周利, 徐莉, 邵汝升, 王占强
沧州市中心医院, 河北 沧州 061000
2020-11-15 收稿, 2021-03-02 录用
^*通讯作者: 周利

摘要: 本研究选取了112例急性缺血性脑卒中（AIS）患者作为观察组，另选取112例健康体检者作为对照组。用彩色多普勒超声检测所有对象的颈动脉，并对血清miR-128b、miR-146a水平进行测定，结果发现观察组颈内动脉收缩期峰值血流速度（PSV）、miR-146a低于对照组，舒张末期血流速度（EDV）、颈动脉内膜中层厚度（IMT）、miR-128b高于对照组（P < 0.05）。颈动脉超声定量参数与两种血清生物标志物联合诊断AIS的AUC为0.898，大于任一单一指标；PSV、EDV、IMT、miR-128b、miR-146a与AIS患者预后（mRs评分）显著相关（P < 0.05）。颈动脉超声定量参数与两种血清生物标志物联合预测AIS患者预后敏感度达71.43%，特异度达90.48%。颈动脉超声定量参数、血清miR-128b、miR-146a在诊断AIS及预测预后方面具有较高应用价值。
关键词: 急性缺血性脑卒中颈动脉超声定量参数miR-128bmiR-146a改良Rankin量表预后诊断流程图
The Diagnostic Value of Carotid Ultrasound Quantitative Parameters Combined with Serum miR-128b and miR-146a in Acute Ischemic Stroke and the Significance of Prognostic Evaluation
ZHOU Li, XU Li, SHAO Rusheng, WANG Zhanqiang
Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061000, Hebei, P. R. China
^*Corresponding author: ZHOU Li
Abstract: In this study, 112 patients with acute ischemic stroke (AIS) were selected as the observation group, and 112 healthy patients were selected as the control group. The carotid ultrasound quantitative parameters were obtained, as well as the levels of miR-128b and miR-146a in serum. The results showed that the peak systolic velocity (PSV) of the internal carotid artery and miR-146a in the observation group were lower than those in the control group. While the end diastolic velocity (EDV), carotid intima-media thickness (IMT) and miR-128b were higher than those in the control group (P < 0.05). The AUC of combined diagnosis of AIS by carotid ultrasound quantitative parameters and serum miR-128b and miR-146a was 0.898, which was higher than any single index. PSV, EDV, IMT, miR-128b, miR-146a were significantly correlated with the prognosis (mRs score) of AIS patients (P < 0.05). The sensitivity of carotid ultrasound quantitative parameters and serum miR-128b and miR-146a in predicting the prognosis of AIS patients was 71.43%, and the specificity was 90.48%. Therefore, it is considered that the quantitative parameters of 401 carotid ultrasound and serum miR-128b and miR-146a have high application value in the diagnosis of AIS and in the prediction of prognosis.
Key words: acute ischemic strokequantitative parameters of carotid artery ultrasoundmiR-128bmiR-146amodified Rankin scaleprognosisdiagnosis flowchart
急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)在我国为致残率、病死率、死亡率较高的疾病，占缺血性脑血管疾病的70%^{[1, 2]}。流行病学调查数据显示，平均每4 min有1人因缺血性脑血管疾病死亡，因此早期诊断、治疗AIS已成为脑血管领域研究重点^{[3, 4]}。童陶然等^[5]研究指出，颈动脉超声定量参数可更准确地定性判断AIS斑块及其定位情况，预测病情严重程度。除常规临床检查和影像学数据外，血清生物标志物被认为是对缺血性脑血管疾病具有较高价值的辅助检查手段。miRNAs为天然存在的短链非编码RNAs，可广泛调节基因表达，在各种生物功能中发挥重要作用，其中，miR-146a表达量同脑梗死体积、神经缺损情况相关^[6]；血清miR-128b表达与脑梗死严重程度呈正相关，且同预后存在密切联系^[7]。目前，颈动脉超声联合血清miRNAs在AIS诊断及预后评估方面的相关报道较少见，本研究分析了颈动脉超声定量参数联合血清miR-128b、miR-146a对AIS的诊断价值及预后评价意义。
