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--> --> --> 目前，废水的脱氮除磷是解决环境水体富营养化问题的关键[1]。污水处理厂中氮元素的脱除主要是基于好氧硝化和缺氧反硝化的生物脱氮工艺。20世纪90年代，MULDER等[2]发现一种新型的厌氧氨氧化细菌，该菌在厌氧条件下以亚硝酸盐(反应器运行方式分为连续式与间歇式2种。已有研究[10]表明，运行方式影响倒置A2/O工艺启动性能，间歇换水培养方式缩短启动时间，使污泥更快成熟，在脱氮除磷方面先达到最佳去除速率。JI等[11]和LI等[12]在氮负荷分别为630、104.8 mg·(L·d)?1时采用连续式运行，厌氧氨氧化功能菌丰度分别达到34.6%、40.2%；而DU等[13]和LI等[14]采用间歇式运行，氮负荷分别在100、280 mg·(L·d)?1时，厌氧氨氧化功能菌丰度分别为2.37%、5.01%。通过对比分析发现，连续式运行的厌氧氨氧化菌的相对丰度往往高于间歇式运行；但对于改变运行方式对于厌氧氨氧化菌影响的研究目前鲜有报道，对于厌氧氨氧化过程脱氮性能和菌群结构的影响的研究也不多。
本研究以厌氧移动床生物膜反应器为研究对象，在(25±1) ℃恒温、低基质(TN≤60 mg·L?1)条件下，由连续式运行改为间歇式运行，探究其对Anammox系统脱氮性能的影响，同时应用高通量测序方法分析系统微生物群落结构的变化，为实际污水处理厂的转型提供参考。
1.1. 实验装置
实验采用厌氧移动床生物膜反应器(anaerobic moving bed biofilm reactor，AMBBR)运行Anammox工艺。AMBBR所有部件均由有机玻璃加工而成，内径为15 cm，外径为26 cm，高为80 cm，有效体积为7.2 L。反应器用黑色遮光布覆盖，以避免光照对Anammox菌代谢的影响。反应器内部装有填料(直径为11 mm，体积分数为20%)，作为微生物附着生长的载体。进水pH调节至7.2~7.8。反应器的外部为恒温水浴层，控制反应器温度为(25±1) ℃(图1)。
实验分为2个阶段：阶段1(0~39 d)采用连续式运行，流量为1.25 L·h?1，HRT为5.76 h；阶段2(40~110 d)采用间歇式运行，1个周期为3 h，进水45 min，厌氧混合105 min，沉淀15 min，出水13 min，闲置2 min。2个阶段的容积交换率均为55%。
1.2. 接种污泥和模拟废水
反应器接种的污泥来自于长期运行的Anammox厌氧移动床生物膜反应器(AMBBR)，该反应器在25 ℃下运行超过300 d。实验使用的模拟废水为人工配制，其组成为：KHCO3 120 mg·L?1，K2CO3 27.5 mg·L?1，KH2PO4 126 mg·L?1，NH4Cl 91.7 mg·L?1，NaNO2153.8 mg·L?1，葡萄糖和淀粉各50 mg·L?1(少量有机物可以去除厌氧氨氧化产生的硝酸氮，提高总氮脱除率[15])；微量元素I和II各1 mL·L?1。微量元素浓缩液I组分为FeSO4·7H2O 9 000 mg·L?1，EDTA-Na 5 000 mg·L?1；微量元素浓缩液II组分为CoCl2·6H2O 400 mg·L?1，NiCl2·6H2O 810 mg·L?1，Na2MoO4·2H2O 250 mg·L?1，ZnCl2 210 mg·L?1，MnCl2·4H2O 360 mg·L?1。
1.3. 实验方法
水样经0.45 μm滤膜过滤后测定。水样COD经快速消解仪(5B-1B型)消解后，采用重铬酸钾法测定，pH采用雷磁PHS-3E型pH计测定，实验中所采用的污泥来自于2个阶段前后悬浮和附着2部分的污泥(第2天和第107天)，一共4个样品，采样离心后，统一保存于?20 ℃冰箱中。从接种物和操作阶段结束时的污泥样品中提取DNA，用于PCR扩增，使用引物341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC[16]，委托上海生物工程有限公司完成测序。
