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--> --> --> 由工农业活动产生的重金属污染有着严重威胁人类及动物的生存的毒性作用以及难以修复去除的问题[1]。在众多的重金属污染修复技术中，生物修复技术与物理化学方法相比，具有成本低、无二次污染，对低浓度金属效率更高等优点[2-4]，基于生物矿化的微生物诱导碳酸盐沉淀(MICP)修复重金属的技术已成为当前国内外研究的热点[5-7]。产脲酶微生物能够分泌水解底物尿素的脲酶并在随后的矿化体系中固化重金属离子生成不可溶性碳酸盐，游离态Cd2+能够与脲酶水解底物尿素的产物CO32-形成CdCO3不溶晶体沉淀，从而达到去除镉污染的目的[8]。
在碱性条件下，CO32-与Ca2+形成CaCO3，生物矿化产物CaCO3能够吸附溶液中金属离子并将金属离子固定在其晶体结构中[9]，生物矿化过程中微生物分泌的有机物与无机物之间相互作用形成复杂结构的矿物，微生物分泌的有机物质严格控制着无机相的结晶[10]。与无机矿物相比，生物矿物通常具有独特的特性，包括独特的尺寸，结晶度，同位素和微量元素组成[11-12]。成亮等[13]研究发现，细菌体作为异相成核点加速结晶过程，细菌分泌物调控球形碳酸钙的产生，且随着相互间作用程度的增加，球状碳酸钙不规整表面逐步转变为光滑表面。大部分研究者都是采用单一培养矿化去除重金属污染，王瑞兴等[14]发现，产脲酶菌在弱碱条件下可以使Cd2+形成碳酸盐，从而达到固结去除重金属污染的目的。许燕波等[15]利用一株高效产脲酶菌在对Cd污染的土壤进行修复后，使游离态的Cd2+去除率达51%。目前国内外多数研究都以高效产脲酶菌为对象，研究其对重金属的去除效果，但是对MICP技术的矿化产物形成的机理方面研究仍存在不足[16-17]。虽然重金属和产脲酶菌之间的相互作用引起了人们的广泛关注，但是金属污染环境对混合细菌生长的影响仍然很明显。KANG等[18]在研究中发现，混合培养相较于单个细菌具有较好的细菌生长趋势、脲酶活性、以及重金属耐受性，但是未针对细菌的矿化产物进行具体的表征分析。微生物的多样性直接决定着系统的稳定性，可以有效的对多种微生物进行混合培养并将其运用在实际应用中[19]。
本研究运用碳酸盐矿化菌的MICP修复技术，固化重金属，使其形成不溶性的碳酸盐态从而降低其迁移性和生物毒性[20]。通过XRD，SEM等技术对高效产脲酶菌矿化去除重金属Cd以及CdCO3和CaCO3形成共沉淀的机理进行了探究，并研究了混合培养细菌在环境上的应用。
1.1. 实验原料
酵母浸膏、蛋白胨均为生物试剂; 氯化钠(NaCl)、尿素(CH4N2O)、甲苯(C7H8)、一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、苯酚(C6H6O)、乙醇(CH3CH2OH)、硫酸铵((NH4)2SO4)、2.5水合氯化镉(CdCl2·2.5H2O)、无水氯化钙(CaCl2)、对二甲氨基苯甲醛((CH3)2NC6H4CHO)均为分析纯; 溴化钾(KBr)为光谱级; 次氯酸钠(NaClO)为化学纯。1.2. 实验装置
火焰原子分光光度计(novAA300，德国耶拿分析仪器股份公司); (FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司); X-射线衍射仪(D-MAX2500，日本理学); FTIR(Nicolt A vatar 370 is10，美国尼高力仪器公司); 扫描电子显微镜和X射线能谱谱仪(JSM-6360 LA，日本电子株式会社); 激光粒度分布仪(BT-9300S，丹东百特仪器有限公司); 超净工作台(SW-CJ-1B，上海苏净实业有限公司); 压力蒸汽灭菌锅(DSX-280A，上海申安医疗器械厂); 恒温振荡摇床(DHZ-032R，上海博彩生物科技有限公司); pH计(PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)。紫外可见分光光度计(T6新世纪，济南思卓医疗器械有限公司)。1.3. 菌株筛选