1 资料与方法1.1 一般资料及选取标准选取2019年7月~2020年6月我院112例AIS患者作为观察组，另选取112例健康体检者作为对照组。纳入标准：所有研究对象符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》^[8]诊断标准；均行PCI术；首次发病；本研究经我院医学伦理委员会批准，入组者均为自愿参加。排除标准：严重精神性疾病或认知异常，无法配合检查者；伴有代谢性疾病；先天性凝血功能紊乱；住院治疗期间死亡；超声检查禁忌者；有多器官功能障碍；伴全身性感染者；预后随访失联。
1.2 方法1.2.1 资料收集收集入组研究对象的性别、年龄、体质量指数、发病至入院时间、吸烟、饮酒、合并症(高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、心房颤动)情况等一般临床资料。
1.2.2 血液样本采集观察组于入院后第1天清晨、对照组于体检当天抽取空腹静脉血5 mL，采用离心机以转速3000~3500 r/min、半径8 cm离心分离15 min，取上层血清，置入-70 ℃冰箱待检。
1.2.3 血生化指标检测取血清，采用日立7600型生化分析仪，利用酶联免疫比色法测定患者空腹血糖；采用贝克曼AU5400全自动生化分析仪，进行高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)检测，试剂盒购自中生北控公司。
1.2.4 血清miR-128b、miR-146a水平检测取血清，加入细胞裂解液进行细胞裂解，选用赛默飞世尔中国公司总RNA提取试剂盒，提取血清中总RNA，应用紫外分光光度计(UV)测定总RNA浓度，样品A260/A280≥1.80即为合格。选用赛默飞世尔中国公司反转录试剂盒，进行总RNA反转录，分别得到模板单链cDNA，对cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR试剂盒购自武汉博欧特生物科技有限公司。miR-146a的PCR反应条件为5 min、95 ℃，40 s、95 ℃，20 s、60 ℃，15 s、72 ℃；miR-128b的PCR反应条件为9 min、95 ℃，20 s、95 ℃，10 s、60 ℃，20 s、72 ℃，连续循环40次，利用相对定量(2^-△△Ct)法分别计算血清miR-128b和miR-146a相对表达量。
1.2.5 颈动脉超声检查指导患者取平卧位，选用PHILIP Sie33彩色多普勒超声仪，沿颈部从长轴、短轴两个方向进行颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉等检查，观察有无动脉斑块存在。颈总动脉分叉处IMT不规则增厚＞1.2 mm即为斑块存在，观察斑块形状、大小及位置；指导患者取仰卧位，检测颈内动脉内膜中层厚度(IMT)，观察记录颈内动脉收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张末期血流速度(EDV)。由2名高年资影像科医师共同评价颈动脉斑块，判断斑块内部成分信号变化，以确保检查结果准确性。
1.2.6 NIHSS量表评分标准^[9]观察组入院时均进行NIHSS量表评估，该量表包含凝视、意识、视野、面瘫、语言表达能力、共济失调情况、感觉、构音障碍、视野、忽视征及远端肢体功能11个条目，总分范围0~42分，得分越高，神经缺损越严重。
1.2.7 治疗方法参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》^[8]中有关AIS治疗方案开展治疗。给予观察组改善微循环(丁苯酞)、营养神经(依达拉奉)治疗，同时根据病情给予抗血小板聚集、吸氧、降压、降脂等对症处理。
1.2.8 Rankin修订量表评分^[10]观察组治疗30 d后进行改良Rankin量表(mRS)评分，该量表分值范围0~6分，得分越高，残疾越严重。0分：完全无症状；1分：有症状，但无明显功能障碍；2分：轻度残疾；3分：中度残疾；4分：重度残疾；5分：严重残疾；6分：死亡。其中预后不良指mRS＞2分，预后良好指mRS≤2分。
1.3 观察指标(1) 比较两组入院时颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达；(2)入院时颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达对AIS的诊断价值；(3)比较不同预后患者颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达；(4)偏相关性分析颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a与AIS患者预后的相关性；(5)颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达对AIS患者预后的诊断价值。
1.4 统计学分析采用统计学软件SPSS 19.0处理数据，计数资料以例数描述，组间比较采用卡方检验；计量资料采取Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态分布，以平均数±标准差描述，两组间比较采用独立样本t检验。采用偏相关性分析相关性，预测和诊断效能分析采用受试者工作特征(ROC)曲线，获取曲线下面积、置信区间、敏感度、特异度及cut-off值，不同预测方案间曲线下面积比较采用DeLong检验，联合诊断实施Logistic二元回归拟合，返回预测概率logit(p)，将其作为独立检验变量。均采用双侧检验，α=0.05。
2 结果2.1 两组患者的颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达观察组PSV和miR-146a低于对照组，EDV、IMT、miR-128b高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.005)。见表 1。
表1