1.4. 数据分析
厌氧氨氧化和反硝化的占比可以使用方程式[17]计算(式(1)和式(2))，平均进水氮负荷、总氮变化量、总氮的平均去除率和平均氮去除速率使用方程式[14]计算(式(3)~式(6))，功能基因的相对变化量使用方程式计算(见式(7))。式中：u1为厌氧氨氧化比例；u2为反硝化比例；C1为进水氨氮浓度；C2为出水氨氮浓度；C3为进水总氮浓度；C4为出水总氮浓度；L为平均进水氮负荷；Vin为单位时间进水量；Vw为工作体积；T为单位时间；ΔC为总氮变化量；E为总氮的平均去除率；R1为平均氮去除速率；R为功能基因相对变化率；ΔA为功能基因相对丰度变化量；A为连续运行时功能基因的相对丰度。
2.1. 连续运行和间歇运行下反应器的脱氮性能
通过蠕动泵将模拟废水加入反应器中，并控制改变运行方式前后的进水水质参数、日处理水量和反应器有效工作体积不变的条件下，保证平均进水氮负荷、水力停留时间分别为(227±13) mg·(L·d)?1和5.76 h。不同阶段反应器除氮性能如图2所示。
在阶段I(1~39 d)，反应器在室温(25±1) ℃下连续运行，出水氨、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮平均浓度分别为5.6、6.4和2.12 mg·L?1；铵、亚硝酸盐和总氮的平均去除率分别为76.7%、79.3%和74.3%，平均氮去除速率为(166±20) mg·(L·d)?1。在此阶段，测定的
在阶段II(39~110 d)，将反应器从连续式运行改成间歇式运行，容积交换率为0.55，其他操作参数负荷与阶段I保持一致。结果表明，Anammox-SBR系统的脱氮性能逐步上升。在39~63 d，平均氮去除速率和平均总氮去除率约为189.1 mg·(L·d)?1和81.8%(图2(b))，至65 d达到最高，为220.3 mg·(L·d)?1和92.5%(图2(b))，其氨氮、亚硝氮及硝酸盐出水浓度分别为1.25、0.33和2.68 mg·L?1。在64~107 d，平均氮去除速率和平均总氮去除率约为210.4 mg·(L·d)?1和93.6%(图2(b))，此时硝酸盐氮理论产生量(
阶段II测定的化学计量系数(?NO2-N/?
2.2. 微生物群落分析
连续式和间歇式运行共产生了275 797个有效序列，其附属于2 770个OTU(3%差异)，398个属和17个门。OTU数量和ACE指数表明，在不同的运行方式下，生物膜具有更高的群落丰富度。Simpson指数反映了活性污泥微生物群落多样性(表1)。Simpson指数越高，意味着微生物菌种多样性越低，在不同的运行方式下，悬浮污泥Simpson指数均高于生物膜样品。生物膜样品微生物菌种多样性较高，这与WANG等[22]研究结果一致，其原因是生物膜的形成有利于增加对环境压力的抵抗力。但是，改变运行方式后，悬浮污泥Simpson指数升高，而生物膜Simpson指数却出现下降。这可能是由于改变运行方式后，装置内部污泥量基本不变，但COD去除负荷增加，导致异养菌生长速率提高，污泥产量升高[23]，进而将一些生长速率较慢的细菌洗脱，导致悬浮污泥多样性降低；而填料对于活性污泥有一定的截留作用，故生物膜污泥的多样性变化不大，甚至多样性升高。在门水平上(图4)，最丰富的门是Proteobacteria，其次是Chloroflexi、Bacteroidetes、Planctomycetes和Acidobacteria，这与大多数研究结果[24-27]一致。与连续运行相比，间歇运行时，Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria的比例同时下降，具有厌氧氨氧化作用的Planctomycetes在附着污泥上相对丰度也出现明显的降低；而Proteobacteria、Ignavibacteriae和Candidatus Saccharibacteria出现了不同程度的上升。这些结果表明，改变运行方式会影响细菌群落的组成。