从安徽铜陵狮子山矿山不同功能区域随机采集了5份重金属污染土壤样本，土壤样品(pH为5.6)充分混合后的特性和金属浓度：Pb 46.70 mg·kg-1，Zn 180.10 mg·kg-1，Cu 450.20 mg·kg-1，Cd 5.27 mg·kg-1。LB培养基(pH=7±0.2)成分：5.0 g·L-1酵母浸膏、10.0 g·L-1蛋白胨，5.0 g·L-1 NaCl，1 000 mL去离子水。产脲酶菌株用无菌水连续稀释1 g土壤样品来分离得到，将土壤悬液涂布在尿素酶实验琼脂培养基上(含尿素60 g·L-1，酚酞30 mL·L-1的LB培养基)，在37 ℃条件下，培养48 h，挑选使培养基的颜色从黄色变为粉红色的菌落并通过重复画线进行纯化。Cd耐受菌株复筛，通过稀释涂布平板法来确定。将筛选得到的产脲酶菌株的对数期培养物接种到含Cd的LB琼脂平板上，并不断增加金属离子浓度(25~400 mg·L-1)，将划线培养基置于37 ℃下恒温培养，并观察细菌的生长情况。完全抑制细菌生长的金属最低浓度被认为是最小抑制浓度。
挑选2株经过16S rDNA序列测定的不同种属的高效产脲酶和高金属耐受性的菌株，分别命名为CZW-1和CZW-3。将实验分为3组：CZW-1为A组，CZW-3为B组，CZW-1、CZW-3共培养为C组。将分离得到的2株菌从LB斜面培养基上接种到经过灭菌的100 mL LB培养基中，置于37 ℃，在170 r·min-1的恒温摇床中过夜培养，并用于后续实验。
1.4. 细菌酶活性测量
菌株分泌的脲酶能将尿素分解为NH4+，可以通过测量培养液中的氨氮含量来测定脲酶活性强弱，脲酶活性测量采用苯酚钠-次氯酸钠比色法[21-22]。1.5. 菌株矿化Cd2+实验
取pH为7.0±0.2的LB培养基75 mL分装于3只锥形瓶中，紧接着在121 ℃下灭菌20 min，A、B组冷却后接种5 mL OD600=1.0的处于对数期的菌液，C组接种5 mL OD600=1.0的A、B菌株按体积比1:1混合后且处于对数期的菌液，并分别向培养液中补加经抽滤灭菌的5 mmol·L-1 CdCl2·2.5H2O、10 g·L-1的尿素和100 mmol·L-1 CaCl2溶液20 mL，置于37 ℃、170 r·min-1下培养48 h，且在一定的时间间隔内取样测定溶液中Cd2+浓度、溶液pH、尿素浓度和OD600。测定溶液中Cd2+浓度方法：取一定体积样品在8 000 r·min-1条件下离心5 min，取上清液并运用火焰原子分光光度计测定。
测定尿素浓度方法：二甲氨基苯甲醛显色分光光度法[23]。
1.6. 分析方法
采用X-射线衍射仪对沉淀物的矿物成分进行分析; 采用FT-IR对沉淀样品中的官能团进行分析; 采用扫描电子显微镜和X射线能谱仪对矿物沉淀的结构形态、沉淀元素成分进行观察和分析; 采用激光粒度分布仪[24]对矿化产物的粒度进行分析。2.1. Cd2+耐受性及酶活性分析
不同的微生物具有不同的脲酶活性以及重金属耐受能力，3组细菌对Cd2+的耐受能力以及脲酶活性结果如图 1所示。A、B、C组实验脲酶活性分别为17.09、18.23、20.79 U·mL-1，菌株混合培养的C组脲酶活性高于单一培养的A、B组。环境中不同菌株之间会存在协同或者抑制作用，混合菌株能表现出更佳的脲酶活性以及重金属耐受性[18]。
2.2. 矿化Cd2+过程