表 1 观察组与对照组患者颈动脉超声定量参数、血清指标表达对比 组别 例数 PSV/(cm·s-1) EDV/(cm·s-1) IMT/mm miR-128b miR-146a 观察组 112 47.69±17.41 23.17±6.74 0.95±0.47 2.14±1.02 0.88±0.47 对照组 112 62.45±21.74 15.69±4.12 0.58±0.21 1.12±0.49 1.79±0.85 t 5.608 10.021 7.607 9.539 9.915 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表 1 观察组与对照组患者颈动脉超声定量参数、血清指标表达对比

2.2 颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达对AIS的诊断价值由ROC曲线可得颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达诊断AIS，单一指标EDV的AUC最大为0.841，联合诊断的AUC为0.898，大于任一单一指标。见表 2。
表2

表 2 颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS的诊断价值 指标 AUC 95%CI Z P 截断值 敏感度 特异度 PSV 0.778 0.717~0.839 8.875 ＜0.001 ≤57.25 cm·s-1 76.79% 72.32% EDV 0.828 0.774~0.883 11.896 ＜0.001 ＞20.26 cm·s-1 69.64% 86.61% IMT 0.808 0.752~0.864 10.809 ＜0.001 ＞0.85 mm 64.29% 85.71% miR-128b 0.751 0.687~0.815 7.684 ＜0.001 ＞1.83 63.39% 78.57% miR-146a 0.814 0.757~0.872 10.693 ＜0.001 ≤1.67 92.86% 62.50% 联合诊断 0.898 0.858~0.937 19.792 ＜0.001 77.68% 89.29%

表 2 颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS的诊断价值

2.3 观察组不同预后患者的基线资料、颈动脉超声定量参数、血清miR-128b和miR-146a表达观察组不同预后患者的年龄、发病至入院时间、高血压、糖尿病、心房颤动、入院时NIHSS评分、颈动脉超声定量参数、血清miR-128b、miR-146a相比，差异有统计学意义(P＜0.005)。见表 3。
表3

