化性质的分析.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 采样点分布示意图 Fig. 1Map of sampling sites |
表 1(Table 1)
| 表 1 土壤样品采样信息 Table 1 Soil sampling plots information | |||||||||||||||||||||||||
表 1 土壤样品采样信息 Table 1 Soil sampling plots information
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2.3 分析测样方法2.3.1 土壤理化性质的测定称取风干土壤样品100 mg, 过2 mm筛, 锡箔纸包样后用元素分析仪(Vario MACRO cube, 德国ELEMEALAR公司)测定土壤中总碳(TC)、总氮(TN)、总硫(TS)的含量；称取土壤样品5 g, 以水土比5:1浸提, 选用HI 3221pH计(Italy)测定土壤pH值.
2.3.2 土壤中重金属含量的测定称取土壤样品0.5 g, 浓硝酸-浓盐酸-氢氟酸-高氯酸消解后, 采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定土壤中重金属总量.
2.3.3 重金属抗性基因的检测及其定量分析称取0.3 g新鲜土壤样品, 使用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)提取基因组, 利用多功能读板机Infinite 200 PRO (TECAN, Sweden)测定土壤样品中DNA浓度和纯度.-20 ℃保存待用.本实验选择了14种常见的MRGs(copA、czcC、czcD、nccA、pbrT、chrB、pco(A)、pco(C)、pco(D)、arsB、arsC、czcA、copA1、copB)进行HT-QPCR检测, 这些MRGs在HT-QPCR检测中所用引物序列、目标基因片段大小及退火温度主要依据于已发表的文献(Nies et al., 1990; Lee et al., 2002;Bouskill et al., 2007;Roosa et al., 2014), 详细引物序列及分类见表 2.
表 2(Table 2)
| 表 2 目标基因及引物序列 Table 2 Target genes and primer sequences used in this study | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 目标基因及引物序列 Table 2 Target genes and primer sequences used in this study
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2.4 重金属风险评价方法本研究选择潜在生态危害指数法来简单评价刁泉铜尾矿区污染现状.潜在生态危害指数法是瑞典科学家Hakanson在20世纪90年代提出的, 基于重金属在表层沉积物中的含量、种类、重金属的毒性水平以及环境对重金属的响应机制, 从沉积学角度提出来的对土壤或沉积物中重金属污染进行评价的方法(Hakanson, 1980).其公式为:
 | (1) |
表 3(Table 3)
| 表 3 Eri和RI的分级标准 Table 3 Grade standards of Eri and RI | ||||||||||||||||||
表 3 Eri和RI的分级标准 Table 3 Grade standards of Eri and RI
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2.5 统计分析采用描述统计(descriptive)分析土壤理化性质和重金属含量特征, 采用单因素方差分析(ANOVA)比较不同样区之间土壤重金属的含量、重金属抗性基因的丰度等, 采用Pearson相关分析确定重金属、MRGs的丰度、土壤理化性质以及RI之间的相关性.数据分析和处理利用IBM SPSS Statistics、SigmaPlot 14.0及Rstudio等完成.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 土壤理化性质和重金属含量分析各样点之间土壤pH值无显著差异, 土壤中总碳、总氮、总硫的含量存在显著差异；在4个样点之中, 林地土壤碳含量、氮含量、硫含量达到了最大值(表 4).由于矿山废弃物造成的土壤破坏, 土壤中的有机物含量减少, 但植被的覆盖会明显改变土壤中有机质含量(WEST, 2002).本研究中林地土壤中的有机质含量最高, 且显著高于其他样点, 说明植物的存在有利于有机质的积累, 且灌木与草本的根系远没有乔木发达, 所以就有机质的积累能力而言, 乔木林地更有优势(杨丽霞等, 2014).