3组实验下的细菌浓度OD600、尿素水解率、溶液pH和Cd2+去除率在48 h内的变化见图 2。从图 2(a)中可以看出，在0~24 h内，3组细菌大量繁殖，并达到稳定状态，C组混合培养的细菌浓度OD600高于另外2组，这表明混合培养有利于细菌生长。从图 2(b)中可以看出，在此过程中，随着细菌大量分泌出脲酶，脲酶水解尿素，3组细菌在48 h内对尿素的水解率分别为78.15%、80.32%、85.50%。结合图 2(a)、图 2(b)可以看出，混合培养细菌在细菌浓度和脲酶活性上都要比单一培养细菌的高，在KATIE等[25]的研究中发现了相同的结果。从图 2(c)中可以看到，48 h内培养液pH的差异变化，A组pH从6.47增长至8.36;B组从6.46增长至8.35;C组pH从6.49增长至8.41。这是因为脲酶水解尿素产生CO32-和NH4+，NH4+发生水解并导致pH上升，随着营养物质的消耗和细菌的衰亡，3组的pH最终均趋于稳定[26]。从图 2(c)中可见，3组实验的pH增长范围基本无差异，混合培养C组的pH增长速度会快于单一培养的A组和B组。本研究中3组实验的pH变化趋势在TOBLER等[27]的研究中也有提及。细菌对Cd2+去除率的结果见图 2(d)，在0~24 h内，细菌对Cd2+的去除率急剧上升，原因是在这期间细菌大量生长繁殖并且分泌大量脲酶，底物尿素大量水解为CO32-，从而导致Cd2+去除率快速增加。在24~36 h内，细菌Cd2+去除率缓慢增长直至趋于稳定，A、B、C组的去除率分别为75.95%、77.07%、80.09%，其原因是，在24~36 h内，细菌逐渐开始衰亡，溶液中的CO32-也被逐渐消耗殆尽。B组Cd2+去除率略微高于A组，其原因是B组菌株的脲酶活性高于A组菌株; C组混合菌株对Cd2+去除率明显高于A组和B组，这是由于C组混合菌株表现出更高的Cd2+耐受性和脲酶活性，在LI等[28]的研究中发现，混合培养的菌株比单一培养的菌株更能在恶劣的环境下存活。成亮等[8]筛选出碳酸盐矿化菌株，利用其矿化固结重金属Cd2+，可明显降低有效态重金属含量。KANG等[18]利用从废弃的矿土堆里筛选出的4种碳酸盐菌株矿化去除重金属，发现菌株混合会有更好的协同效果，并且混合菌株对重金属有很高的去除率。张宇楠等[29]探讨了混合菌对重金属的形态及生物有效性的影响，结果发现混合菌能有效的促进游离态的重金属离子转化为碳酸盐稳定态和有机结合态，并能显著性的降低重金属离子的迁移性和生物利用度。将细菌进行混合培养时，培养基中的细菌会分泌某种蛋白物质，其可以被看做是一种对其他细菌的生长和功能起着促进作用的传递信息，通过混合培养能达到提高产酶的目的。
2.3. 矿化产物XRD分析
图 3为3组矿化产物的XRD图谱。可以看出，A、B、C组的矿化产物均是由CdCO3和CaCO3组成的。细菌产生脲酶将尿素分解产生NH4+和CO32-，CO32-与周围的Ca2+、Cd2+结合，形成不溶于水的碳酸盐固体沉淀。从图 3可以看出，单一培养和混合培养细菌的矿化产物的XRD谱图峰值不同，3组产物CdCO3峰强度为A组 < B组 < C组。这表明，C组矿化产物结晶度会明显高于A组和B组的产物，这是因为吸收峰越尖锐，说明矿化产物结晶度越好。Ca2+和Cd2+共沉淀的现象与王继勇等[30]的实验结果一致。3组矿化产物中A组和B组的CaCO3和CdCO3吸收峰峰值强度无明显差异，但是C组相较于A组和B组的CaCO3峰值强度较弱，也有可能是混合培养的菌株在矿化去除Cd2+时对Cd2+具有优先性，从而导致沉淀中CaCO3含量偏低。在相同的条件下，CaCO3的溶度积会比CdCO3的溶度积大，在重结晶时可以在CaCO3表面形成Cd-Ca的固溶体[31]。
2.4. 矿化产物的SEM和EDS分析