表 3 观察组不同预后患者的临床资料和各指标对比 指标 预后良好(n=63) 预后不良(n=49) t/χ2 P 性别 ????男 37(58.73%) 29(59.18%) 0.002 0.961 ????女 26(41.27%) 20(40.82%) 年龄 ????＜45岁 38(60.32%) 18(36.73%) 6.132 0.013 ????≥45岁 25(39.68%) 31(63.27%) 体质量指数 ????＜23 kg/m2 41(65.08%) 30(61.22%) 0.177 0.674 ????≥23 kg/m2 22(34.92%) 19(38.78%) 发病至入院时间 ????＜12 h 46(73.02%) 26(53.06%) 4.780 0.029 ????12~24 h 17(26.98%) 23(46.94%) 吸烟 44(69.84%) 28(57.14%) 1.936 0.164 饮酒 18(28.57%) 10(20.41%) 0.980 0.322 合并症 ????高血压 30(47.62%) 38(77.55%) 10.353 0.001 ????糖尿病 23(36.51%) 30(61.22%) 6.755 0.009 ????高脂血症 26(41.27%) 25(51.02%) 1.057 0.304 ????冠心病 14(22.22%) 9(18.37%) 0.251 0.616 ????心房颤动 2(3.17%) 10(20.41%) 8.557 0.003 空腹血糖/(mmol·L-1) 5.69±1.34 5.87±1.52 0.665 0.508 TC/(mmol·L-1) 4.87±1.25 4.52±1.19 1.501 0.136 TG/(mmol·L-1) 2.15±0.68 2.24±0.70 0.686 0.492 HDL-C/(mmol·L-1) 1.47±0.41 1.52±0.45 0.613 0.541 LDL-C/(mmol·L-1) 3.94±1.02 3.56±1.10 1.890 0.061 NIHSS评分/分 9.25±2.14 11.78±3.27 4.934 ＜0.001 颈动脉超声定量参数 ????PSV/(cm·s-1) 51.83±15.41 42.37±10.39 3.692 ＜0.001 ????EDV/(cm·s-1) 20.86±6.47 26.14±7.12 4.100 ＜0.001 ????IMT/mm 0.86±0.35 1.06±0.41 2.783 0.006 miR-128b 1.96±0.61 2.37±0.75 3.190 0.002 miR-146a 0.99±0.32 0.74±0.28 4.329 ＜0.001

表 3 观察组不同预后患者的临床资料和各指标对比

2.4 偏相关性分析将年龄、发病至入院时间、高血压、糖尿病、心房颤动、入院时NIHSS评分等其他因素控制后，通过偏相关性分析，发现PSV、EDV、IMT、miR-128b、miR-146a仍与反映AIS患者预后情况的mRs评分显著相关(P＜0.05)，见表 4。
表4

表 4 偏相关性分析结果 自变量 偏回归系数 标准误差 偏回归系数(标准化) t P 常量 8.746 PSV/(cm·s-1) -0.506 0.011 -0.594 10.125 ＜0.001 EDV/(cm·s-1) 0.547 0.019 0.652 8.745 ＜0.001 IMT/mm 0.523 0.014 0.612 9.564 ＜0.001 miR-128b 0.498 0.009 0.557 10.976 ＜0.001 miR-146a -0.473 0.007 -0.541 11.253 ＜0.001

表 4 偏相关性分析结果

2.5 颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS患者预后的诊断价值由ROC曲线可得颈动脉超声定量参数、血清指标表达联合预测AIS患者预后，敏感度达71.43%，特异度达90.48%，颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS患者预后的诊断价值见表 5。
表5

表 5 颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS患者预后的诊断价值 指标 AUC 95%CI Z P 截断值 敏感度 特异度 PSV 0.799 0.717~0.882 7.105 ＜0.001 ≤46.35 cm·s-1 69.39% 84.13% EDV 0.759 0.667~0.851 5.534 ＜0.001 ＞26.20 cm·s-1 57.14% 88.89% IMT 0.788 0.704~0.871 6.768 ＜0.001 ＞1.13 mm 59.18% 85.71% miR-128b 0.720 0.626~0.815 4.564 ＜0.001 ＞2.01 83.67% 52.38% miR-146a 0.770 0.682~0.858 6.025 ＜0.001 ≤0.71 59.18% 85.71% 联合诊断 0.804 0.765~0.915 8.858 ＜0.001 71.43% 90.48%