表 4(Table 4)
| 表 4 土壤理化性质与重金属含量 Table 4 Soil physical and chemical properties and heavy metal contents | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 4 土壤理化性质与重金属含量 Table 4 Soil physical and chemical properties and heavy metal contents
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土壤样品中除Pb之外的其他被测重金属含量在各样点存在显著差异(表 4).重金属As、Cd、Cu、Zn均在草地达到含量的最高值, 最大含量分别为108.14、3.81、1528.57、96.86 mg·kg-1.造成这一现象的原因是由于草地是紧邻尾矿坝下游的样地, 停矿后, 土壤中的重金属改变了其迁移速率, 使这些重金属没有继续向下游迁移, 且草本植物具有生长周期短, 能够更好的适应极端环境等特点, 对于重金属有一定的富集作用(时宇等, 2018), 导致这些重金属在样点草地大量累积, 造成样点草地土壤中As、Cd、Cu、Zn的含量要显著高于尾矿核心区尾矿坝.与《土壤环境质量标准》中规定的三级标准相比, 尾矿区Cr、Ni、Zn未超过三级标准, As、Cd、Cu、Pb分别是三级标准的1.69倍、1.54倍、1.57倍、1.93倍.各样点7种重金属含量均超过山西省土壤背景值, 超标率均超过100%.重金属在土壤中累积总量的顺序为草地＞尾矿坝>农田＞林地.在土壤中积累的重金属元素中, Cu, Pb含量很高, 占主导地位.重金属含量会随着土地利用方式的不同而变化, 尾矿坝、草地的重金属累积量明显高于林地、农田, 说明人为采矿活动会加剧土壤中重金属污染程度.
3.2 土壤重金属潜在风险评价采用Hankson潜在生态危害指数评估研究区土壤重金属污染现状.刁泉铜尾矿库区各样点污染生态潜在生态危害系数特征值在457.42~1880.96, 平均值为1000.71, 其数值高于600, 属于很强生态危害(图 2).其中尾矿坝、草地的RI高于600, 属于很强生态危害；林地、农田的RI高于300但小于600, 属于强生态危害.各样点之间的潜在生态风险指数顺序为草地＞尾矿坝＞农田＞林地, 这与重金属的累积趋势是一致的.铜尾矿区土壤中, 7种重金属的单因子潜在生态危害程度顺序基本上为Cd＞Pb＞Cu＞As＞Ni＞Zn＞Cr.Cd的单因子潜在风险参数最高, 平均值达到了1121.88.重金属潜在生态危害程度顺序表明, 对研究区域土壤健康造成严重威胁的重金属是Cd, 这与很多研究中表明的在矿区土壤中对RI值贡献最大的重金属是Cd的结果相一致(王志楼等, 2010;康宏宇等, 2016;阿吉古丽·马木提等, 2017), 说明在矿区重金属污染中, Cd带来的生态危害应该引起人们的关注.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 潜在生态风险指数 Fig. 2Potential ecological risk |
3.3 土壤重金属抗性基因丰度特征刁泉矿区土壤中检出的微生物MRGs有9种(图 3a), 其中arsC、arsB是与As抗性相关的MRGs；copA1、copA、pco(A)是与Cu抗性相关的MRGs；chrB是与Cr抗性相关的MRGs；czcC是与Zn、Cd抗性相关的MRGs；nccA是与Ni抗性相关的MRGs；pbrT是与Pb抗性相关的MRGs.重金属抗性基因表征了土壤微生物对重金属抗性的遗传能力, 就MGRs丰度而言, 相对丰度最高的抗性基因是针对Cu、As的抗性, 分别为copA、arsC.copA基因丰度所占的比例最大, 占MRGs总丰度的45.51%, copA在各样点之间存在显著差异, 草地中copA的相对丰度最高；其次是arsC, 占MRGs总丰度的20.06%, 各样点之间分布差异不显著.其中nccA在尾矿坝无检出；czcC在草地无检出.16S rRNA的丰度在各样点之间存在显著差异(图 3b), 16S rRNA的丰度表现为农田>林地>草地>尾矿坝, 在重金属污染严重的尾矿坝、草地土壤中16S rRNA的丰度要明显低于林地、农田土壤中16S rRNA的丰度, 且在无植被覆盖的尾矿坝区, 土壤中16S rRNA的丰度最低.随着人为活动加剧, 土壤中16S rRNA的丰度呈递减趋势.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 MRGs与16S rRNA的分布 (注：数值为多个重复的平均值, 竖线显示的是标准偏差, 相同字母表明各样点之间差异不显著(p >0.05)) Fig. 3Distribution of MRGs and 16S rRNA |