图 4为3组实验矿化产物的SEM分析结果。从图 4中可以看出，3组实验的矿化产物的形貌为椭球型颗粒状的CdCO3和CaCO3，且A组和B组矿化产物的直径约为2 μm，C组矿化产物的直径约为3 μm，C组矿化产物直径略微大于A组和B组矿化产物，并且C组矿化产物的表面相较于A组和B组矿化产物分布更加均匀，这表明C组在菌株混合条件下会更加有利于晶体的形成。微生物控制着细菌活动过程中的矿化过程，从而控制矿物的成核和生长[32]。图 4(b)、图 4(d)、图 4(f)是图 4(a)、图 4(c)、图 4(e)矿化产物的局部电镜图，由此可以看出，Cd2+与Ca2+以晶格掺杂的方式形成了共沉淀，不同于其他研究中的CdCO3或CaCO3晶体的形貌[5, 33]。这是由于在细菌表面的脲酶水解尿素形成CO32-，矿化产物的结晶均沿着细胞壁上的结合位点展开，形成CdCO3和CaCO3晶体互相掺杂，形成矿化产物的过程中，细菌对Cd2+、Ca2+都进行矿化去除，从而导致金属离子结合位点相邻、相对和重叠[26]。C组实验产物相较于A组和B组实验产物具有较好的结晶度和晶格掺杂形貌。这是由于混合培养细菌具有较强的脲酶活性，导致细胞表面的pH和CO32-浓度相对稳定和充足，从而减少了在形成CdCO3和CaCO3晶体互相掺杂过程中的团聚现象。采用EDS分析3组矿化产物中的元素成分百分比，结果如表 1所示。在3组矿化产物中Ca含量分别为2.04%、2.87%、1.04%，Cd含量分别为25.85%、28.41%、30.13%，这表明Cd含量远高于Ca，因为Cd的离子半径大于Ca的离子半径，并且Cd在细菌表面拥有更对的结合位点，从而导致3组矿化产物中Cd含量均高于Ca。C组产物的中Cd与Ca含量比例约为29:1，远高于A组和B组矿化产物，这是由于细菌与矿物之间存在着相互作用[34]，并且混合培养细菌拥有更多的Cd结合位点，更加有利于矿化去除Cd2+。
2.5. 矿化产物FT-IR分析
图 5为3组实验矿化产物的FT-IR分析结果。通过傅里叶变换红外光谱分析，可以确定微生物矿化沉淀的主要官能团。CO32-在红外区的吸收频率由1 530~320 cm-1强吸收峰、1 100~1 040 cm-1弱吸收峰、890~800 cm-1以及745~670 cm-1的弱吸收峰组成。3 400 cm-1附近的吸收峰为O—H和N—H键的伸缩振动峰; 1 637 cm-1附近是结晶水的吸收峰[35]。在1 637 cm-1和1 044 cm-1处的吸收峰主要是蛋白酰胺Ⅰ带和Ⅱ带的C＝O基的伸缩振动吸收峰; 1 380 cm-1和856 cm-1处吸收峰为矿化产物中CdCO3和CaCO3沉淀中C—O基团的弯曲振动吸收峰，719 cm-1和550 cm-1处主要为Cd—O和Ca—O共价键的振动吸收峰[36]。FT-IR分析结果与XRD分析结果一致，表明矿化产物为碳酸盐。在1 380 cm-1和856 cm-1处出现的尖锐吸收峰为碳酸根的吸收峰，而3组矿物样品的吸收峰强度为C组 > B组 > A组; 从而导致矿物的结晶度大小顺序为C组 > B组 > A组。这正好与图 3矿化沉淀XRD中产物的结晶度变化一致。C组矿化产物的CO32-、Ca—O等官能团的吸收峰明显强于A、B组，透过率明显降低，这也能说明混合培养细菌的矿化产物中CdCO3和CaCO3的含量较高。
2.6. 矿化产物粒度分析
图 6为3组实验矿化产物的粒径分布图，A、B、C组矿化产物的平均粒径分别为9.37、16.57、13.55 μm，B组和C组的矿化产物平均直径明显大于A组，这是由于脲酶活性的差异会导致沉淀晶体形状以及平均粒径大小出现差异[37]。B组产物的粒度略微大于C组，但是C组的矿化产物粒度分布相较于A组和B矿化产物更加集中，矿化产物的大小分布比较均匀。结合图 5可知，C组混合培养下的矿化产物结晶度和晶形更好。成艳等[38]在利用碳酸盐矿化菌矿化Pb2+实验中发现，反应条件会直接决定产物的粒度，这也能说明混合培养比单一培养进行矿化沉淀的条件更好，更加有利于晶体增长。
2) 在矿化去除Cd2+过程中，混合培养细菌相比于单一培养具有较高的脲酶活性、Cd2+耐受性和Cd2+去除率。
3) XRD、FT-IR、SEM和EDS分析，发现3组实验的产物主要为CdCO3和CaCO3，并且C组产物具有较好的结晶度和晶格掺杂形貌; 通过粒度分析，发现C组混合培养产物的大小分布比较均匀; 菌株矿化Cd2+实验表明，混合培养细菌对重金属Cd污染的修复效果要比单一细菌好。
参考文献