表 5 颈动脉超声定量参数、血清指标表达对AIS患者预后的诊断价值

3 讨论颈动脉为颅脑重要供血动脉，动脉粥样硬化所致血流动力学异常、动脉管腔狭窄或闭塞为脑实质缺血性病变重要诱因，有研究发现，每年因有症状和无症状颈动脉粥样硬化而致缺血性脑卒中风险分别为9.2%和1.3%^[11]。颈动脉超声可动态监测颈动脉粥样硬化斑块情况，为临床评估、诊断颈动脉壁病变的有效手段，还具有操作简单、无创等优势，得到临床医师及患者青睐。颈动脉超声定量参数IMT可准确反映颈动脉粥样硬化所致血管壁变化情况，PSV、EDV为颈动脉血流动力学变化有效指标^[12]。本研究发现，观察组PSV低于对照组，EDV、IMT高于对照组，可能与AIS患者颈动脉狭窄程度加重，舒张末期狭窄段形成湍流或涡流，造成流速明显增加有关，血小板聚集引起血管壁脂代谢紊乱，脂质沉积造成颈动脉内膜厚度增加，收缩期正向血流速度降低。本研究结果证实，上述指标与AIS患者预后显著相关，在一定程度上可预测AIS患者临床结局。颈动脉位置表浅，常规检查难以探测其动态变化，颈动脉超声可清晰显示颈动脉纵轴、横轴解剖图像，动态观察斑块大小、形态，根据颈动脉超声参数PSV、EDV、IMT，可以综合评估颈动脉狭窄范围及程度，故对预测AIS患者病情发展具有重要意义^[13]。
miRNA是生物体内广泛存在的一类内源性非编码单链RNA，参与生物体细胞增殖和分化、代谢、凋亡及炎症反应等重要生理过程。既往研究结果显示^[14]，脑梗死后外周血中特定miRNA表达水平变化可反映脑组织中miRNA变化情况，故外周血相关miRNA有望成为脑部缺血性疾病新型生物学标志物。张绍夫等^[15]研究表明，动脉粥样硬化形成过程中，细胞外基质沉淀及炎性因子分泌均与miR-146a水平呈负相关。miR-128b为脑特异性miRNA，外周血中miR-128b水平变化与病情严重程度存在相关性。本研究数据显示，观察组miR-146a低于对照组，miR-128b高于对照组，推测其原因，可能是AIS发生时血脑屏障遭受破坏，脑特异性miR-128b经血脑屏障进入外周血，故其表达水平升高。miR-146a可抑制血管内皮增殖分化，在脑梗死大鼠模型中，大鼠脑部梗死区域血管内皮细胞miR-146a呈低度异常表达，同本研究结果相符^[16]。本研究还发现血清miR-128b、miR-146a表达诊断AIS具有较高敏感度、特异度。上述指标可否用于病情评估还需多中心研究证明，已有研究表明miRNA具有检查方法敏感、不易降解、准确等优点，为临床潜在病情鉴别新型标志物^[17]。动物实验发现^[18]，miRNA参与脑缺血后病理生理过程。陶珍等^[19]研究表明，急性脑梗死患者外周血miR-128b显著升高，且同神经受损呈正相关。可见，miR-128b可用于缺血性脑血管疾病患者病情评估。本研究将上述指标用于预测AIS预后，发现其AUC值均大于0.7，具有良好预测价值。究其原因，有****认为^[20]miR-146a可介导细胞定向转移和趋化性，低度表达的miR-146a可使血管内壁增粗狭窄，使血液黏滞性及凝固性增加，导致机体血液处于高凝状态，诱导病情加重，可能影响疾病预后。
综上可知，AIS患者EDV、IMT、miR-128b呈高表达，PSV、miR-146a呈低表达，上述指标联合检测在诊断AIS及预测预后方面具有良好价值，可为临床病情评估及治疗提供有效参考。