各重金属抗性基因在不同样地之间的丰度模式是不同的(图 4).arsC的相对丰度在样点之间分布均匀, 各样点之间没有差异；arsB的相对丰度样点之间差异性显著, 在样地尾矿坝, arsB的相对丰度达到最大值.chrB的相对丰度在各样点之间存在显著差异, 在样点尾矿坝无检出, 在样点林地达到最大值.copA1在各样点之间存在不显著差异(p=0.044), 样点林地copA1的相对丰度最低.copA在各样点之间存在显著差异, 在样点草地相对丰度达到最大值.由于样点草地中Cu浓度最高, copA也同样在样点草地中表现出比其他区域更大的丰度.同样与Cu抗性相关的CopA1、pco(A)在各样点也均有检出, 但这2种基因丰度低于copA的丰度, 这说明在土壤中有高浓度的Cu存在时, 微生物会选择优先表达copA(Besaury et al., 2013).copA编码1种P型ATPase(Dávila et al., 2012), 其形成有助于微生物提高对Cu的耐受性和维持自身稳态的多铜氧化酶(Hall et al., 2008).nccA在各样点之间的分布存在不显著差异(p=0.038), 在样点尾矿坝无检出.pbrT在各样点之间无差异.czcC在各样点之间无差异, 同时在样点草地无检出.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 重金属抗性基因相对丰度 (注：数值为多个重复的平均值, 竖线显示的是标准偏差, 相同字母表明各样点之间差异不显著(p >0.05)) Fig. 4Abundance of heavy metal resistance gene |
3.4 土壤重金属含量与重金属抗性基因的相关性重金属Cd、Cu、As、Zn之间相关性显著, RI指数也与Cd、Cu、As、Zn之间存在显著正相关(p < 0.001), 与Ni、Cr之间存在显著负相关(p < 0.01).同时copA与重金属Cd、Cu、As、Zn之间存在显著正相关(p < 0.05)(图6), 除copA外的其他MRGs与重金属含量之间无显著相关性.但通过皮尔森相关性(图 5)分析可知, 重金属与大多数MRGs之间不存在显著相关性, 说明土壤中MRGs的丰度并不只是受重金属含量的影响.czcC与chrB基因之间存在显著正相关(p < 0.001), 这是由于czcC、chrB同时存在于同一质粒或转座子上, 具有高度同源性, 参与基因水平转移(Abou-shanab et al., 2007；周围等, 2008).16S rRNA与arsB、Cd、Cu、Zn之间存在显著负相关(p < 0.05).
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 各因子之间相关性分析 Fig. 5Correlation analysis between factors |
As是有名的有毒非金属, 一旦正常环境受到As污染, 微生物介导的As代谢将增加As的流动性、生物利用性和毒性, 并且可能由于生物可利用的As直接暴露于环境中而对人类产生健康危害(Cai et al., 2013).相关分析表明, As抗性基因丰度与As含量相关性不显著(p>0.05).有研究证明, 从低As含量土壤(12.2 mg·kg-1)获得的砷代谢细菌和arsB / ACR3的多样性高于As含量高的污染土壤(135 mg ·kg-1), 这是由于高水平的金属污染物具有极强的选择压力, 从而降低了土壤中微生物整体多样性(Achour et al., 2007).也有研究表明, 高度As污染的土壤(337.2 mg·kg-1)中As抗性基因的丰度显示出比As污染较少的土壤(24.1~72.1 mg·kg-1)中更高的多样性(Cai et al., 2009).
4 结论(Conclusions)1) 刁泉铜尾矿区周围土壤重金属污染问题严重, 其中As、Cd、Cu、Pb超过了国家土壤三级标准, Zn、Cr、Ni未超过国家土壤三级标准, 但这7种重金属含量均超过山西土壤环境土壤背景值.
2) 通过对土壤重金属潜在生态风险评价得出, Cd的潜在污染风险参数最高, 是最主要的潜在生态风险因子, 其次是Pb和Cu.4个采样点都处在不同程度的潜在生态风险中, 其中2个超过600, 具有极高的潜在生态风险指数.
3) 不同抗性基因诱导产生不同的抗性机制.copA在草地样点的相对丰度达到最大值, 这与Cu含量在草地样点最大的情况是一致的；而arsB、arsC虽然是丰度较高的MRGs, 但其相对丰度则与As的含量没有显著相关性.
4) MGRs的丰度模式表明了在污染场地中微生物群落对重金属污染的抵抗力强弱, 本研究中重金属抗性基因的丰度模式同重金属的空间分异之间没有明确的关系, 说明影响MRGs空间分布的因素有很多, 除重金属的浓度外还需要参考别的因素.
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