在厌氧氨氧化过程中，迄今已鉴定出5种厌氧氨氧化菌属，包括Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia、Candidatus Scalindua、Candidatus Anammoxoglobus和Candidatus Jettenia[28]。 在本研究中，Candidatus Brocadia是厌氧氨氧化反应器中唯一的厌氧氨氧化菌属(图5)，与大多数研究[11, 18, 29]相似。
改变运行方式后，作为厌氧氨氧化反应的功能菌Candidatus Brocadia丰度出现明显下降(图5)。推测其原因，可能是：在运行方式改变后，装置内部污泥量基本不变，但在COD去除负荷增加时，异养菌生长速率提高，导致污泥产量增加[23]，从而使悬浮污泥中的Candidatus Brocadia丰度降低；同时生物膜Candidatus Brocadia丰度下降，可能是由于细胞微聚集体的Longilinea属[30]丰度下降而导致的。此外还发现，在2种不同的运行方式下，生物膜上的Candidatus Brocadia丰度高于悬浮污泥，这与LAURENI等[31]和LIU等[9]的研究结果一致。LIU等[9]认为，生长速率缓慢的微生物在废水处理系统中倾向于附着生长或形成簇，从而能承受更高的冲击负荷，并防止它们被流出物洗脱。
改变运行方式后，检测到Rhodobacter、Aquimonas、Denitratisoma、Haliscomenobacter、Terrimonas、Blastocatella[9, 18, 32-33]，这些具有全程反硝化作用的菌属丰度出现不同程度降低。同时，Defluviimonas、Shinella、Paracoccus这几种具有全程反硝化作用的菌属丰度有所上升，其中具有部分反硝化作用的Pseudomonas丰度出现明显提高(生物膜11.5%，悬浮污泥42.3%)[18]，因此，在间歇运行时，出水硝酸氮浓度明显降低。高通量检测结果还显示，反应器中存在少量能将氨氮氧化成亚硝酸氮的细菌(Chryseobacterium，Devosia，Chryseobacterium[34])以及能将亚硝酸氮氧化成为硝酸氮的细菌(Devosia[35])。这些好氧菌的存在可能是由于反应器上部有少量的空气，在搅拌时，反应体系有一个复氧的过程，这为好氧菌提供了一定的生存空间。此外，反应器中存在少量不具备脱氮作用的细菌。Saccharibacteria_genera_incertae_sedis属于Candidatus Saccharibacteria门，它们广泛分布于环境中[36]。Gemmobacter属包含兼性厌氧菌和异养细菌，它们可以促进大分子碳源的降解并转化为小分子碳化合物[37-38]，具有降解有机化合物的能力，如糖、丙酮酸、甲醇、乙醇和酸[39]。这些好氧与异养菌的存在，消耗了反应器中存在的少量溶解氧和有机物，为厌氧氨氧化菌创造了有利的生存环境。
2.3. 反应器的微生物功能预测
为深入了解改变运行方式后细菌微生物群的分子功能，对16S rRNA扩增子测序结果进行功能预测。基于COGs数据库，预测功能基因相对变化率，结果如图6所示。可以看出，改变运行方式后，RNA加工和修饰、碳水化合物的转运和代谢的功能基因下降，细胞外结构功能基因在悬浮污泥中出现下降而在生物膜当中出现明显上升；同时发现，细胞骨架的功能基因在悬浮污泥中出现上升而在生物膜当中出现明显下降，这与能形成细胞骨架的Longilinea属丰度降低的结论一致。而碳水化合物的转运和代谢的功能基因下降似乎与第1阶段中COD的去除负荷较低相悖，分析其原因，可能是因为连续运行时，系统COD长期处于一个较低的浓度，在这种“饥饿”的情况下，某些细菌须表达尽可能多的碳水化合物的转运和代谢的功能基因，摄取环境中的COD，来维持自身生长代谢需要。
2)在适量有机物的条件下，间歇式运行使具有厌氧氨氧化作用的Candidatus Brocadia菌丰度降低。
3)在连续式和间歇式运行方式下，生物膜上的Candidatus Brocadia菌丰度高于悬浮污泥。
参考文献