参考文献

[1]	Wahlgren N, Moreira T, Michel P, et al. Mechanical thrombectomy in acute ischemic stroke: consensus statement by ESO-Karolinska stroke update 2014/2015, supported by ESO, ESMINT, ESNR and EAN[J]. International Journal of Stroke, 2016, 11(1): 134-47. DOI:10.1177/1747493015609778
[2]	徐如祥, 赵浩. 急性缺血性脑卒中溶栓治疗展望[J]. 中华神经医学杂志, 2018, 17(2): 114-116. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-8925.2018.02.002
[3]	朱秋艳, 李璟, 曾瀛, 等. 宜春市脑卒中高危人群及其危险因素分布特点[J]. 宜春学院学报, 2018, 40(3): 47-49. DOI:10.3969/j.issn.1671-380X.2018.03.013
[4]	Warner J J, Harrington R A, Sacco R L, et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: 2019 update to the 2018 guidelines for the early management of acute ischemic stroke[J]. Stroke, 2019, 50(12): 3331-3332. DOI:10.1161/STROKEAHA.119.027708
[5]	童陶然, 周菁菁, 曹昌权. 颈动脉超声定量参数结合MRI对急性脑梗死患者的诊断价值[J]. 中国CT和MRI杂志, 2019, 17(7): 29-31, 49. DOI:10.3969/j.issn.1672-5131.2019.07.009
[6]	王凯华. MiR-146b表达水平作为急性缺血性卒中患者血清标志物的临床探索[D]. 桂林: 广西中医药大学, 2018.
[7]	王志, 金庙通, 杨建邦. 脑梗死患者血清miR-181c、miR-128b表达水平及其与90天预后的相关性[J]. 中国动脉硬化杂志, 2019, 27(6): 517-521. DOI:10.3969/j.issn.1007-3949.2019.06.011
[8]	中华医学会神经病学分会, 中华医学会神经病学分会脑血管病学组. 中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018[J]. 中华神经科杂志, 2018, 51(9): 666-682. DOI:10.3760/cma.j.issn.1006-7876.2018.09.004
[9]	陈振翼, 方邦江, 刘月, 等. 急性脑梗死不同中医证型与NIHSS评分时相性演变的相关性研究[J]. 中国中医急症, 2017, 26(7): 1129-1133. DOI:10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.001
[10]	单志斌, 欧鸿儒, 莫家彬, 等. 急性脑梗死溶栓术后脑灌注表现与临床预后相关性研究[J]. 中国医学创新, 2020, 17(8): 124-128.
[11]	郑硕, 张允岭, 孙静宜, 等. 颈动脉粥样硬化与缺血性卒中的关系及中医证候要素演变分析[J]. 世界中医药, 2017, 12(3): 655-660. DOI:10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.045
[12]	Menon B K, Al-Ajlan F S, Najm M, et al. association of clinical, imaging, and thrombus characteristics with recanalization of visible intracranial occlusion in patients with acute ischemic stroke[J]. Journal of the American Medical Association, 2018, 11(10): 1017-1026.
[13]	南格利. 冠心病颈动脉超声参数与斑块稳定性及炎症反应水平相关性分析[J]. 陕西医学杂志, 2020, 49(4): 71-75.
[14]	张钦政, 郑洋洋, 李琪, 等. miRNA表达水平对缺血性脑卒中作用机制的研究进展[J]. 中国现代医生, 2020, 58(2): 189-192.
[15]	张绍夫, 王飞, 李航, 等. 急性缺血性脑卒中患者溶栓后血浆miR-146a、miR-21表达变化及意义[J]. 山东医药, 2019, 59(1): 67-69. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2019.01.020
[16]	刘翀, 梅斌, 扬杰, 等. miR-146a对新生大鼠缺氧缺血性脑病的作用及其机制[J]. 广西医科大学学报, 2020, 37(7): 1220-1227.
[17]	Dewdney B, Trollope A, Moxon J, et al. Circulating microRNAs as biomarkers for acute ischemic stroke: a systematic review[J]. Journal of Stroke & Cerebrovascular Diseases, 2018, 27(3): 522-530.
[18]	王伟. 大鼠MCAO模型缺血半暗带相关未知microRNA鉴定及功能分析[D]. 桂林: 广西医科大学, 2018.
[19]	陶珍, 崔连奇, 高丽, 等. 丹参注射液联合尤瑞克林对急性脑梗死患者血清miR-146a, miR-128b表达的影响[J]. 热带医学杂志, 2020, 20(7): 928-932. DOI:10.3969/j.issn.1672-3619.2020.07.016
[20]	刘明, 付璐璐, 林琳. 脑梗死患者血清miR-146a表达与氧化低密度脂蛋白及疾病严重程度的关系[J]. 河北医药, 2019, 41(6): 831-834.